新たに分離した海洋バクテリオファージの性状

新たに分離した海洋バクテリオファージの性状

著者

日高 富男

雑誌名

鹿児島大学水産学部紀要=Memoirs of Faculty of

Fisheries Kagoshima University

巻

22

号

1

ページ

47-61

別言語のタイトル

Characterization of Marine Bacteriophages

Newly Isolated

Ｍｅｍ,Fac・Fish.,KagoshimaUniv・ Vol､22,No.１，ｐｐ､４７∼6１（1973）

新たに分離した海洋バクテリオファージの‘性状

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4８ _{鹿児島大学水産学部紀要第22巻第１号（1973）} 実験に供した．この時の採取試料およびそれからの分離物にはO7T-の符号を付す．次に1971年 ５月16日，本学練習船、南星丸ミを利用し，鹿児島県佐多岬から東へ20浬沖合（31.00'N-131oO3′ E，深度100ｍ）の海水を採取して実験に供した．この時の採取海水およびそれからの分離物には 15Nーの符号をつける．また1972年５月２０日には，同じくご南星丸ミを利用し，鹿児島湾の湾口 より湾内に向ってＡ，Ｂ，Ｃの三点から海水を採取した．Ａ点は湾口中央，長崎鼻と立目崎をむす ぶ中点（31。０７′N-130o38'E，深度100ｍ）で，Ｂ点は知林島と皆倉をむすぶ中点（31。17'N-130.45′ E，深度125ｍ)，またＣ点は喜入と寺田をむすぶ中点（31.24'N-130o39'E，深度225ｍ）である． それらの採取海水およびそれらからの分離物には25N-の符号を付す．さらに1972年１２月１６日， 種子島の民間船を利用し，種子島浜田漁港から東へ１０浬沖合（30.26'N-131.11'E，深度1,000ｍ） より海水を採取し実験に供した．この採取海水およびそれからの分離物には2ZT-の符号を付して 呼ぶ．海水の採取にあたってはすべてＪ−Ｚ式無菌採水器を用い，水深50ｍ層の海水を無菌的に採 取し，可及的速かに研究室または最寄りの施設に持帰り直ちに分離実験を行なった． 使用培地は海水培地（SeaWaterBroth）や海水寒天培地（SeaWaterAgar）で，その組成は前 報（HIDAKA,1971；日高・藤村，1971a）と同じである．培養温度も前報同様に25。Ｃである． 実験方法海洋細菌の分離法や海洋ファージの検出，分離，増強法，また電子顕微鏡によるファ ージ粒子構造の観察法などは前報（HIDAKA，1971；日高・藤村，1971a）に記載した方法によっ た．供試海洋ファージの安定性-50.Ｃ３０分間の加熱やクロロホルム処理による失活度合一も 前報（日高・藤村，1971ｂ；HIDAKA,1972）同様に検査した． 実 験 結 果 海洋バクテリオファージ系の分離海洋ファージ系を分離するための実験材料を採取したステイ ションをFig.１に示した．図中のステイション１'と２′は前報で報告した０６N−およびＯＸＮ−フ ァージ系を分離した海水の採取点を示すものであり，補足的に付記した．本報における実験材料の 採取点はステイション１∼６であり，採取日時順に番号を付した． 各実験材料中の生菌数は寒天平板塗抹法で算定し，次いで代表的な細菌集落を釣菌単離して，そ れぞれいくつかの純粋培養菌を得た．それら分離細菌を宿主とするようなファージを同じ実験材料 から間接法（集殖法）で検索し，それぞれ幾組かの宿主一ファージ系が検出された．各実験材料の 生菌数，分離菌数，検出された宿主一ファージ系の宿主菌とその菌属名および分離ファージの符 号をまとめたものがTablelである．Tablelに承られるように，０７T一海底堆積泥の細菌数は 104/ｇであり，それから代表菌22株を分離し，それらを宿主とするフアージを検索してO7T-12菌 に感染能をもつファージが１株検出された．そのファージをO7T-12Pと符号する．同様にして各 試料海水の細菌数はほぼ４０∼100/ｍｌの範囲にあったもそれぞれの分離細菌の中で宿主一ファージ 系が認められたのは，１５N−の３株，２５N Ａ−の１株，２５N-B-の３株，２５N-C-の５株と２ZT-の ３株，計16株であった．これらファージ系の宿主菌は後述するように海洋細菌の性質を備えるも のであり，分離ファージ系はすべて海洋ファージ系とみなされる． 宿主細菌の性状宿主細菌の性状検査は標準法（HARRIGANandMcCANcE,1966）で行ない．鑑 別はBERGEY'sManual，７版（BREEDaaZ.,1957）と，SHEwANetaZ.（HENDRIEandSHEwAN,１９６６ ;BAINandSHEwAN,1968）によって要約された鑑別法に従って同定した． 宿主菌16株の一般性状はTable2に示した．供試菌のすべては，グラム染色陰性の運動性をも

日 高 ： 海 洋 フ ァ ー ジ の 性 状 32.Ｎ ３０’ 31.Ｎ ３０’ 30.Ｎ １３０

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＊１：O7Tstation(Depth,230ｍ） ＊２：１５Ｎstation(Depth,100ｍ） ＊３：２５Ｎ一Ａstation(Depth,100ｍ） ＊４：２５Ｎ−Ｂｓｔａｔｉｏｎ(Depth,125ｍ） ＊５：２５Ｎ−Ｃｓｔａｔｉｏｎ(Depth,２２５ｍ） ＊６：２ZTstation(Depth,1000ｍ） 4９ つ棒菌で，海洋細菌の主導菌と目される菌属の性質を備えている．また無機塩要求性による群別法 (HIDAKAandSAKAI,1968）によれば，それらは海洋型菌と好塩型菌に属するものであり，陸棲型 菌は含まれなかった．これらのことから分離ファージ系の宿主菌はいずれも海洋細菌と考えられる． それらの性状からそれぞれ０７T-12,15N-5,15N-12,25N-35と２５N−６９の５株はPse“o77zo刀ａｓ に，２５N−１２，２５N−７３，２ZT−６，２ZT-33と２ZT-36の５株はＶ必加に，１５N-11と２５N-61の２ 株はＦ伽O6acter伽ｚに，２５N−２７と２５N-42の２株はＡＣﾉiｱo"zO6acZerに，２５N ６６と２５N−７０ の２株は此γo''2o刀ａｓに属する菌であった． 分離海洋バクテリオファージの溶原性ここに分離された16株の海洋ファージは，前述のごと 一

１００/ｍｌ２２ 5０ １ ＴａｂｌｅＬＤｅｔａｉｌｓｏｆｔｈｅｍａｒｍｅｐｈａｇｅｓｙstemsnewlyisolated． 25Ｎ−１２（Vib7わｓＰ.） ２５Ｎ−Ａ− ｓｅａｗａｔｅｌ Phagesystemsdetected Phages Hostbacterla O７Ｔ− 104/ｇ ｍａｒｍｅｍｕｄ 2２ １ O７Ｔ−１２（PsPz"/o777o77assp.） O７Ｔ−１２Ｐ l５Ｎ−５Ｐ 15Ｎ−５（PsPzにＩＣ"zo刀ａｓｓｐ.） １５Ｎ− ｓｅａｗａｔｅｌ. 80/ｍｌｌ３０ ３ 15Ｎ−１１（〃”ｏ６ａｃｵ〃た”ｓｐ.） l５Ｎ−１１Ｐ l5N-12P l５Ｎ−ｌ２（Ese“O77zo刀ａｓｓｐ.） 3０ 25Ｎ−１２Ｐ 鹿児島大学水産学部紀要第22巻第１号（1973） く間接法によって分離されたものである．したがって，それらの分離ファージのなかには海水や海 底泥中に遊離していたものばかりでなく，集殖培養中に溶原菌があってそれから誘発してきたと考 えられるものをも含む可能性がある．よって各分離ファージの溶原性を検討したところ，O7T-12P と２５N-66Pの２株のファージに溶原性が認められた．このことはO7T-12Pと２５N 66Ｐはテン ペレート．ファージ（temperatephage）であることを示すものであり，他の１４株はヴィルレント ・ファージ(virulentphage）であった．テンペレート．ファージであるO7T-12Pと２５N-66Pにつ いては別報で詳述する． 分離海洋バクテリオファージの溶菌斑形態分離海洋ファージ系の二重寒天平板法による溶菌斑 形態をFig.２−１∼２に示した．多くの分離海洋ファージ，l5N-11P，１５N＝12P，２５N-35P，２５N-66R25N-70P,２５N-73P,２ZT-6P,２ZT-33Pと２ZT-36Pは径ｌ∼2ｍｍの正円の透明な溶菌斑を 形成し，一般に宿主菌苔に対.する溶菌部分のコントラストは弱い．l5N-5P，２５N-61Ｐと２５N=69Ｐ は同様に小さく透明な溶菌部分の周囲にハロ−をもつ溶菌斑を作る．O7T-12Pと２５N-27Ｐは透明 で大きな溶菌斑（径３∼5ｍｍ）を形成し，また２５N-12Ｐと２５N=42Ｐはさらに大きなしかも周囲 にハロ−をもつ溶菌斑を形成する． 分離海洋バクテリオファージ粒子の構造各‘供試ファージはそれぞれ調製されたファージ・ライ ゼイト（phagelysate）から遠心分離法でファージ粒子を集め,それを１％酢酸アンモニウム水溶液 に濃厚に懸濁（l01o-11pfu/ｍＺ）する．この濃厚ファージ懸濁液を試料とし，リンタングステン酸に よる陰染色標本を作成して，日立製電子顕微鏡，ＨＵ=11Ｄ型にそう入し，電顕実拡大50,000倍で 観察し撮影した．そのネガを更に４倍に引伸ばして焼付け，200,000倍の写真としてＦｉｇ３−１∼４ 100/ｍｌｌ２３ ３ 40/ｍｌｌ３８

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Table２．Briefcharacterizationofthehostbacteria． に示した．またそれら構造の各部の大きさをTable3にまとめた． O7T-12P粒子は径６０ｍﾉαの外観六角形の正多面体の頭部に痕跡の尾部様構造を付した形である． 供試海洋フアージのうち，この構造に類するものは25N-35Ｐと２ZT-36Pである． l5N-5P粒子は径６０∼70叩の外観六角形の頭部と短い尾部から成っている．尾部の大部分は尾 板で占められ，尾板は非常に短いネックを通じてほとんど直接頭部に接続している．さらにその尾 板の先には六角に配置された６個の突起をもつ．このように短いながらも複雑な構造の尾部はおお よそ巾１０ｍ似長さ２０ｍ,"の大きさである．供試海洋ファージのうち，この粒子構造に類するものは 25Ｎ-12P，２５Ｎ-42Ｐと２ZT-33Pである． l5N-11P粒子は径６５ｍ,α位の外観六角形の多面体形をした頭部と比較的細くて長い非収縮性の 尾部(幅１０ｍ"，長さ180叩）とから成立っている．供試海洋ファージのなかで，この粒子構造に 類するものは，l5N-12P，２５N-66R25N-69Pと２５N-70Pである．ただし尾部の長さはフアージ によってそれぞれ異なり，そのうえ尾部先端構造も様々である．２５N-66Pの尾部末端構造には明 らかに尾板があり，その先にスパイク様の突起が見られる．l5N-11P，l5N-12Pと２５Ｎ-69Ｐのそ Hostbacteria 話ｇｐｏ砦①呂亀里即．国

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唖謎画 Ｅ２ 瀞鞍 鹿児島大学水産､撲部紀要鋪２２巻第１号（1973） Fig.2-1．Plaquemorphologyofthemalmelp 子 守 戦 闘

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5６ 鹿児島大学水産学柵紀要第２２巻第１号（1973） ･ ず 愈 薄 ' 頚 衿 Fig.３−３．ElecLronmicrogl･ａｐｈｓｏｆ２５Ｎ−６１Ｐ,２うＮ−６６Ｐ,２５N-69Pand25N-70Pparticlesnegatively staincdwithl)hosphotungslicacid．Ｘ200,000 噸 『 審 園 駕騨側

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ハＵ八Ｕ︵Ｕ︵Ｕ︿Ｕ︿ＵｎＵハＵハＵ︵Ｕ︿Ｕ︿ＵｎＵ︿Ｕｎ﹀︵Ｕ 令１勺上君１１ユ勺１ 勺１冠１屯１君人勺１勺１屯１勺１ Table４．Survivalofthemarinephagesheateｄａｔ５０ｏＣｆｏｒ３０ｍｉｎｏｒ ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔhchloroform・ InitialphageconcentrationwasalO6pfu/mlinseawaterbroth． 鹿児島大学水産学部紀要第22巻第１号（1973） Width,ｍ似 Table３．Dimmensionsoftheparticlesofmarinephagesused． Phages １０ 1０ １０ １０ １０ ２０ １０ １０ ２０ １０ １０ １０ ２０ ２０ １０ １０ Sｉｚｅｏｆｔａｉｌ Sizeofhead Diameter,ｍｊｕ Phages ６０ ７０ ６５ ７０ ６０ ７０ ５５ ７０ ６０ ６０ ７０ ６０ ７０ ６５ ７０ 6０

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日 高 ： 海 洋 フ ァ ー ジ の 性 状 5９

れは尾板様のものが承られ，その先が分岐している．２５N-70Ｐは尾部先端構造が明りょうでない．

２５N-27Pの粒子は径７０ｍ,αの外観六角形の頭部と巾２０坪長さ８０坪の尾部から成っている．

尾部の囲りには収縮性尾鞘をつけ，先端に尾板をもつ．尾板にはスパイク様構造が見られる．この

粒子構造の成り立ちは，大腸菌一Ｔ偶数系ファージの構造に類似し完全な形をしている．供試海洋

フアージのうち，２５N-61R25N-73Pと２ZT-6Pがこの構造に類似する．２５N-61Pの写真では

尾部が収縮した様子もうかがえる．

分離海洋バクテリオファージの安定性供試ファージ粒子の加熱やクロロホルム処理による失活

度合は，そのファージの実験手技に大きなかかわりをもつ．一般に多くの陸棲ファージはそれらの

処理に対･して安定であるが，海洋ファージには不安定なものを承かける．そこで分離海洋ファージ

の性状の一つとして，それらの安定性を検討した．すなわち，各ファージ液はそれぞれ海水培地中

でl06pfu/ｍｌに調整し，それらを５０oＣ30分間の加熱またはクロロホルム１/１０量を加え強く振漁

して室温（約25oC）に１時間放置後，それぞれの生残ファージ数を計数した．その結果はTable4

に示される．Ｔａｂｌｅ４に承られるように，５０oＣ３０分間の加熱でO7T-l2P，ｌ５Ｎ−５Ｐ，２５Ｎ-35Ｐと

2ZT-36Pはほとんどあるいは完全に，また２５N 12Ｐは１/100に，１５N=11P，l5N-12Pと25N-42Ｐ

は１/１０に失活した．他の供試海洋ファージは５０。Ｃ３０分間の加熱に対･し安定であった．次に，

クロロホルム処理によってはO7T-12Pと２ZT-36Pが完全失活し，l5N-5Pは１/１０００に25N 35Ｐ

は１/100に失活した．他の供試海洋ファージはクロロホルム処理に対し安定であった．このよう

に，クロロホルム処理によるよりも５０。Ｃ30分間の加熱によってより多くの海洋ファージが何らか

の失活を被った．そしてクロロホルム処理に対し不安定なものは５０。Ｃ３０分間の加熱に対しても不

安定であった．不安定度に差はあるが供試海洋ファージのうち１/３程度が不安定なファージであっ

た、これら不安定なファージは，ファージ液の貯蔵中でも力価の減少が速い． 考 察

本報に記載した16組の海洋ファージ系は，各傭供試材料から分離された栴主一ファージ系を相互

に交叉感染させてその類似性を検討し，同種の柄主一ファージ系と見なされるものを整理統合した

うえ，更に前報（日高．藤村，1971a，197ｌｂ）で記載した０６Nーファージ８株とＯＸＮ−ファージ

８株ともそれぞれ異種性が確認された新しいものである．これらの過程において，同じ試料-海水か

ら同種の海洋ファージ系が重複して分離されたことがあったが，採取点の異なる試料海水から分離

された海洋ファージ系で相互に類似するものは殆んどなかった．このように各海域に共通する海洋

ファージ系が少なかったことは，試料採取点の位置的相違によるものばかりでなく，試料害採取時期

が大きく異ったせいであろう．ただ一つl5N-11Pはそれと同種のファージ系が２５Ｎ−海水と２ZT-海水からも分離されていたが，このファージ系に類するものは九州南方の亜熱帯海域にひろく分布

するもののようである．と言うのは，前報に記載したO6N-12RO6N 24Ｐと本報に記載した１５Nー

11Ｐとは相互に交叉感染はしなかったが，それらの宿主菌の性状やファージ粒子構造などが酷似し

ている．これらファージ系の同定は更に詳細に検討したいが，このファージに類するものが九州南

方海域に特有なものであることがうかがえた．

分離海洋フアージ系の宿主菌はVj67-加５株，Psez‘αo"zoﾉｚａｓ５株，ＦＺａＵＯ６ａｃｵeγ”?ｚ２株，ＡＣﾉi7-O‐

"zo6aae7-2株とＡｅﾉ℃"zo7zas2株であり，それらはいずれも海洋細菌の主導菌に属するものである

が，なかでも”6ｱ/･属とＰＳ‘‘‘αo"zo"ａｓ属菌が多い．ちなみに，前報に記載した16組のファージ

6０ _{鹿児島大学水産学部紀要第22巻第１号（1973）} 系の宿主菌はＶZ伽ｏ９株，ＰＳe”omo"αｓ４株，Ｆ伽o6acte伽加２株，ＡＣﾊｱO加o6acZeγ１株であっ た．宿主菌が同じ菌属（genus）に属するものであっても，それらに感染するファージの性状はそれ ぞれ異なった．分離海洋ファージの宿主特異性はきびしく，宿主域の狭いものであった．従って分 離海洋ファージ系の宿主菌の分類的位置を菌種（species）レベルまで精査し，それらに感染するフ ァージとの相関性を整理して分類困難な海洋細菌の鑑別に役立てたい。 分離海洋ファージの粒子構造は多様であり，特に尾部構造において巾広い差異が見られた．ここ に分離海洋ファージの粒子構造を大別すれば，１）痕跡の尾部類似の構造をもつファージ３株， 2）短い尾部をもつフアージ４株，３）細長い非収縮性の尾部をもつフアージ５株，４）収縮性尾 鞘をつけ完全な形をした尾部をもつファージ４株であった．TIKHoNENKo(1970）はファージの粒 子構造を基礎にして，ファージをＩ∼Ｖの五群に分けている．彼の群別に照らせば，上述の２)， 3)，４）はそれぞれⅢ，Ⅳ’Ｖ群に相応する．また同氏の記載によれば，Ⅲ，Ⅳ'Ｖ群に属する ファージは２本鎖ＤＮＡを遺伝物質としてもつファージである．上述の１）はTIKHoNENKoの群 別のⅡ群に属するものかⅢ群に属するものかはFig.３の写真からだけでは明らかでない．Ⅲ群に 属するものとすれば２本鎖ＤＮＡファージであるが，Ⅱ群に属するものとすれば１本鎖ＤＮＡフ ァージかＲＮＡファージということになる．１）がⅡ’Ⅲ群のいずれに属するものであるかは，粒 子構造の外観ばかりでなくそれらファージの遺伝物質である核酸の形状をも検討し，両者をあわせ 考えて群別しなければならないそのことは現在検討中である．このように分離海洋ファージの粒 子構造は多様であり，陸棲ファージに対し，海洋ファージの形態的特性として示される共通する特 異構造は見出し得なかった． 分離海洋ファージの約１/３の割合で見出される不安定なファージは，形態的には短いまたは痕跡 の尾部をもつファージに多く，次いで非収縮性の長い尾部をもつファージに見られ，収縮性尾鞘を つけた尾部をもつファージには見られなかった．このことは前報（日高・藤村，1971ｂ）で得られ た知見を再確認するものである． 次に本報において特記すべき点は，分離海洋ファージ16株のうち２株がテンペレート・ファー ジであることである．海洋テンペレート・ファージであるO7T-12PはＰＳＥ"do"o"αssp・を２５N-66ＰはＡ”o伽刀assp､を宿主とするテンペレート・ファージである．両テンペレート・ファージ の宿主菌に対する溶原サイクルを確認したが，その詳細は別報にゆずる．これらテンペレート・フ ァージを使い，海洋Pse”o加o"ａｓ菌や海洋ルァo''２o"ａｓ菌の形質導入実験の成立を目指して基礎 実験を進めている． 要 約 九州南方海域から採取した海水や海底堆積泥から１６組の海洋ファージ系を分離した．それらの 宿主菌は典型的な海洋細菌であり，ＶＩ伽ｏ（５株)，ＰＳe”omo"ａｓ(5)，ＦＺａｚﾉo6acte伽加(2)， Achγo伽ａｃｒｅγ（２）とＡｅｒＯ碗o"ａｓ（２）に属する菌種であった．分離海洋ファージの粒子構造は個 灸に異なり，これら供試ファージの構造から海洋ファージの形態的特性を表わす共通点は見出し得 ず，むしろその形態の多様性を認めた．また不安定な海洋ファージは形態的には短い尾部をもつフ ァージに多いことなど前報で得られた知見が再確認された．分離海洋ファージ16株のうち14株は ヴィルレント・ファージであったが，２株はテンペレート・ファージであった．このテソペレート ・ファージを使って，,海洋細菌の形質導入実験が期待される，

日 高 ： 海 洋 フ ァ ー ジ の 性 状 6１ 本研究の一部は昭和47年度文部省科学研究費補助金（No.756108）によって行なった．記して 謝意を表します．海底堆積泥の採取にあたり御支援賜わった米国ワシントン州立大学海洋学部の Dr・ＨＬＩＮＧに，また海水試料採取に御協力いただいた学生，一田謙一，田村良和，徳重明憲の３ 氏にもあわせて御礼申し上げます． 文 献 ＢAIN,Ｎ､ａｎｄＪ.Ｍ・ＳＨＥｗＡＮ(1968）：IdentificationofAf，ﾉｰの刀o刀ａｓ，Ⅷ'･わandrelatedorganisms・ｉｎ‘‘Identi‐ ficationMethodsforMicrobiologists，ＰａｒｔＢ'，（Ｂ、Ｍ・ＧＩＢＢｓａｎｄＤ．Ａ・SHAPToN，ｅｄ.)，79-84, AcademicPress，NewYork・ BREED,Ｒ､Ｓ､，Ｅ､Ｇ､Ｄ、MTRRAY，ａｎｄＮ.Ｒ､ＳＭＩＴＨ(1957)：“BERGEY'sManualofDeterminativeBacte・ riology'',７ｔｈｅｄ.,WilliamsandWilkkinsCo.,Baltimore・ HARRINGAN，Ｗ,Ｆ・ａｎｄＭ.Ｅ・McCANcE(1966）：“LaboratoryMethodsinMicrobiology''，Academic Press，NewYork・ HENDRIE,Ｍ,Ｓ・ａｎｄＪ.Ｍ・ＳＨＥｗＡＮ（1966）：Theidentificationofcertain盈５９”omo"ａｓspecies・ｉｎ“Identi‐ ficationMethodsforMicrobiologists，PartA，，（Ｂ､Ｍ､ＣＩＢＢｓａｎｄＦ.Ａ・SKINNER,ｅｄ.)，１−７，Academic Prese,NewYork・ HIDＡＫＡ,Ｔ・ａｎｄＭ､SAKAI（1968）：Comparativeobservationoftheinorganicsaltrequirementsofthe marineandterrestrialbacteria．Ｂ〃".Ｍ３α〃Mzr”助Z､伽r・ＫｊＷｏ助加.，No.12,125-149． HIDAKA,Ｔ・（1971）：Isolationofmarinebacteriophagesfromseawater.Ｂ〃・ん'・Sbc.Ｓと/,Ｆ1Ｍ.’３７，１１９９− 1206． 日高富男・藤村剛(1971a)：海洋バクテリオフアージの形態について．本誌，２０(1)，141-154． 日高富男・藤村剛(1971ｂ)：海洋バクテリオフアージの熱およびクロロホルム耐性．本誌，２０(1)，155-158． HIDAKA,Ｔ､（1972）：Onthestabilityofmarinebacteriophages・Ｂｚｲ"・んp・ＳｂｃＳｔ/・ＦＭ.,38,517-523． 日高富男・一田謙一(1972)：海洋バクテリオフテージの細菌炉過膜通過による損失．本誌，２１(1)，97-102． TIKHoNENKo,Ａ､Ｓ､（1970）：“UltrastructureofBacterialViruses，，(TranslatedfromRussianbyB､HAIGH)， 29-32,PlenumPress，NewYork．