MicroRNA RNA mirna RNA [1*] mirna mirna [2*] mirna RNA mirna mirnasmall RNA mirna mirna mirna 2 *Reference

microRNA

製品カタログ

having a big impact on biology

MicroRNA

：

生物学の新しいフロンティア

マイクロ

RNA

（

miRNA

）は、タンパク質をコードしない

小さな

RNA

分子で、遺伝 子発 現の翻訳後 抑制を行い

ます。この分子は、当初“生物学における暗黒物質のよ

うなもの”

[1*]

として言及されましたが、その後、発生や

細胞 増殖、分化、数多くの基 本的な生物内プロセスに

おいて重要な調節因子であるということが明らかにさ

れました。最近の報告では、

miRNA

が癌や代謝疾患、

神経疾患、感染症、その他のヒトの疾病に

miRNA

が関

与していることが示唆されています

[2*]

。

通常、

miRNA

は比較的長い

RNA

からなる前駆体とし

て転写され、

17

∼

24

ヌクレオチドからなる活性型の成

熟

miRNA

にプロセシングされます。非常に低 分 子で

あるため、成熟

miRNA

やその他の

small RNA

の研究

には特別なテクニックが必要とされます。単離から新

規

miRNA

の同定、プロファイリング、定量、あるいはバ

リデーションや機能解析まで、ライフテクノロジーズは

miRNA

研究のために特別に開発した革新的なツールを

提供しています。これらのツールは、多くの研究者による

miRNA

の基本的な研究をサポートするだけでなく、解明

された多くの結果から、このエキサイティングな生物科

学の新分野の全貌を明らかにすることを可能にします。

*Reference

情報は裏表紙をご参照ください。

Contents

4

small-RNA

のゲノムワイド探索

8

microRNA

発現の網羅的プロファイリング

13

ターゲット

miRNA

の定量

18

microRNA

機能解析

23

microRNA

抽出

26 エキソソームの分離・回収

シーケンス データ解析 ライブラリ作製

6

時間

5

時間

2

時間

1

時間 テンプレート調製 1 2 3 4 • Ion PGM™ シーケンサ • Ion Proton™ シーケンサ • Torrent Server • Torrent Suite Software • Ion OneTouch™ システム

• Ion Total RNA-Seq Kit v2

図1．small-RNA シーケンスワークフロー

small-RNA

のゲノムワイド探索

サンプル中の全ての

small RNA

の配列情報を

取得し発現レベルを把握する

ここ

2

年 の 間に

10,000

種 類 近くの 新 規

small RNA

の 配列 が

miRBase

レジストリに登録されており

[3]

、新規

smallRNA

の探 索が進んでいます。ライフテクノロジーズの

Ion PGM™

システムの ための

RNA

シーケンシング手法なら、これまで報告されていない

small RNA

を迅速に発見し、その発現レベルを高感度に検出する ための数多くの製品が提供されています。

原理

サンプルから

small RNA

を単離した後、逆転写を行って

small

RNA

集団の

cDNA

ライブラリを作製します。このライブラリの

cDNA

を増幅し、シーケンシングを行い、通常“タグ”と呼ばれるそ れぞれの

small RNA

の

cDNA

に対応する塩基配列情報を取得しま す。これらのタグを参照するリファレンス配列のデータベースにマ ッピングすることで、新規のあるいは既知の

small RNA

が同定さ れます。相対的な発現レベルは、それぞれの

small RNA

から得ら れたタグの数から計算可能です。また、結果をフォローアップする バリデーションは

TaqMan

®

_5'nuclease

_{ケミストリを用いて行う} ことができます（図

1

）。

Ion

半導体シーケンシング： シンプルなワークフ

ローのソリューションです

Ion PGM™

システムでは、ライブラリ調製に始まり、シンプルで迅 速なシーケンシングのワークフローや直観的に操作できるデータ 解析ツールまで、

small RNA

研究を行うための完全なワークフロー を提供します。

Ion Total RNA-Seq

キット

v2

は、ヒトおよびヒト以外のサンプル を使用し、シンプルな操作でたった

1 ng

の

small RNA

から

small

RNA

のライブラリ調製を可能にします。二本鎖

cDNA

にアダプタ をライゲーションする他の方法とは異なり、

Ion Total RNA-Seq

キット

v2

は独自の

Ambion

®_{テクノロジーを利用して方向性を維持} したままアダプタを付加するので、作製したライブラリでは元の鎖 の情報が保存されています（

US Patent:8192941

）。さらに、

3'

お よび

5'

のアダプタを同時に付加するのでライゲーションとクリーン ナップのステップを減らすことができます。

Ion OneTouch™

システムはテンプレートの調製を約

3

時間で完了 することを可能にします。実際に操作を行う時間は数分です。また、 引き続いて行われる

Ion PGM™

シーケンサによるシーケンスは

1

時間未満で完了します。シーケンスの読み取りは

Torrent Suite

ソ フトウェアで行い、これも通常

1

時間以内で完了し、次世代データ 解析ソフトウェアで解析を行うためのファイルがエクスポートされ ます。

プローブデザインに依存しない、 マイクロアレイ

よりも優れたデジタルデータの産出

Ion small RNA-Seq

はマイクロアレイと異なりプローブデザインに 依存せずに

small RNA

の探索やプロファイリング、定量を実施する ための方法です。

Ion RNA-Seq kit v2

と

Ion 314™

および

Ion 316™

チップを使用し、ヒトの肺や胎盤のサンプルから得られた

miRNA

のシーケンシングを行いました（肺については両方のチップで

3

反 復、胎盤については

Ion 314™

チップが

3

反復、

Ion 316™

チップが

2

反復）。シーケンスデータを

GeneChip

®

_miRNA

_{マイクロアレイ（}

₃

反復）、および

TaqMan

®

_{Array MicroRNA}

_{（それぞれの組織につい}

て

2

反復）で行った発現プロファイリング実験の結果と比較しまし た。検出された異なる

miRNA

分子の数は、

Ion PGM™

シーケンサ の検出結果がマイクロアレイの結果を上回り（表

1

）、

miRNA

種の検 出感度では

Ion

半導体シーケンシングがマイクロアレイを凌ぐこと がわかります。 さらに、

Ion RNA-Seq

のデジタル検出手法のおかげで、検出装置の シグナル強度のしきい値に制限される

LogRatio

値のダイナミック レンジもマイクロアレイと比較して拡大されます（図

2

）。   検出手法 Total

assays Intersection assays Intersection detected

TaqMan®_{法 748 708 308}

GeneChip® _{Array 847 708 216}

Ion 314™ チップ 904 708 230 Ion 316™ チップ 904 708 358

表1. Ion small RNA-Seqデータに見られる高い感度

最初のカラムには、それぞれのプラットフォームが含むコンテントにもとづいた 検出可能なmiRNAの総数を示します。Ion PGM™シーケンサによる検出のしき い値は、各コンテントに依存せず、この数は最新のmiRBaseに含まれるmiRNA の総数を示します。TaqMan®_{ケミストリによる検出ではCt < 40として計算してい} ます。理論上3つ全てのプラットフォームで検出可能なmiRNAの数を2番目のカ ラムに、また、各プラットフォームで実際に検出されたmiRNAの数を最後のカラ ムに示します。 lo g2 ( 胎盤 / 肺 ) PGM 316 PGM 314 Array log2倍数変化の分布

図2. Ion small RNA-Seqはアレイよりも広いダイナミックレンジを示しますIon 316™チップ とIon 314™チップで得られた ChipsLogRatio値のダイナミックレンジをGeneChip® _miRNA

と比較しました。ダイナミックレンジは箱ヒゲプロットで表示しています。 検出手法 hsa-miR-126 hsa-miR-126* TaqMan® _{法 21.4 26.5} マイクロアレイ 15.1 Not detected

Ion PGM

™_{シーケンサ 13.2 10.9}

Ion PGM™

シーケンサを用いた全

miRNA

アイソ

フォームの検出

Ion PGM™

シーケンサはまた、アノテーション済みの

miRNA

の

-3p

フォームあるいは

-5p

フォーム（これらは以前はそれぞれ

leading

フォーム、

star

（

*

）フォームと呼ばれていたものです）を識別するこ とができます（表

2

）。ステムループ

hsa-mir-126

に由来する成熟

miRNA

フォームの

Ion PGM™

シーケンスデータ解析の代表例を示 します。胎盤のライブラリから得られたこれらのリードでは、

5'

もし くは

3'isomir

がどちらも検出されました（データ未掲載）。マイクロ アレイによる解析では、正確に

isomir

を検出することは非常に困難 です。 表2. Ion PGM™シーケンサによる成熟miRNAの-3pフォームおよび-5pフォー ムの識別能力  ここにはTaqMan® _{MicroRNA アッセイのCt値、マイクロアレイのハイブリダイ}

ゼーションシグナルのlog2値、mapped Ion PGM™シーケンサリードのノーマラ イズ済のlog2値です。

Ordering information

製品名 サイズ 製品番号 価格

Ion PGM™_{システム テンプレート調製自動化システム付}

Ion PGM™ シーケンサ1台、Torrentサーバー 1台、Ion OneTouch™ 2.0 Duoシステム1式、 卓上遠心機1台、無停電安定化電源装置1台、

インスタレーション用試薬1式、設置・基本取扱説明

一式 PGM11-020S2（2年保証） ¥9,600,000

Ion PGM™_{システム チップ作製自動化システム付}

Ion PGM™ シーケンサ1台、Torrentサーバー 1台、Ion Chef™ システム1台、 卓上遠心機1台、無停電安定化電源装置1台、

インスタレーション用試薬1式、設置・基本取扱説明

一式 PGM11-C01S2（2年保証） ¥13,400,000

Ion Total RNA-Seq

キット

v2

Ion Total RNA-Seq

キット

v2

は、既知の、あるいは予測した

small

RNA

配列を解析するだけの他の検出手法とは異なり、予め得られ る配列情報に依存することなく、サンプル中に含まれるすべての

small RNA

分子をデジタルな配列情報として得ることができます。 この能力が、新規の

small RNA

分子の発見だけでなく、選択的プ ロセシングにより生じる異なるアイソフォームの検出も可能にし ます。

100ng

のトータル

RNA

中の

5ng

の

miRNA

もしくは濃縮済の

1ng

の

miRNA

からスタートすることができます。

特長

•

新規の

small RNA

分子やアイソフォームを検出

•

細胞あたり

1

コピー以下の

small RNA

を検出可能な感度

•

ストランド情報を保持した発現解析が可能

•

ゲル精製不要のビーズ精製方式により、プライマーダイマーを除去

•

最新の逆転写酸素の採用により精度向上

• 16

サンプルまでのマルチプレックス可能

Ordering information

製品名 サイズ 製品番号 価格

Ion Total RNA-Seq kit v2、12Rxn 12 ライブラリ 4475936 ¥144,000 Ion Total RNA-Seq kit v2、48Rxn 48 ライブラリ 4479789 ¥480,000 Ion Xpress™ RNA-Seq Bc 01-16kit 10×16 ライブラリ 4475485 ¥192,000 RiboMinus™ Eukaryote System v2 12 反応 A15026 ¥85,700 Low Input RiboMinus™ Eukaryote System v2 12 反応 A15027 ¥85,700

RiboMinus™ Eukaryote

システムキット

v2

RiboMinus™ Eukaryote

システムキット

v2

は、トータル

RNA

試料 中の大きなリボソーム

RNA

分画を激減させることによって、

RNA

転写物の全スペクトルを濃縮する新しい精製システムです。この キットは、ヒトあるいはマウスの

Total RNA

から

18S

、

28S

、

5S

、

5.8S

rRNA

を

95

％以上取り除くことができるように、

rRNA

に特異的な

5

’ビオチン標識プローブを使用してます。

rRNA/

プローブ複合体は、 ストレプトアビジン標識のマグネットビーズによって、試料から取り 除かれます。これによって、末端に

PolyA+

を持たない断片化され た

mRNA

、あるいは

PolyA+

選択法では精製することができないほ かの調節

RNA

などの

RNA

転写産物種の回収量が増加します。精製 された

RNA

は、次世代シーケンス、マイクロアレイ、

RT-PCR

などの サンプル調製にお使いいただけます。

特長

•

細胞質およびミトコンドリア由来の

rRNA

を

95

％以上除去

•

磁気ビーズ精製方式によりスムーズな約

1

時間のワークフロー

• RiboMinus™ Eukaryote System v2

は

1

∼

5

μ

g

の

RNA

インプッ

トに対応

• Low Input RiboMinus™ Eukaryote System v2

は

100ng-1

μ

g

の

RNA

インプットに対応

ワークフロー

磁気ビーズクリーンナップを備えた

v2

システムでは、

1

時間でリボ ゾーム

RNA

を除去

Step 1 Step 2 Step 3 Step 4

Ion Total RNA-Seqキットホールトランスクリプトームライブラリ調製

15分 30分 30分 1時間 1時間 1時間 合計：4時間15分 RNAサンプル アダプターの ハイブリダイゼーション ライゲーション 逆転写 精製 ライブラリの増幅 精製 5’アダプター 3’アダプター 逆転写開始位置 ブロック 5’ライゲーション部位 目的のRNAサンプル 3’ライゲーション部位 Non rRNAS Biotin Hybridized RiboMinus™ probe Non rRNAS Biotin Streptavidin Bead Magnet rRNA-depleted RNA リボソームRNAと プローブを ハイブリダイゼーション 10分 - 変性 20分 - キャプチャー ストレプトアビジン-磁気ビーズを用いて、 リボソームRNA / プローブ複合体を捕捉 マグネットで複合体 を吸着 クリーンナップ 30分

ERCC RNA Spike-In

コントロールミックス

ERCC RNA Spike-In

コントロールミックスは、

NIST

（

National

Institute of Standards & Technology

）によって

ERCC

（

External

RNA Control Consortium

）で定められた

RNA

コントロールの内、

92

種類を含む発現解析のためのコントロール

RNA

です。コント ロール

RNA

は

polyA

を有し、真核生物に対応しています。

SOLiD

®

システムを用いた遺伝子発 現解 析において、サンプル調整時の

Total RNA

から

rRNA

除去時の品質確認、ライブラリ調製時の品 質確認、シーケンス後のデータ品質確認に利用できます。

特長

• 23

種×

4

サブグループ：計

92

種類の

polyA RNA

•

約

10

6_{のダイナミックレンジ}

•

次世代シーケンサ、マイクロアレイ、リアルタイム

PCR

などを用 いた遺伝子発現解析に対応（

small RNA

解析には適用不可）

• total RNA

に

Spike-In

ミックスを添加後、

rRNA

除去または、

polyA RNA

精製する事で、

RNA

サンプル調製過程の品質確認が 可能

• Spike-In

ミックスが添加された

RNA

サンプルを用いる事で、ラ イブラリ調製時の品質確認が可能

•

データの品質確認（再現性、検出限界、ダイナミックレンジなど） が可能

•

サブグループの濃度が異なる

Spike-In

ミックス

1

と

Spike-In

ミ ックス

2

を併用する事で、発現変動の評価が可能

•

個 々 のコ ント ロ ール

R N A

を 検 出 するリアル タイム

P CR

用

TaqMan

®

_Assay

_{を別途提供しており、サンプル調製過程で確認} 実験が可能

Ordering information

製品名 サイズ 製品番号 価格

ERCC ExFold RNA Spike-In ミックス 10 µl × 2 4456739 ¥240,000 ERCC RNA Spike-In ミックス 10 µl 4456740 ¥120,000

図3. ERCC ExFold RNA Spike-In ミックスに含まれるExFold RNA Spike-In ミックス1と ミックス 2を2種のサンプルに加え比較した場合の模式図

23種×4サブグループ：計92種類のpolyA RNA からなるERCC RNA Spike-In ミックス1を用 いる事で、サンプル調製、データの品質確認が可能。 さらに、ExFold Spike-In ミックス 1 とミックス 2を用いた場合、それぞれのミックスの4種の サブグループの濃度が異なる為、発現変動の評価も可能。 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7 1e+8 1e+9 1e +9 1e +8 1e +7 1e +6 1e +5 1e +4 1e +3 1e +2

ERCC Mix 2（molecules/100ng mRNA）

ER CC M ix 1 （ m ol ec ul es /1 00 ng m R N A ）

ゴールドスタンダードとしての

TaqMan

®

_テクノロ

ジー：

1

日以内に

microRNA

のプロファイリングを

完了

サンプル間の全

miRNA

発現の違いをプロファイリングすること は、生物学的プロセスに影響を与える特定の

miRNA

を同定する際 の最初のステップとなります。まず、

miRNA

発現が異なると予想さ れるサンプル間の比較を行います。例えば疾患組織と正常組織、薬 剤処理サンプルと未処理サンプル、異なる組織間などで

miRNA

の 発現プロファイルの比較を行います。

miRNA

は非常に低濃度でも細胞の機能に影響を与え、また、その 発現レベルの範囲が非常に広いので、その定量には高感度で広 いダイナミックレンジを持つツールが必要となります。

TaqMan

®

OpenArray

®

_{MicroRNA Panel}

_および

_TaqMan

®

_{Array Micro}

RNA Card

は、

Megaplex™ Primer Pools

との組み合わせで、この ような実験に最適です。 これらのツールは、ヒト、マウス、ラット由来の

miRNA

解析に対応 しており、

48

サンプル分の

miRNA

発現プロファイルを同日中に得 ることができます。しかも、必要なのはたった

100 ng

のトータル

RNA

だけです。ゴールドスタンダードとなっている

TaqMan

®_アッセ イケミストリの感度や特異性、ダイナミックレンジのメリットを最 大限に生かし、また少量ターゲットの

PCR

にライフテクノロジーズ の革新的なステムループ

RT

プライマーデザインを採り入れたこと により、

TaqMan

®

_OpenArray

®

_MicroRNA

_{パネルおよび}

_TaqMan

®

Array MicroRNA

カードは、データを得るために数日を有し、

1

回の 解析に数

100 ng

の

RNA

が必要なマイクロアレイ解析に対して明ら かな優位性を示します（図

4

）。

ワークフローの特徴

•5

時間以内に数百種類の

miRNA

のプロファイリング実験が完了 します

•

ヒト、マウス、ラットのプロファイリングに最適です

•miRBase

に含まれる既知の

miRNA

を広く網羅します

原理

中規模のスループットを持つ

TaqMan

®

_{Array MicroRNA Card}

の場合には、

377

種の

miRNA

に対する逆転写反 応を

1

本のチュ ーブで行います。（

A

・

B

アレイを両方とも解析する場合は、それぞ れ

377

種の

miRNA

に対する逆転写反 応を、

2

本のチューブに分 けて行います。また、ハイスループットの

TaqMan

®

_OpenArray

®

MicroRNA Panel

の場合には、

754

種の

miRNA

を

2

本のチューブに 分けて逆転写します。逆転写に使用する

Megaplex™ RT Primers

は

377

種の

miRNA

特異的なステムループプライマーがミックス されたもので

Applied Biosystems

®_{リアルタイム}

_PCR

_装置を用

いた解 析フォーマットに合わせてデザインされています。次に、

Megaplex™ PreAmp Primer Pools

を用いてプレ増幅のステッ プを行います。バイアスのない増幅を可能とするこのステップによ りサンプル中の

miRNA

の濃度が増加し、最大の感度でリアルタイ ム

PCR

の検出ができるようになります。最後の定量ステップでは、

TaqMan

®

_{Universal PCR Master Mix II}

_{を各サンプルに添加し}

ます。サンプルのロードはご利用になるシステムによって異なりま す。

TaqMan

®

_OpenArray

®

_{MicroRNA Panel}

_の場合、

_AccuFill™

システムを用いてサンプルをロードします（このパネルは予め調製 されたナノ流路プレートで

3

セット

754

種の

TaqMan

®

_MicroRNA

Assays

がプリントされています）。

TaqMan

®

_{Array MicroRNA}

Card

の場合、ピペットを用いて

Card

のサンプル注入用ポートから サンプルをロードします。

TaqMan

®

_{MicroRNA Card}

_は

_A

_・

_B

_の

₂

_枚

のカードから成り、それぞれ

377

種の

miRNA Assay

がマイクロ流 路カードに予めプリントされています。

microRNA

発現の網羅的プロファイリング

60 min 10 min 90 min 150 min 30 min ・mir VanaTM

　miRNA Isolation Kit ・TaqMan® _{ABC Purification Kit}

・MegaplexTM _{RT Primers}

・TaqMan® _MicroRNA

　Reverse Transcription Kit

・MegaplexTM _{PreAmp Primers}

&

・TaqMan® _{PreAmp Master Mix}

・RealTime StatMiner® _Software

・DataAssist™ Software サンプル調製 逆転写反応(RT) cDNA_{(オプション}増刷₎ cDNA_＆ロードの希釈 データ解析 リアルタイム PCR装置による ラン実行 1 2 3 4 5 6 Total RNA miRNA xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx xx ・QuantStudio™ _{12K Flex,} ・ViiA™ ₇ ・7900HT Fast リアルタイム 　PCR システム ライブラリ作製

・TaqMan® _{Array Card}

　 or ・OpenArray® _Plate

図4. TaqMan® _OpenArray® _{MicroRNA PanelおよびTaqMan}® _Array® _{MicroRNA Cardsのワークフロー}

ヒト、げっ歯類のmiRNA発現プロファイリングを行う際、TaqMan®_OpenArray®_{MicroRNA Panelsを用いた解析では、オプションのMegaplex}TM_{PreAmp Primer}

Poolsによるpre-amplificationを行った場合でも、同時に12サンプルを5.5時間で処理することが可能です（pre-amplificationなしでは4.25時間）。TaqMan®_Array

Megaplex™

プライマープール：

カードとパネル

プロファイリング実験に究極の感度や広いカバー率を求める場合 には、

Megaplex™ Primer Pools

がその目的を達成するためのフ レキシビリティを提供します。

TaqMan

®

_OpenArray

®

_MicroRNA

Panel

または

TaqMan

®

_{Array MicroRNA Card}

_は、

_Megaplex™

Primer Pools

と組み合わせて使用します。これらは

miRBase

に 登録されている

miRNA

の多くをカバーしており、ヒトやげっ歯類 に対する理想的な

miRNA

プロファイリングソリューションを提供 します。

•Megaplex™ RT Primer Pools

̶

miRNA

プロファイリングを シンプルにするためにデザインされた

Megaplex™ RT Primer

Pools

はグローバルな

miRNA

発現プロファイリング用の

RT

プラ イマーのプールです。この製品は

cDNA

調製や個別の

TaqMan

®

MicroRNA Assays

にも使用することができます。

•Megaplex™ PreAmp Primer Pools

̶

TaqMan

®

_Array

MicroRNA Cards

とともに使用する場合やサンプル量が限られ る場合、アッセイの感度を最も重視する場合には、

Megaplex™

PreAmp Primer Pools

が大 いに役 立 ち、低 発 現レベ ル の

miRNA

や限られたサンプル量の場合の検出感度を向上させるこ とができます。

Megaplex™ PreAmp Primer Pools

は、わずか

1

ng

のトータル

RNA

から効果的に

miRNA

発現プロファイルを得 ることができます（図

5

）。

TaqMan

®

_MicroRNA

_{アレイとパネル}

ヒト お よび げっ歯 類 のプ ロファイリング に 最 適 な

TaqMan

®

MicroRNA Arrays

は、

microRNA

アッセイが予めプリントされて いるマイクロ流路カードのセットで

TaqMan

®

_{MicroRNA Assay}

_の

優れた定量性で解析を行うことが可能です。アッセイの組み合わ せは

Megaplex™ Primer Pools

と一致しており、セットアップの時 間や実験手技によるバイアスを減らせます。より高いスループット を求める場合には

TaqMan

®

_OpenArray

®

_{MicroRNA Panels}

_を

おすすめします。

TaqMan

®

_OpenArray

®

_{MicroRNA Panels}

_は

₁

_枚

のプレートで

3

つのサンプルを同時に処理することが可能です。ど ちらの場合でも、

miRNA

ターゲットの逆転写には

Megaplex™ RT

Primer Pools

を使用し、

Megaplex™ PreAmp Primer Pools

に よるプレ増幅を行った後に各反応液に

TaqMan

®

_{Universal PCR}

Master Mix II

を加えるだけのシンプルな試薬調製で、ハイスルー プット解析に適しています。

miRNAマイクロアレイ TaqMan_TaqMan®Arrays MicroRNA Cards® _OpenArray® _Panelおよび 結果を得るまでの時間 少なくとも2日：サンプルのラベリングとハイブリダイゼーションのセッ トアップに丸1日かかり、2日目に洗浄とアレイのスキャニングを行い ます。 トータルRNAからリアルタイムPCRのデータまで2ステップ（プレ増 幅を行う場合は3ステップ）のみで1日で完了します。 ダイナミックレンジ 典型的には2–3 log （プラットフォームとプローブの種類によっては、 4 logの報告があります）。 最大7 logのレンジを持つので、高発現および低発現のmiRNAの検 出を1回の実験で行う事が可能となります。 特異性 マイクロアレイの測定が単一のハイブリダイゼーションイベントに依 存することを考慮すると、クロスハイブリダイゼーションの懸念があり ます。また、キャプチャープローブのハイブリダイゼーションでは、 miRNA前駆体と生物学的に活性を持つ成熟型miRNAを区別できま せん。 TaqMan®_{ケミストリによる高い特異性が得られます̶増幅シグナル} を得るためには、4つのユニークなオリゴヌクレオチドのハイブリダイ ゼーションが必要です。 革新的なステムループRTプライマーにより、成熟型miRNAに対す る特異性が得られます。 使用RNA量 典型的には1 µgもしくはそれ以上（いくつかのプラットフォームでは 100 ng以下がサポートされています）。 1–1,000 ng の範囲のいずれも使用可能です。 既知miRNAのカバー率 マイクロアレイのデザインは、典型的にはin silicoでの選抜に依存し ており、キャプチャープローブのデザインにはウェット実験によるバリ デーションは通常行われません。このことは無反応プローブが生じる ことによるカバー率の低下につながります。さらに、ハイブリダイゼー ションをベースとした技術であるため、感度が限定され、低発現の miRNAが検出されることは困難です。 全てのアッセイは、実績がありバリデートされたin silicoのデザイン パイプラインを使ってデザインされ、Megaplex™ Primer Poolsや TaqMan®_{Array Cardsに追加される前にはウェット実験によるバリ}

デーションが実施されています。Megaplex™ Primer Poolsによる アッセイのパフォーマンスは実際の実験で再検証できます。その結 果、全てのアッセイで必ず何らかの情報を得ることができます。 検 出 % テンプレート濃度 RT PreAmp RT PreAmp テンプレート濃度

Megaplex™ Human A Pool

の検出効率

Megaplex™ Human B Pool

の検出効率

0 ntc 0.1 fM 1 fM 10 fM 100 fM 1 pM 10 pM 100 pM 20 40 60 80 100 検 出 % 0 ntc 0.1 fM 1 fM 10 fM 100 fM 1 pM 10 pM 100 pM 20 40 60 80 100

図5. Megaplex™ Primer PoolsとTaqMan® _{Array MicroRNA CardsによるmiRNAの検出}

TaqMan®_{MicroRNA ArrayのA Card、B Cardに対して、それぞれのCardにプリントされているmiRNAアッセイの全ターゲットを人工的に化学合成し（10 pM）、total}

RNA （10ng/µL）にスパイクとして添加しました。人工ターゲットが6 logもしくは4 logになるように段階希釈した混合物を用いてMegaplex™ワークフローによる

テストを行いました。プレ増幅を行った場合と行わなかった場合で測定を行っています。さらに、アッセイの特異性を確認するため、テンプレート無しのコントロール （NTC）の反応を実施しました。

Ordering information

：

_microRNA

発現プロファイリング

■

サンプル調製

（

23

∼

25

ページ参照）

mirVana™ miRNA Isolation Kit TaqMan® _{miRNA ABC Purification Kit}

■

microRNA

用

RT

試薬

TaqMan® _{MicroRNA RT Kit}

TaqMan® _{MicroRNA RT Kitは、TaqMan}® _{MicroRNA Assaysの逆転写反応試薬です。Megaplex™ Primer PoolsまたはTaqMan}® _{MicroRNA Assaysに添付のRT} プライマーと組み合わせて使用します。

製品名 サイズ 製品番号 価格

TaqMan® _{MicroRNA RT Kit 200 反応 4366596 ¥24,300}

TaqMan® _{MicroRNA RT Kit 1000 反応 4366597 ¥72,800} Megaplex™ Primer Pools

Megaplex™ RT Primersはstem-looped構造の逆転写用プライマーをプールしたものです。TaqMan® _{MicroRNA Arraysと組み合わせることで効率的な}

プロファイリングワークフローを構築できます。数百のmiRNAのプロファイリングを一回の反応に集約し、網羅的miRNA発現解析に必要な逆転写反応とトー

タルRNAの量を低減します。

Megaplex™ RT Primers Pool （for Human）

製品名 サイズ 製品番号 価格

Megaplex™ RT Primers, Human Pool A

逆転写用プライマーのみ 50 反応 4399966 ¥86,900

Megaplex™ RT Primers, Human Pool B v3.0

逆転写用プライマーのみ 50 反応 4444281 ¥86,900

Megaplex™ RT Primers, Human Pool Set v3.0

RT Primers Pools A&B (4399966 & 4444281) 50 反応 4444745 ¥100,000

Megaplex™ RT Primers Pool（for Rodent）

製品名 サイズ 製品番号 価格

Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool A

逆転写用プライマーのみ 50 反応 4399970 ¥86,900

Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool B v3.0

逆転写用プライマーのみ 50 反応 4444292 ¥86,900

Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool Set v3.0

RT Primers Pools A&B(4399970 & 4444292) 50 反応 4444746 ¥100,000 Megaplex Primer PoolsのPool AおよびPool Bは、TaqMan® _{MicroRNA ArraysのA、およびBアレイに搭載されている遺伝子にそれぞれ対応しています。}

PreAmp製品によるcDNA増幅を行う場合（オプション）

Megaplex™ PreAmp Primersでは、1ngの微量のトータルRNAからでも網羅的な発現解析が可能になります。微量サンプルを用いたプロファイ リングに有効です。

Megaplex™ PreAmp Primers Pool （for Human）

製品名 サイズ 製品番号 価格

Megaplex™ PreAmp Primers, Human Pool A

PreAmp用プライマーのみ

50 反応 4399233 ¥86,900 Megaplex™ PreAmp Primers, Human Pool B v3.0

PreAmp用プライマーのみ

50 反応 4444303 ¥86,900 Megaplex™ PreAmp Primers, Human Pool Set v3.0

PreAmp Primers Pools A&B (4399233 & 4444303)

50 反応 4444748 ¥100,000 Megaplex™ RT and PreAmp Primers Package （for Human）

製品名 サイズ 製品番号 価格

Megaplex™ Primer Pools, Human Pools A

RT Primers(4399966) + PreAmp Primers(4399233)

50 反応 4401009 ¥121,200 Megaplex™ Primer Pools, Human Pools B v3.0

RT Primers(4444281) + PreAmp Primers(4444303)

50 反応 4444749 ¥121,200 Megaplex™ Primer Pools, Human Pools Set v3.0

RT Primers Pools A&B (4444745(= 4399966 & 4444281)) PreAmp Primers Pools A&B (4444748(= 4399233 & 4444303))

Megaplex™ PreAmp Primers Pool （for Rodent）

製品名 サイズ 製品番号 価格

Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool A

PreAmp用プライマーのみ 50 反応 4399203 ¥86,900

Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool B v3.0

PreAmp用プライマーのみ 50 反応 4444308 ¥86,900

Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool Set v3.0

PreAmp Primers Pools A&B(4399203 & 4444308) 50 反応 4444747 ¥100,000

Megaplex™ RT and PreAmp Primers Package（for Rodent）

製品名 サイズ 製品番号 価格

Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools A

RT Primers (4399970) + PreAmp Primers (4399203) 50 反応 4401090 ¥121,200

Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools B v3.0

RT Primers(4444292) + PreAmp Primers(4444308) 50 反応 4444752 ¥121,200

Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools Set v3.0

RT Primers Pools A&B(4444746(=4399970 & 4444292)) PreAmp Primers Pools A&B(4444747(=4399203 & 4444308))

50 反応 4444766 ¥137,400

TaqMan® _{PreAmp Master Mix}

製品名 サイズ 製品番号 価格

TaqMan® _{MicroRNA Panelsおよび関連試薬}

製品名 アッセイ数/Plate サンプル数/Plate サイズ 製品番号 価格

TaqMan® _OpenArray® _{Human MicroRNA Panel QuantStudio} TM _{12K Flex 757 3 1 プレート 4470187* ¥100,000}

TaqMan® _OpenArray® _{Rodent MicroRNA Panel QuantStudio} TM _{12K Flex 757 3 1 プレート 4470188* ¥100,000}

TaqMan® _OpenArray® _{Real-Time Master Mix, 1.5mL 1.5 ml 4462159 ¥14,200}

TaqMan® _OpenArray® _{Real-Time Master Mix, 5mL 5 ml 4462164 ¥42,500}

QuantStudio™ 12K Flex OpenArray® _{Accessories Kit 1キット 4469576 ¥38,900}

* QuantStudio™ 12K Flex リアルタイムPCRシステムで、4470187と4470188をご使用になるためには、4469576が必要です。

リアルタイムPCR解析システム

QuantStudio™ 12K Flex

リアルタイムPCRシステム BiosystemsApplied ®_ViiaTM₇

リアルタイムPCRシステム

■

miRNA

定量用リアルタイム

PCR

Human

TaqMan® _{Array Human MicroRNA Cards}

製品名 サイズ 製品番号 価格

TaqMan® _{Array Human MicroRNA A Card v2.0 4 枚 4398965 ¥202,000}

TaqMan® _{Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0}

A array (4398965) + B Array (4444910)

8 枚

（各4枚） 4444913 ¥260,600

TaqMan® _{Array Human MicroRNA B Card v3.0 4 枚 4444910 ¥202,000} Rodent

TaqMan® _{Array Rodent MicroRNA Cards}

製品名 サイズ 製品番号 価格

TaqMan® _{Array Rodent MicroRNA A Card v2.0 4 枚 4398967 ¥202,000}

TaqMan® _{Array Rodent MicroRNA A+B Cards Set v3.0}

A array (4398967) + B Array (4444899)

8 枚

（各4枚） 4444909 ¥260,600

特定の

miRNA

を検出、定量

特定の

miRNA

を検出する実験は、以前に得られた結果の検証や特 定の

miRNA

についての情報を得たい場合によく実施されます。ラ イフテクノロジーズは、アッセイデザインの最適化により、

TaqMan

® アッセイおよび定量リアルタイム

PCR

のメリットである「高い感度 と特異性、ダイナミックレンジ」を

miRNA

の検出および定量に利用 することに成功しました。

TaqMan

®

_{MicroRNA Assays}

_{には、ターゲット特異的なステムルー}

プ逆転写プライマーが含まれています。この革新的なデザインによ り、低分子の成熟

miRNA

（

~22 nt

）の検出という

miRNA

の定量に おける根本的な問題点に取り組んでいます。このステムループ構造 は、成熟

miRNA

ターゲットのみに特異性を持ち、

miRNA

の

3

’末端 に

RT

プライマー

/

成熟

miRNA

のキメラを形成します。 この少し長い

RT

産物は、標準的な

TaqMan

®_{リアルタイム}

_PCR

_の テンプレートとなります。 ライフテクノロジーズは、ヒトやマウス、ラット、アラビドプシス、

C.

elegans

、ショウジョウバエなど、

Sanger

データベースに登録され ている全生物種の

TaqMan

®

_{MicroRNA Assays}

_{の豊富なコレクシ}

ョンを提供しています。また、

miRBase

データベースが更新される のに伴って、迅速に新規のアッセイを追加しています。

ワークフローの特徴

•

ヒトやマウス、ラット、ショウジョウバ エ、アラビドプシス、

C.

elegans

など、

miRBase

に登 録されてい る生物 種 の 個 別 の

miRNA

の定量に最適です。

•

各 キットには 、ター ゲット の 成 熟

miRN A

に 対して 特 異 的 な

TaqMan

®

_Assays

_{および逆転写プライマーがセットで含まれてい} ます。

•miRBase

に登録されている全

miRNA

へのカバー率を上げるた め、新たなアッセイが継続的に追加されています。

原理

TaqMan

®

_{MicroRNA Assays}

_{では、革新的なターゲット特異的}

なステムループ逆転写プライマーを採用しており、低分子の成熟

miRNA

の検出が困難という問題を解決しています。このプライ マーによってターゲットの

3'

末端に配列が付加された

cDNA

が合 成され、標準的な

TaqMan

®_{リアルタイム}

_PCR

_{のテンプレートを} 形成します。また、プライマー末端のステムループ構造は、生物学 的な活性を持つ成熟

miRNA

を特異的に検出するというこれらの アッセイの重要なメリットとなります（図

5

）。

ターゲット

miRNA

の定量

• mirVana™ miRNA Isolation Kit • TaqMan® _{miRNA ABC}

Purification Kit

• RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE • TaqMan® _MicroRNA

Cells-to-CT™ Kit

• TaqMan® _{MicroRNA Reverse}

Transcription Kit • TaqMan® _{MicroRNA Assays}

• TaqMan® _{Universal Master Mix II}

• TaqMan® _{MicroRNA Assays} • Applied Biosystems

®

リアルタイム PCR システム • Instrument software (included)• RQ Manager enterprise software (optional)

• RealTime StatMiner® _Software

(optional)

30 min 65 min 25 min 90 min Stem-loop

primer microRNA

microRNA

Q F Reverse Transcription Real-Time PCR Stem-loop RT primer Target Sequence Forward Primer

TaqMan® _probe Reverse primer

TaqMan

®

_{テクノロジーが}

_miRNA

_{研究の世界に大きな}

メリットをもたらします

•

高い特異性̶前駆体ではなく生物活性を持つ成熟

miRNA

のみを定量します̶よく似たファミリーに属するホモログの 間の

1

塩基の差異も識別可能です（図

6

）

•

高感度̶わずか

1-10 ng

のトータル

RNA

から検出可能。サ ンプルの節約もできます

•

広いダイナミックレンジ̶最大

7 log

のダイナミックレン ジ̶

1

回の実験で高発現と低発現の

miRNA

を同時に検出 可能です（図

7

）

•

カスタムアッセイが利用可能̶シーケンスを特定して頂け ればライフテクノロジーズがデザインとアッセイを行います

•

迅速、シンプル、スケーラブル̶

2

ステップのリアルタイム

PCR

アッセイが、迅速に高品質な結果をもたらします

図6. TaqMan® _{MicroRNA Assay アプローチ シンプルな2ステップからなる反}

応で、ターゲットmiRNAをリアルタイムPCRで高感度かつ特異的な検出・定量が 可能です。

TaqMan

®

_{MicroRNA Assays}

2

ステップの

TaqMan

®

_{MicroRNA Assays}

_（

_TaqMan

®_{アッセイと}

ターゲットに特異的な逆転写プライマーを含みます）は

Sanger

miRBase

データベースに含まれるほぼ全ての

miRNA

に対してデ ザインされています。ライフテクノロジーズは、

Sanger miRBase

データベースの更新に合わせてアッセイコレクションの数を継続 して増やしています。

TaqMan

®

_{MicroRNA Assays}

_{内在性アッセイ}

ヒト、マウス、ラット、アラビドプシス、

C. elegans

、ショウジョウバ エの内在性コントロールの候補となるアッセイを提供しています。 これらのコントロールは、綿密に選択された低分子ノンコーディ ング

RNA

に対してデザインされています。これらは、さまざまな タイプの細胞や組織、実験条件下で一定レベルの発現を示すこと を確認しています。詳細はアプリケーションノート“

Endogenous

controls for real-time quantitation of miRNA using TaqMan

®

MicroRNA Assays

”をご覧ください。

Custom TaqMan

®

_{Small RNA Assays}

miRNA

研究のために開発された、

TaqMan

®

_{miRNA Assay}

_のデザ

インのノウハウは、

200

ベース以下のさまざまなタイプの低分子核 酸の解析にも利用することが可能です。

Custom TaqMan

®

_Small

RNA Assay

を使用すれば、これらのアッセイのメリットを、さまざ まな生物種の低分子

RNA

に対しても利用できます。例えば、デー タベースにまだ登録されていない新規の

miRNA

や

piRNA

（

piwi-interacting RNA

）や

snRNA

、

snoRNA

のようなさまざまな

small

RNA

に有効です。

miRNA Assays

Mature miRNAs Precursors

Perfectly

matched Ct

Mismatched Ct ∆Ct (mismatch

vs. match) Ct ∆Ct (Precursor vs. mature)

let-7a Looped 16.5 33.1 16.6 29.5 13.0 Linear 23.6 38.3 14.7 30.4 6.8 miRNA Stem-loop RT primer miRNA Linear RT primer

図7. TaqMan® _{MicroRNA Assaysの逆転写反応におけるステムループプライマーが生物活性をもつ成熟miRNAに対する特異性をもたらします}

let-7aに対するステムループRTプライマーを含むデザイン済みTaqMan® _{MicroRNA Assayを、同等の配列を持つリニアなRTプライマー/PCRプライマー/TaqMan}®_プロー

ブのセットと比較しました。次に、成熟let-7aおよび成熟let-7e（let-7aと2塩基だけが異なる近縁のmiRNA）を模した1.5 x 108_{コピーの合成miRNA、ステムループlet-7a前}

駆体を逆転写反応液に添加し、TaqMan® _{MicroRNA AssayのRTステムループプライマーあるいはリニアRTプライマーによるプライミングを行い、リアルタイムPCRで検出}

を行いました。その結果、ステムループRTプライマーでは、成熟miRNAを前駆体miRNAや近縁のmiRNAターゲットからより明確に識別できることを示しました。

Panel A. Amplification Plot

Cycle Quantity

Panel B. Standard Curve

1.0 39 37 35 33 31 29 27 25 23 21 19 17 15 13 11 0.1 ∆ Rn C T 0.01 0 5 10 15 20 25 30 35 40 10 100 1,000 104 105 106 107 108 109 Slope = –3.36 R2 _{= 0.999} 7 copies 70M copies

図8. TaqMan® _{MicroRNA Assaysは最大7 logのダイナミックレンジを示します}

このような広いダイナミックレンジによって、1回の実験で数コピーから数百万コピーまで発現の異なるmiRNAターゲットを正確に定量することが可能になります̶細胞と組織、 または疾患のレベルなどにより、miRNAの発現レベルが大幅に変動することがあります。このようなケースには非常に有効です。TaqMan® _{MicroRNA Assaysのダイナミック}

レンジと感度を示すために、合成lin-4 miRNAを段階希釈し、lin-4 TaqMan® _{MicroRNAアッセイを用いて増幅しました。（A）合成lin-4 miRNAの増幅プロットは7桁のダイナ}

ミックレンジを示しました。PCRにおける合成RNAの投入量は1.3 x 10-3 _{fM（反応当たり7コピーに相当します）から1.3 x 10}4 _{fM（反応当たり7 x 10}7_{コピーに相当します）まで}

Ordering information

：

ターゲット

microRNA

の定量

■

サンプル調製

（

23

∼

25

ページ参照）

mirVana™ miRNA Isolation Kit TaqMan® _{miRNA ABC Purification Kit}

■

microRNA

用

RT

試薬

TaqMan® _{MicroRNA RT Kit}

TaqMan® _{MicroRNA RT Kitは、TaqManR MicroRNA Assaysの逆転写反応試薬です。TaqMan}® _{MicroRNA Assaysに付属しているRTプライマーと組み合わせて逆転} 写反応を行ないます。

製品名 サイズ 製品番号 価格

TaqMan® _{MicroRNA RT Kit 200 反応 4366596 ¥24,300}

TaqMan® _{MicroRNA RT Kit 1,000 反応 4366597 ¥72,800}

■

miRNA

定量用リアルタイム

PCR

TaqMan® _{MicroRNA Assays}

TaqMan® _{MicroRNA Assaysは、リアルタイムPCRでmicroRNA（miRNA）を定量するためのアッセイです。生物学的に活性のある成熟型miRNAを検出} します。

製品名 サイズ 製品番号 価格

TaqMan® _{MicroRNA Assays, Inventoried}

各miRNA特異的RT primer： 5X reaction mix(50サンプル分 / 15 µL反応系)

各miRNA特異的TaqMan® _{Assay： 20X reaction mix (150反応分 / 20 µL反応系)}

販売中の生物種：ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis thaliana、Caenorhabditis elegans、Drosophila melanogaster

50 サンプル・150 反応分 4427975 ¥29,800 TaqMan® _{MicroRNA Assays, Made-to-Order, Extra Small}

各miRNA特異的RT primer： 5X reaction mix(25サンプル分 / 15 µL反応系) 各miRNA特異的TaqMan® _{Assay： 20X reaction mix (75反応分 / 20 µL反応系)}

25 サンプル・75 反応分 4440885 ¥29,600 TaqMan® _{MicroRNA Assays, Made-to-Order, Small}

各miRNA特異的RT primer： 5X reaction mix(50サンプル分 / 15 µL反応系) 各miRNA特異的TaqMan® _{Assay： 20X reaction mix (150反応分 / 20 µL反応系)}

50 サンプル・150 反応分 4440886 ¥39,000 TaqMan® _{MicroRNA Assays, Made-to-Order, Medium 750 サンプル・750 反応分 4440887 ¥78,800}

TaqMan® _{MicroRNA Assays, Made-to-Order, Large 2,900 サンプル・2,900 反応分 4440888 ¥146,500} Custom TaqMan® _{Small RNA Assays}

製品名 サイズ* 製品番号 価格

Custom TaqMan® _{Small RNA Assays, XＳ 25 サンプル・75 反応 4440418 ¥39,800}

Custom TaqMan® _{Small RNA Assays, Ｓ 50 サンプル・150 反応 4398987 ¥50,000}

Custom TaqMan® _{Small RNA Assays,Ｍ 750 サンプル・2,250 反応 4398988 ¥121,200}

Custom TaqMan® _{Small RNA Assays,Ｌ 2,900 サンプル・8,700 反応 4398989 ¥256,600}

QuantStudio™ 3D

デジタルPCRシステム リアルタイムQuantStudio™ 12K Flex PCRシステム リアルタイムQuantStudio™ 7K Flex PCRシステム QuantStudio™ 6 Flex リアルタイムPCRシステム

リアルタイムPCR解析システム

デジタルPCR解析システム

TaqMan® _{Universal Master Mix II}

TaqMan® _{Universal Master Mix IIは、TaqMan技術を利用したさまざまなアプリケーションに使用できるマスターミックス試薬です。TaqMan}®

MicroRNA Assays によるリアルタイムPCR反応の際に使用します。

TaqMan® _{Universal Master Mix II, with UNG}

製品名 サイズ* 製品番号 価格

TaqMan® _{Universal Master Mix II, with UNG 1mL 40反応 4440042 ¥14,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, with UNG 5mL 200反応 4440038 ¥63,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, with UNG 2 x 5mL 400反応 4440044 ¥122,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, with UNG 5 x 5mL 1,000反応 4440045 ¥295,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, with UNG 10 x 5mL 2,000反応 4440046 ¥570,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, with UNG 50mL 2,000反応 4440039 ¥558,000} TaqMan® _{Universal Master Mix II, no UNG}

製品名 サイズ* 製品番号 価格

TaqMan® _{Universal Master Mix II, no UNG 1mL 40反応 4440043 ¥14,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, no UNG 5mL 200反応 4440040 ¥58,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, no UNG 2 x 5mL 400反応 4440047 ¥112,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, no UNG 5 x 5mL 1,000反応 4440048 ¥270,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, no UNG 10 x 5mL 2,000反応 4440049 ¥510,000}

TaqMan® _{Universal Master Mix II, no UNG 50mL 2,000反応 4440041 ¥500,000}

ターゲット遺伝子の mRNAレベルの評価 ターゲットのタンパク質 レベルまたはその他の 生物学的作用の評価 細胞へのトランスフェクション

• mirVana™ miRNA mimics

• mirVana™ miRNA inhibitors • Lipofectamine™ RNAiMAX Transfection Agent • Neon Transfection System

• TaqMan® _{Gene Expression}

Cells-to-CT™ Kit

• TaqMan® _{Gene Expression Assays}

• Applied Biosystems®_{リアルタイム} PCR システム • NuPAGE®_{プレキャストゲルシステム} • iBlot®_{ゲルトランファーシステム} • MagicMark™ XPウエスタンブロッティング  スタンダード miRNA mimicまたは inhibitorを選択

mirVana™ _{miRNA mimic} mirVana™ _{miRNA Inhibitor}

3' 5'

3' 5'

1 2 3 4

原理

•mirVana™ miRNA mimic

および

mirVana™ miRNA inhibitor

は、特 定の

miRNA

を特異的に模倣もしくは阻害するようにデザインさ れており、ターゲット

mRNA

の翻訳を人工的に増加もしくは減 少させるために使用できます。

•miRNA

ターゲットは、

miRNA

の増加や減少に伴う、ターゲットタ ンパク質および

/

もしくは

mRNA

レベルの定量でバリデートされ ています。

•

タンパク質発現への影響を調べる場合にはウェスタン解析が用 いられます。

•miRNA

とそのターゲット部位との相互作用の研究には、レポー ター遺伝子のアッセイが用いられます。

miRNA

の機能を解析する

miRNA

の機能解析では、タンパク質をコードする遺伝子とよく似 た戦略が取られます。培養細胞に人工的な

miRNA mimic

をトラン スフェクションすると、

gain-of-function

の形質を特定することに 役立ちます。また、

loss-of-function

の形質を特定するためには、

miRNA inhibitor

を使った

down-regulation

実験あるいは阻害実 験を実施します。

また、

miRNA

発現の

up-regulation

実験と

down-regulation

実験 の組み合わせは、特定の

miRNA

による制御を受けている遺伝子や 細胞内プロセスを同定するのに利用することができます。

Ambion

®_{（現在はライフテクノロジーズの}

₁

_{ブランド）は、最初に}

miRNA

モジュレーターを提供した会社です。

Ambion

®

_microRNA

mimic

および

inhibitor

は、細胞内の

miRNA

の機能解析を行うツー ルで、

Ambion

®_{によって初めて製品化されました。}

最新の

mir Vana™ miRNA mimic

および

mir Vana™ miRNA

inhibitor

は、特定の

miRNA

を模倣あるいは阻害するようにデザ インされており、それぞれ

gain-of-function

もしくは

loss-of-function

の研究に使用します。どちらも

siRNA

の導入に使用され るソリューションを使ってのトランスフェクションもしくはエレクト ロポレーションによって細胞内に導入することができます。

ワークフローの特徴

•gain-of-function

および

loss-of-function

形質により、

miRNA

で 調節される遺伝子やプロセスを同定します。

•miRNA

ター ゲットのバリデーションには、ウェスタンブロッ ティングまたはリアルタイム

PCR

、もしくはその両方を使用します。

•

ターゲットサイトの相互作用とタンパク質発現に対する評価は、 レポーター遺伝子アッセイおよびイムノディテクションシステム で行うことができます。

microRNA

機能解析

miRNAオリゴ： mirVana™ miRNA mimics & inhibitors

トランスフェクション： Lipofectamine® _RNAiMAX

miRNAオリゴ： mirVana™ miRNA mimics & inhibitors, in vivo ready

トランスフェクション： Invivofectamine® _2.0

miRNA

機能解析

In vitro

microRNA

合成分子

mir

Vana™ miRNA mimics & inhibitors:

•

細胞毒性はありません

•

最新の

miRBase

に対応しています

• in vitro

レベルでは低濃度の導入でも最大の安定した効果を示し ます

• in vitro

および

in vivo

の両方で使用可能です

mir

Vana™ miRNA mimics

mirVana™ miRNA mimics

は化学的に修飾された二本鎖の短い

RNA

分子で（

siRNA

とよく似てはいますが、同じものではありませ ん）、内在性の成熟

miRNA

を模して働くようデザインされていま す。化学修飾により、目的の成熟

miRNA

の正しい鎖が

RISC

（

RNA-induced silencing complex

）に取り込まれます（図

8

）。低分子であ るため、これらの分子はベクターよりも容易にトランスフェクショ ンが可能です。また、導入にあたっては

siRNA

のトランスフェクシ ョンやエレクトロポレーションで使用される条件と同等の条件が 使用できます。

miRNA

発現ベクターと比較するとこれらの合成分 子は、

Dose response

の研究に使用することが可能です。

mir

Vana™ miRNA Inhibitors

mirVana™ miRNA Inhibitor

は化学修飾された一本鎖の核酸で、 内在性の

miRNA

に特異的に結合して阻害するようにデザインされ ています。適当な

miRNA

結合サイトを含むレポーターベクターを 用いてテストを行った場合に、これらの

inhibitor

は、ネガティブコ ントロール

mirVana™ miRNA Inhibitor

を用いた場合と比較して、 平均で約

4

倍のレポーター遺伝子の発現誘導を引き起こします。 このことからターゲット

miRNA

への強力な阻害活性が示唆され ます。

in vivo

研究にも利用可能（

in vivo Ready

製品）

miRNA

解析の

in vivo

研究は近年急成長している分野です。多く の 研究者がより正確な定 量データを得るために

TaqMan

®_ケミ

ストリを利用するようになっており、それが

mir Vana™ mRNA

inhibitor

が

TaqMan

®_{アッセイに完全に対応している理由です（図}

10

）。

mimic

や

inhibitor

のようなオリゴヌクレオチドを

in vivo

で使用す る場合の重要な必要条件の

1

つは、毒性や免疫刺激性を持たない ことです。開発の過程で、

mimic

も

inhibitor

もまったく毒性を示 さないことを確認しています。

miRNA

ライブラリー製品（ヒト用、マウス用）

網羅的な

miRNA

機能解析を行うための

miRNA

ライブラリー製品 もご用意しています。ライブラリーに含まれる

mirVana™ miRNA

mimic

または

inhibitor

は

96

ウェルの各ウェルに

0.25 nmol

が凍 結乾燥された状態で提供されます。これは

50 nM

でトランスフェ クションを行う場合に

50

回分に十分な量に相当します。

mirVana™

miRNA mimic

または

inhibitor

と使 用 するため の

Positive

Control

および

Negative Control

も別途販売しています。

mRNA 5'Cap AAAAAAAAAAAAA3'

5'Cap AAAAAAAAAAAAA3' _{No translation}

Translation 3' 5'

Sequence-specific loading into RISC-like complex miRNA mimic

Complementary binding of specific miRNAs—no RISC-like complex association miRNA

inhibitor

mirVana™ _{miRNA mimics}

mirVana™ miRNA inhibitors 3' 5' 3' 5'

3' 5'

3' 5' 3' 5'

図9. mirVana™ miRNA mimics およびmirVana™ miRNA inhibitors の働き

図11. mir Vana™ miRNA mimicでは、ターゲットmiRNAの配列からなる

mature鎖が特異的に活性を持ち、逆鎖側（star鎖）は不活性化されます

レポーターベクターを用いて、ターゲット鎖（mature鎖）と逆鎖（star鎖）の活 性の比較を行いました。6種類のmiRNAの認識配列に対して、mirVana miRNA

mimicを導入したところ、すべてのケースでmature鎖が高い活性を示しました。

（Negative Controlと比較するとシグナルが5倍から10倍減少しました）一方で star鎖の活性は低い（Negative Controlと同じ）ものでした。

0.00 0 miR 122 NT AldoA m R N A up re gu la tio n %

Hfe2 Slc35a4 Lass6

NEG1 miR

122 NT NEG1 miR122 NT NEG1 miR122 NT NEG1 50 100 150 200 250 300 350 400 450

miRNA122 = miR122 miRNA inhibitor NT =Not transfected

Neg1 = Negative Control #1

Fo ld c ha ng e reporter 1 miRNA

mimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg reporter 2 reporter 3 reporter 4 reporter 5 reporter 6 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 FW RV

図10. mirVana™ miRNA inhibitorはin vivoで効果的にmiRNAを抑制します miR122またはNegative Control #1 mir Vana™ miRNA inhibitorを Invivofectamine® _{2.0試薬と複合体を形成させ、Balb-Cマウスの尾の静脈}

に3日間連続で7 mg/kgで尾静脈投与しました。最後の投与から24時間後に マウスの肝臓のmiR122の4つの細胞内ターゲットの発現レベルをTaqMan®

MicroRNA Assayを使って測定しました。無 処 理のマウスおよびNegative

Controlマウスとの比較で、miR122で処理したマウスの肝臓において、4種すべて のmRNAの有意な発現増加が検出されました。 0.00 0 miR 122 NT AldoA m R N A up re gu la tio n %

Hfe2 Slc35a4 Lass6

NEG1 miR

122 NT NEG1 miR122 NT NEG1 miR122 NT NEG1 50 100 150 200 250 300 350 400 450

miRNA122 = miR122 miRNA inhibitor NT =Not transfected

Neg1 = Negative Control #1

Fo ld c ha ng e reporter 1 miRNA

mimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg miRNAmimic Neg reporter 2 reporter 3 reporter 4 reporter 5 reporter 6 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 FW RV

Ordering information

：

_microRNA

機能解析

■

microRNA

合成分子

mirVana™ miRNA mimic

製品名 サイズ 製品番号 価格

mirVana™ miRNA mimic 5 nmol 4464066 ¥58,000 mirVana™ miRNA mimic 20 nmol 4464067 ¥178,000 mirVana™ miRNA mimic, in vivo Ready 250 nmol 4464070 ¥510,000 Customer-defined mirVana™ miRNA Mimic 5 nmol 4464068 ¥98,000 Customer-defined mirVana™ miRNA Mimic 20 nmol 4464069 ¥180,000 Customer-defined mirVana™ miRNA Mimic, in vivo Ready 250 nmol 4464071 ¥510,000 mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1 5 nmol 4464058 ¥57,000 mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1 20 nmol 4464059 ¥174,000 mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1, in vivo Ready 50 nmol 4464060 ¥250,000 mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1, in vivo Ready 250 nmol 4464061 ¥500,000 mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control 5 nmol 4464062 ¥57,000 mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control 20 nmol 4464063 ¥174,000 mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control, in vivo Ready 50 nmol 4464064 ¥250,000 mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control, in vivo Ready 250 nmol 4464065 ¥500,000 mirVana™ miRNA mimic ライブラリ（miRBase v 20*） 0.25 nmol each 4464074 お問い合わせ

mirVana™ miRNA mimic ライブラリ（miRBase v 20*） 1 nmol each 4464075 お問い合わせ

* 2014年4月現在

mirVana™ miRNA inhibitor

製品名 サイズ 製品番号 価格

mirVana™ miRNA inhibitor 5 nmol 4464084 ¥58,000 mirVana™ miRNA inhibitor 20 nmol 4464085 ¥178,000 mirVana™ miRNA inhibitor, in vivo ready 250 nmol 4464088 ¥510,000 Customer-defined mirVana™ miRNA Inhibitor 5 nmol 4464086 ¥98,000 Customer-defined mirVana™ miRNA Inhibitor 20 nmol 4464087 ¥180,000 Customer-defined mirVana™ miRNA Inhibitor, in vivo ready 250 nmol 4464089 ¥510,000 mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 5 nmol 4464076 ¥57,000 mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 20 nmol 4464077 ¥174,000 mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 , in vivo Ready 50 nmol 4464078 ¥250,000 mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 , in vivo Ready 250 nmol 4464079 ¥500,000 mirVana™ miRNA Inhibitor let-7 Positive Control 5 nmol 4464080 ¥57,000 mirVana™ miRNA Inhibitor let-7 Positive Control 20 nmol 4464081 ¥174,000 mirVana™ miRNA inhibitor ライブラリ（miRBase v 20*） 0.25 nmol each 4464092 お問い合わせ

mirVana™ miRNA inhibitor ライブラリ（miRBase v 20*） 1 nmol each 4464093 お問い合わせ