RNA RNA

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ に よ る に よ る に よ る に よ る RNA

RNA RNA

RNA 干 渉 干 渉 を 干 渉 干 渉 を を を 利 用 利 用 利 用 利 用 し た し た し た 治 療 標 的 分 子 し た 治 療 標 的 分 子 治 療 標 的 分 子 治 療 標 的 分 子 の の の の 探 索 探 索 探 索 探 索

RNA RNA RNA

RNA iiiinterference nterference nterference----based s nterference based s based s based screening creening creening creening for m

for m for m

for molecular olecular olecular olecular ttttargets argets argets argets using a c

using a c using a c

using a cell ell ell ell ttttransfection ransfection ransfection a ransfection a array a rray rray rray

2009 2009 2009

2009 年 年 年 年 7 7 7 7 月 月 月 月

早 稲 田 大 学 大 学 院 早 稲 田 大 学 大 学 院 早 稲 田 大 学 大 学 院

早 稲 田 大 学 大 学 院 理 工 学 研 究 科 理 工 学 研 究 科 理 工 学 研 究 科 理 工 学 研 究 科

本 間 本 間 本 間

本 間 紀 美 紀 美 紀 美 紀 美

目 次 目 次 目 次 目 次

図 表 一 覧 4

略 語 表 6

[[[[

第第第第

1 1 1 1

章章章章

]]]]

序 論序 論序 論序 論

8

1-1 ゲ ノ ム 創 薬 の 現 状 8

1-2 遺 伝 子 機 能 解 析 10

1-3 低 分 子 化 合 物 か らRNAi医 薬 へ の 展 開 11

1-4 本 研 究 の 取 り 組 み 18

[[[[

第第第第

2 2 2 2

章章章章

]]]]

治 療 標 的 分 子 探 索治 療 標 的 分 子 探 索治 療 標 的 分 子 探 索治 療 標 的 分 子 探 索 の た め のの た め のの た め のの た め の

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ ののの 開 発の開 発開 発開 発

¹⁹

2-1 バ イ オ マ テ リ ア ル に よ る 核 酸 導 入 技 術 19

2-2 方 法 20

2-3 セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ の 開 発 22 2-4 セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ の 特 長 27 2-5 (解 析 例1) マ ウ ス 小 脳 形 成 期 発 現 遺 伝 子 の 機 能 解 析 31 2-6 (解 析 例2) 肝 が ん 発 現 上 昇 遺 伝 子 の 機 能 解 析 31

2-7 小 括 32

[[[[

第第第第

3 3 3 3

章章章章

]]]]

RNAi RNAi RNAi RNAi

に よ るに よ るに よ るに よ る

in vitro in vitro in vitro in vitro

^、、、、

in vivo in vivo in vivo in vivo

遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析 とととと

標 的 分 子 探 索

標 的 分 子 探 索 標 的 分 子 探 索

標 的 分 子 探 索 のののの 戦 略戦 略戦 略戦 略

³⁷

3-1 RNAiに よ る 遺 伝 子 機 能 解 析 37

3-2 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン に よ るsiRNAデ リ バ リ ー 40

3-3 方 法 41

3-4 RNAi－ セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ 43

3-7 siRNAデ リ バ リ ー の 課 題 51 3-8 RNAiに よ るin vitro^、in vivo遺 伝 子 機 能 解 析 と 標 的 分 子 探 索

の 戦 略

52

[[[[

第第第第

4 4 4 4

章章章章

]]]]

大 腸大 腸大 腸大 腸 が んが んが んが ん 治 療 標 的 分 子治 療 標 的 分 子治 療 標 的 分 子治 療 標 的 分 子 のののの 同 定同 定同 定同 定

55

4-1 大 腸 が ん の 現 状 と 課 題 55

4-2 方 法 58

4-3 大 腸 が ん 組 織 の 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル 61 4-4 大 腸 が ん 治 療 標 的 分 子 の ス ク リ ー ニ ン グ 67 4-5 大 腸 が ん 細 胞 株 、 腫 瘍 組 織 に お け る 、PSMA7お よ びRANの

発 現

73

4-6 PSMA7お よ びRAN発 現 と 大 腸 が ん 転 移 の 関 連 76

4-7 PSMA7 siRNA、RAN siRNA投 与 に よ る ア ポ ト ー シ ス 誘 導 77

4-8 小 括 79

[[[[

第第第第

5 5 5 5

章章章章

]]]]

薬 剤 耐 性 乳薬 剤 耐 性 乳薬 剤 耐 性 乳薬 剤 耐 性 乳 が ん のが ん のが ん のが ん の 治 療 標 的 分 子治 療 標 的 分 子治 療 標 的 分 子治 療 標 的 分 子 ののの 同 定の同 定同 定同 定

83

5-1 乳 が ん の 現 状 と 課 題 83

5-2 方 法 85

5-3 乳 が ん 組 織 の 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル 88 5-4 薬 剤 耐 性 関 連 分 子 の ス ク リ ー ニ ン グ 90 5-5 ド セ タ キ セ ル に よ るRPN2発 現 誘 導 94

5-6 RPN2 siRNAの 抗 腫 瘍 効 果 96

5-7 薬 剤 耐 性 化 に お け るRPN2の 機 能 98

5-8 臨 床 応 用 へ の 可 能 性 103

5-9 小 括 106

[[[[

第第第第

6 6 6 6

章章章章

]]]]

総 括総 括総 括総 括 とととと 展 望展 望展 望展 望

110

6-1 総 括 110

6-2 展 望 114

謝 辞 120

参 考 文 献 121

研 究 業 績 一 覧 134

図 表 一 覧 図 表 一 覧 図 表 一 覧 図 表 一 覧

図 1-1 ゲノム創 薬 のプロセス 9

図 1-2 Druggable genomeの概 念 11

表 1-1 RNAi医 薬 と低 分 子 化 合 物, 抗 体 ・タンパク質 医 薬 の比 較 13

表 1-2 RNAi医 薬 品 の開 発 状 況 17

図 2-1 アテロコラーゲンと核 酸 複 合 体 の形 成 と核 酸 導 入 効 率 23

図 2-2 リバーストランスフェクション法 の開 発 25

図 2-3 セルトランスフェクションアレイによるハイスループット遺 伝 子 機

能 解 析

26

図 2-4 セルトランスフェクションアレイによる核 酸 導 入 29

図 2-5 セルトランスフェクションアレイの特 長 30

図 2-6 トランスフェクションアレイのシステム 33

図 2-7 セルトランスフェクションアレイによる遺 伝 子 機 能 解 析 と医 療 へ の応 用

36

図 3-1 RNAiのメカニズム 38

図 3-2 ルシフェラーゼ発 現MCF7-ADR細 胞 におけるルシフェラーゼの

ノックダウン

45

図 3-3 HT-29細 胞 における内 在 性GAPDHのノックダウン 45

表 3-1 アテロコラーゲンによるsiRNAのin vivo デリバリー 47

図 3-4 B16F10メラノーマ皮 下 腫 瘍 へのsiRNA腫 瘍 内 投 与 48

図 3-5 FGF-4 siRNAの腫 瘍 内 投 与 による，NEC8精 巣 腫 瘍 の増 殖 抑 制

48

図 3-6 PC3前 立 腺 がん骨 転 移 巣 への尾 静 脈 投 与 によるsiRNAデリ バリー

50

図 3-7 RNAi による遺 伝 子 機 能 解 析 と標 的 分 子 探 索 の戦 略 54

図 4-1 大 腸 がん治 療 標 的 分 子 探 索 の戦 略 57

表 4-1 siRNA配 列 58

表 4-2 大 腸 がん組 織 で発 現 上 昇 していた97遺 伝 子 62-66

図 4-2 ヒト大 腸 がん組 織 発 現 上 昇 遺 伝 子 の機 能 スクリーニング 68-69

図 4-3 PSMA7 siRNA, RAN siRNAによる, HT-29細 胞 のアポトーシ ス誘 導

70

図 4-4 PSMA7 siRNA，RAN siRNAによるmRNA発 現 抑 制 72 図 4-5 大 腸 がん細 胞 株, 腫 瘍 組 織 における, PSMA7 mRNAおよび

RAN mRNAの発 現

74-75

表 4-3 PSMA7，RAN発 現 と大 腸 がん転 移 の関 連 76

図 4-6 HT-29腫 瘍 へのPSMA7 siRNA, RAN siRNAの投 与 による, アポトーシス誘 導

78

図 5-1 RNAiによる薬 剤 耐 性 乳 がんの新 規 標 的 分 子 同 定 の戦 略 84 表 5-1 ドセタキセル非 感 受 性 乳 がん患 者 組 織 で発 現 上 昇 していた 36

遺 伝 子

89

図 5-2 RNAiによる機 能 スクリーニング 91

図 5-3 RPN2 siRNAの導 入 による，MCF7-ADR細 胞 のアポトーシス 誘 導

92

図 5-4 MCF7-ADR細 胞 へのRPN2 siRNAの導 入 による, RPN2のノ ックダウン

93

図 5-5 ドセタキセル処 理 による, RPN2 mRNAとMDR1 mRNAの発 現 誘 導

95

図 5-6 乳 がんモデルへのRPN2 siRNA投 与 による抗 腫 瘍 効 果 97

図 5-7 RPN2 siRNAによるP-gpの糖 鎖 修 飾 阻 害 100-101

図 5-8 RPN2によるドセタキセル耐 性 化 のメカニズム 102

図 5-9 ヒト乳 がん組 織 における RPN2 発 現 と P-gp の分 布 104 表 5-2 ヒト乳 がん組 織 における RPN2 発 現 と P-gp の分 布 104 表 5-3 乳 がん組 織 と正 常 組 織 におけるRPN2タンパク質 の発 現 量 105

図 6-1 miRNA機 能 解 析 と創 薬 116

略 語 表 略 語 表 略 語 表 略 語 表

RNAi RNA interference (RNA干 渉) siRNA small interfering RNA RO5 rule of 5

PTGS post-transcriptional gene silencing (転 写 後 遺 伝 子 サ イ レ ン シ ン グ) VIGS viral-induced gene silencing (ウ ィ ル ス 誘 発 性 遺 伝 子 サ イ レ ン シ ン グ) wet AMD wet age-related macular degeneration (滲 出 型 加 齢 性 黄 斑 変 性 症) VEGF vascular endothelial growth factor (血 管 内 皮 増 殖 因 子)

RSV respiratory syncytial virus (呼 吸 器 多 核 体 ウ ィ ル ス) HBV hepatitis B virus (B型 肝 炎 ウ ィ ル ス)

PCSK9 proprotein convertase subtilisin/kexin 9

FGF-4 fibroblast growth factor-4 (線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子-4) DDS drug delivery system (ド ラ ッ グ デ リ バ リ ー シ ス テ ム)

EGFP enhanced-green fluorescence protein (高 感 度 緑 色 蛍 光 タ ン パ ク 質) RISC RNA induced silencing complex

GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase EPR効 果 enhanced permeation and retention effect

VEGFR vascular endothelial growth factor receptor (血 管 内 皮 増 殖 因 子 受 容 体) EGFR epidermal growth factor receptor (上 皮 増 殖 因 子 受 容 体)

TRAIL tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (腫 瘍 壊 死 因 子

関 連 ア ポ ト ー シ ス 誘 発 リ ガ ン ド) PSMA7 proteasome subunit α-type 7 RAN ras-related nuclear protein

HBX hepatitis B virus X protein (B型 肝 炎 ウ ィ ル スXタ ン パ ク 質) IRES internal ribosomal entry site

NF-kB nuclear factor-kB

GTP guanosine triphosphate (グ ア ノ シ ン 三 リ ン 酸) GDP guanosine diphosphate (グ ア ノ シ ン 二 リ ン 酸) Bax Bcl-2-associated X protein

WHO World Health Organization (世 界 保 健 機 関) CR complete response (完 全 寛 解)

PR partial response (部 分 寛 解) NC no change (不 変)

PD progressive disease (進 行) RPN2 ribophorin II

OST oligosaccharyl transferase (オ リ ゴ 糖 転 移 酵 素) P-gp P-glycoprotein (P-糖 タ ン パ ク 質)

PKC protein kinase C (プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼC) MRP1 multidrug resistance-associated protein 1 MRP2 multidrug resistance-associated protein 2 BCRP breast cancer resistance protein

miRNA microRNA

ヒ ト 遺 伝 子 は 、HUGO遺 伝 子 命 名 法 に 従 っ て 記 載 し て い る 。

1 1

1 1----1 1 1 1

ゲ ノ ムゲ ノ ム 創 薬ゲ ノ ムゲ ノ ム創 薬創 薬創 薬 のののの 現 状現 状現 状現 状

2001

年 の ヒ ト ゲ ノ ム 解 読 以 降 、ゲ ノ ム 情 報 を も と に 、種 々 の 疾 患 に お け

る 遺 伝 子 発 現 解 析 が 実 施 さ れ 、 疾 患 や 病 態 と 遺 伝 子 発 現 の 関 係 が 明 ら か に な り つ つ あ る 。 そ し て 、 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 利 用 し て 、 疾 患 ・ 病 態 の 原 因 と な る 分 子 、 治 療 標 的 分 子 を 探 索 し 、 薬 剤 を 創 出 す る 試 み が な さ れ て き た 。い わ ゆ る「 ゲ ノ ム 創 薬 」で あ る

(

図図図図

1 1 1 1----1 1 1 1)

。新 薬 の 開 発 プ ロ セ ス は ゲ ノ ム 創 薬 へ と シ フ ト し た も の の 、 し か し な が ら 、 当 初 期 待 さ れ た よ う な 迅 速 か つ 高 効 率 の 新 薬 開 発 に は つ な が ら ず 、 現 在 ま で に 有 望 な 新 薬 と し て 認 知 さ れ た も の は 少 な い 。 ゲ ノ ム 創 薬 に は 多 く の 課 題 が 残 さ れ て い る が 、 本 研 究 で は 、そ の 課 題 の

1

つ 、遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル で 抽 出 さ れ る 遺 伝 子 の ハ イ ス ル ー プ ッ ト 機 能 解 析 法 の 確 立 を 目 指 し た 。 ま た 、 従 来 型 低 分 子 化 合 物 医 薬 に よ る 制 御 が 可 能 な 治 療 標 的 遺 伝 子 産 物 は 、 極 め て 少 な い と 推 定 さ れ お り 、

RNA

干 渉

(RNA interference

：

RNAi)

を 利 用 し た 、 新 し い 創 薬 概 念 に よ る 薬 剤 の 創 出 が 期 待 さ れ て い る 。

siRNA (small interfering RNA)

の 発 明 は 、

Loss-of-function

の 画 期 的 な 遺 伝 子 機 能 解 析 手 法 を も た

ら し た と 同 時 に 、遺 伝 子 発 現 レ ベ ル で 治 療 標 的 分 子 を 制 御 す る

RNAi

医 薬 の 開 発 に つ な が っ た 。 本 研 究 で は 、

RNAi

に よ る

in vivo

^、

in vitro

^{の 遺 伝} 子 機 能 解 析 技 術 を 確 立 し 、 さ ら に 、 が ん 治 療 標 的 分 子 の 探 索 を 実 践 し て 、

RNAi

医 薬 の 新 規 標 的 分 子 を 同 定 し た 。

[[[[

第第第第

1 1 1 1

章章章章

]]]]

序 論序 論序 論序 論

図 図 図

図 1-1 ゲノムゲノムゲノムゲノム 創 薬創 薬創 薬創 薬 のののの プロセスプロセスプロセスプロセス

ゲノム情 報 をもとに，バイオインフォマティクス，mRNA 発 現 プロファイル，タンパク質 発 現 プ ロ フ ァ イ ル な ど の 手 法 で ， 疾 患 ・ 病 態 に 関 与 す る 遺 伝 子 候 補 を 抽 出 す る ． 抽 出 し た 遺 伝 子 に つ い て 、 セ ル ベ ー ス ア ッ セ イ で 機 能 解 析 し て ， 標 的 分 子 候 補 を 選 抜 し ， さ ら に 疾 患 モ デ ル 動 物 で 検 証 す る ． 治 療 標 的 分 子 と 判 断 さ れ た ら ， そ の 分 子 を 制 御 す る 薬 剤 の リ ー ド 化 合 物 を ス ク リ ー ニ ン グ す る ． リ ー ド 化 合 物 の 最 適 化 ， 安 全 性 薬 理 試 験 ， 臨 床 試 験 を 経 て ， 分 子 標

臨床試験 安全性薬 理

試験

分子標的 薬 上市 化合物

最適化

バイオ イン フ ォマテ ィ クス mRNA発現 プロ フ ィル タンパ ク質発 現プ ロ フィ ル ゲノム 情報

標的分子 候補の 選抜

疾患モ デ ル動物

スクリー ニン グ 標的分子 の検証

化合物 セルベ ースア ッ セ イ

遺伝子機 能解析 遺伝子の 抽出

臨床試験 安全性薬 理

試験

分子標的 薬 上市 化合物

最適化

臨床試験 安全性薬 理

試験

分子標的 薬 上市 化合物

最適化

バイオ イン フ ォマテ ィ クス mRNA発現 プロ フ ィル タンパ ク質発 現プ ロ フィ ル ゲノム 情報

標的分子 候補の 選抜

疾患モ デ ル動物

スクリー ニン グ 標的分子 の検証

化合物 セルベ ースア ッ セ イ

遺伝子機 能解析 遺伝子の 抽出

バイオ イン フ ォマテ ィ クス mRNA発現 プロ フ ィル タンパ ク質発 現プ ロ フィ ル ゲノム 情報

標的分子 候補の 選抜

疾患モ デ ル動物

スクリー ニン グ 標的分子 の検証

化合物 セルベ ースア ッ セ イ

遺伝子機 能解析 遺伝子の 抽出

1 1

1 1----2 2 2 2

遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析

遺 伝 子 の 機 能 解 析 で は 、 培 養 細 胞 や 疾 患 モ デ ル 動 物 に お い て 、 対 象 遺 伝 子 を 発 現

(Gain-of-function)

、あ る い は 発 現 抑 制

(Loss-of-function)

さ せ 、 そ の 表 現 型 の 変 化 か ら 遺 伝 子 機 能 を 推 定 す る 。 ゲ ノ ム 創 薬 に お い て 、 遺 伝 子 機 能 解 析 は 、 疾 患 ・ 病 態 の 原 因 と な る 分 子 、 治 療 標 的 分 子 を 同 定 す る た め の 最 も 重 要 な ス テ ッ プ で あ る 。 し か し 、

DNA

マ イ ク ロ ア レ イ や 超 高 速 シ ー ク エ ン サ ー の 出 現 な ど 、 遺 伝 子 発 現 解 析 技 術 が 急 速 な 進 歩 を 遂 げ た 反 面 、遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル よ り 抽 出 さ れ る 個 々 の 遺 伝 子 の 機 能 に つ い て 、 正 確 か つ 高 効 率 に 解 析 す る 手 法 は 確 立 さ れ て お ら ず 、 ゲ ノ ム 創 薬 の 障 壁 と な っ て い る 。 遺 伝 子 機 能 の 網 羅 的 解 析 が 困 難 な た め 、 多 く は 、 発 現 解 析 に よ り 抽 出 さ れ た 多 数 の 遺 伝 子 を デ ー タ ベ ー ス 検 索 し 、 期 待 さ れ る 機 能 を 持 つ 少 数 の 遺 伝 子 に 選 抜 し た う え で 、 そ の 機 能 を 調 べ る と い う 、 あ る 種 の バ イ ア ス が か か っ た 遺 伝 子 機 能 解 析 が 行 わ れ て き た 。 だ が 、 こ の 方 法 で は 選 抜 さ れ な か っ た 他 大 多 数 の 遺 伝 子 に つ い て 、 機 能 を 解 明 す る こ と は で き な い 。 ま た 、 期 待 さ れ る 機 能 を 持 つ 遺 伝 子 に は じ め か ら 絞 り 込 ん で し ま っ て は 、他 の 遺 伝 子 の 持 つ 新 規 機 能 や 新 規 標 的 分 子 を 突 止 め る こ と は で き な い 。 よ っ て 、 網 羅 的 な 遺 伝 子 機 能 解 析 を 可 能 に す る シ ス テ ム の 開 発 が 急 務 で あ る 。

本 研 究 で は 、 こ の 課 題 を 克 服 す べ く 、 細 胞 レ ベ ル で ハ イ ス ル ー プ ッ ト に 遺 伝 子 機 能 を 解 析 す る シ ス テ ム 「 セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ 」 を 開 発 し た 。

1 1

1 1----3 3 3 3

低 分 子 化 合 物低 分 子 化 合 物 か ら低 分 子 化 合 物低 分 子 化 合 物か らか らか ら

RNAi RNAi RNAi RNAi

医 薬医 薬 へ の医 薬医 薬へ のへ のへ の 展 開展 開展 開展 開

Hopkins

ら が 提 唱 し た

“druggable genome”

の 概 念 に よ る と ¹⁾、従 来 型

の 低 分 子 化 合 物 医 薬 で 制 御 可 能 な 遺 伝 子 産 物 は 極 め て 少 な い

(

図図図図

1 1 1 1----2 2 2 2)

。

“Druggable genome”

と は 、

Lipinski

の

rule of 5 (RO5)

^{注1-1), 2)} に 基 づ く

薬 剤 化 合 物 が 相 互 作 用 可 能 な 遺 伝 子 産 物 を 、そ の 高 次 構 造 お よ び 機 能 か ら 、 創 薬 タ ー ゲ ッ ト

“druggable targets”

と し て 同 定 ・ 分 類 し よ う と す る 概 念 で あ る 。こ れ に よ る と 、

“druggable targets”

を コ ー ド す る 遺 伝 子 は 、多 く が 細 胞 膜 受 容 体 や 良 く 定 義 さ れ た 酵 素 で あ り 、 全 遺 伝 子中、

3,000

遺 伝 子 余り で あ る 。そ し て 、そ の中で 病 態 に 大 き く影 響す る 創 薬 標 的 分 子

“drug targets”

を コ ー ド す る 遺 伝 子 は 、

1,500

遺 伝 子 に満た な い と 推 定 さ れ て い

る 。 し た が っ て 、 遺 伝 子 の 発 現 を直 接制 御 で き る 、

RNA

干 渉 医 薬

(RNAi

医 薬

)

の よ う な 新 し い 創 薬 概 念 に よ る 薬 剤 が注目 さ れ て い る 。

図 図 図

図 1-2 Druggable genomeのののの 概 念概 念概 念概 念

ヒトゲノム22,000 遺伝子

Druggable

~ 3,000 遺伝子

疾患関連

~ 3,000 遺伝子 Drug targets

~ 1,500 遺伝子

新しい創薬概念

RNAi医薬

低分子化合物の創薬標的は1,500 遺伝子に満たない ヒトゲノム22,000 遺伝子

Druggable

~ 3,000 遺伝子

疾患関連

~ 3,000 遺伝子 Drug targets

~ 1,500 遺伝子

新しい創薬概念

RNAi医薬

低分子化合物の創薬標的は1,500 遺伝子に満たない

RNA

干 渉

(RNAi)

は 、植物 で見つ か っ た転 写 後遺 伝 子 サ イ レ ン シ ング

(post-transcriptional gene silencing

：

PTGS)

あ る い は 、ウ ィル ス誘発性

遺 伝 子 サ イ レ ン シ ング

(viral-induced gene silencing

：

VIGS)

と い う 現 象 を 手 が か り と し て 発見さ れ た 。

RNAi

の 発見で 、

2006

年 の ノ ー ベ ル 医学 生 理 学 賞を 受賞し た

Fire

と

Mello

が 、線 虫で 初 め て

RNAi

の誘 導に成 功し た し た の は

1998

年 の こ と で あ る ³⁾。 そ の後、ゼ ブラ フィッ シュ、 シ ョウ ジョウバ エ な ど さ まざま な 種 で

RNAi

が 確 認 さ れ た 。

2001

年 に は 、

Tuschl

ら が 、

siRNA (small interfering RNA)

に よ る配 列 特 異的

mRNA

の 分 解 で 、 哺 乳動 物 細 胞 に お け る

RNAi

に よ る 遺 伝 子 発 現 抑 制 法 を 確 立 し た ⁴⁾。

Tuschl

ら の 発 明 は 、

Loss-of-function

の 画 期 的 な 遺 伝 子 機 能 解 析 手 法 を も

た ら し た と 同 時 に 、遺 伝 子 発 現 を人 為的 に直 接制 御 す る

RNAi

医 薬 の 開 発 に つ な が っ た 。

RNAi

医 薬 の 出 現 は 、 化 合 物 に よ る 制 御 が 困 難 な 分 子

“undruggable targets”

を も 治 療 標 的 と す る こ と を 可 能 と し 、 創 薬 の世 界

を 大 き く広げ た 5)

(

表表表表

1 1 1 1----1 1 1 1)

。こ の

RNAi

に先行 し て 進 ん で い た の が 同 じ核 酸医 薬 と し て 開 発 さ れ て い た ア ンチセ ン ス 医 薬 で あ る 。 し か し 、副作 用 を 上 回るほど の 有 効性を示す臨 床 上の結 果が得ら れ ず 、 最終的 な承認 に届か な か っ た例が 多 い 。

RNAi

医 薬 は 、 そ の 抑 制 の 確 か さ か ら 、 ア ンチセ ン ス 医 薬 に比べ 、 実 用 化 に お い て優 位で あ る と考え ら れ て い る 。一方 で 、 そ の 研 究 の歴 史が浅い故に 、メ カ ニ ズム を完全 に 解 明 で き た と は言え ず 、思わ ぬ 副作 用 を招く こ と が な い よ う 、臨 床 応用 に は慎重 さ が求め ら れ る の も事 実 で あ る 。

表表

表表 1-1 RNAi医 薬医 薬医 薬医 薬 とととと 低 分 子 化 合 物低 分 子 化 合 物低 分 子 化 合 物低 分 子 化 合 物, 抗 体抗 体 ・抗 体抗 体・・ タンパク・タンパクタンパク 質タンパク質質 医 薬質医 薬医 薬医 薬 のののの 比 較比 較比 較比 較

RNAi 医 薬 は ， 全 て の 遺 伝 子 産 物 を 標 的 と す る こ と が 可 能 で ， 特 異 性 が 高 い ． ま た 、 リ ー ド 化 合 物 の選 抜 、最 適 化 が迅 速 である

5)

．

低分子化合物 抗体, タンパク質 RNAi

○

アゴニズム, アンタゴニズム ^○アゴニズム, アンタゴニズム ^○アンタゴニズム

○細胞外標的,　細胞内標的 ^○細胞外標的 ^○全ての遺伝子産物

○

標的分子の種類によっては, 高特異性化合物の創出が困難

○高特異性 ^○高特異性

○リード化合物の選抜, 最適化が 遅い

○リード化合物の選抜, 最適化が 遅い

○リード化合物の選抜, 最適化が 迅速

○合成が容易 ^○作製が煩雑 ^○合成が容易

表 表 表

表

1 1 1 1----2 2 2 2

は 、現 在 開 発中の

RNAi

医 薬 を示し て い る ⁶⁾。滲出 型加 齢 性 黄 斑 変性 症

(wet age-related macular degeneration

：

wet AMD)

、臓 器機 能 障 害、ウ ィル ス感 染 症、 が ん 、 高 コ レ ス テ ロ ー ル血 症、神 経疾 患 な ど様々 な 疾 患 へ の適用 が 検討さ れ て い る 。最 初 に臨 床試験が 実 施 さ れ た

RNAi

医 薬 は 、

wet AMD

を 対 象 疾 患 と す る 、

VEGF (vascular endothelial growth factor

：血 管 内 皮 増 殖因 子

)

標 的

siRNA (Bevasiranib

、

OPKO Health

社

)

で あ る 。

VEGF

は 、

wet AMD

の 進 行 に 関与す る血 管新生の主要 な促進 因 子 で 、

VEGF

経 路を介し た血 管新生の阻 害が 、

wet AMD

治 療 薬 開 発 の中 心 戦 略と な っ て い る 。そ の後、

VEGF

受 容 体

(VEGFR)

を 標 的 と す る

RNAi

医 薬

(Sirna-027

、

Merck-Sirna Therapeutics)

の臨 床開 発 も 開始さ れ た 。

Bevasiranib

の 開 発 は 、安全性に は問題 が な か っ た も の の 、主要 エ ン ドポ

イ ン ト

(primary end point)

を達 成で き る 可 能性が 低 い と の判 断か ら フ ェ ーズ

III

で中止 さ れ た

(2009

年

3

月

)

。

Sirna-027

は 、 現 在 、 フ ェ ーズ

II

試験が 進 行中で あ る 。こ れ ら

VEGF

経 路の阻 害剤 の よ う に 、既 存の抗体 医 薬 や 低 分 子 化 合 物 医 薬 が存在 す る 疾 患 に お け る

RNAi

医 薬 の 開 発 は 、既 存 薬 に比べ て優 位 性を示す こ と が 重 要 に な る で あろう 。

特に 多 く の 開 発 が 行 わ れ て い る の は 、抗 ウ ィル ス

RNAi

医 薬 で あ る 。ウ ィル ス は 、 低 分 子 化 合 物 へ の 薬 剤耐 性を獲 得し や す く 、 遺 伝 子配 列が ヒ ト と 大 き く異な る た め 、ウ ィル ス の 遺 伝 子 を 標 的 と す る

RNAi

医 薬 が 有 望 な 治 療 薬 と な る と考え ら れ て い る 。 現 在 、抗

RSV (respiratory syncytial virus

： 呼 吸 器 多 核 体 ウ ィ ル ス

)

薬

(ALN-RSV01

、

Alnylam Pharmaceuticals

社、フ ェ ーズ

II)

、抗

HBV (hepatitis B virus

：

B

型肝 炎

ウ ィル ス

)

薬

(NUC B1000

、

Nucleonics

、 フ ェ ーズ

I)

な ど の 開 発 が 進 行

中で あ る 。

RNAi

医 薬 のリー ディング カンパ ニー で あ る

AlnylamPharmaceuticals

社は 、

“undruggable targets”

に着目 し た 創 薬 を 行 っ て い る 。

PCSK9

（

proprotein convertase subtilisin/kexin 9

）は 、

LDL

コ レ ス テ ロ ー ル の 代 謝に 関与し 、

PCSK9

活 性の上 昇が

LDL

コ レ ス テ ロ ー ル を増 加さ せ る こ と か ら 、高 コ レ ス テ ロ ー ル血 症を引き起こ す 分 子 で あ る と考え ら れ て い る 。

PCSK9

は 、

“undruggable targets”

と 考 え ら れ て い る が 、

AlnylamPharmaceuticals

社は 、 そ の

siRNA

薬

(ALN-PCS

、前 臨 床

)

の

開 発 を 実 施 し て い る 。 そ の 他 、 ハ ンチン ト ン 病 を 対 象 疾 患 と し 、

“undruggable targets”

の 変異ハ ンチン ト ン を 標 的 と す る

RNAi

医 薬

(ALN-HTT

、前 臨 床

)

の 開 発 も 行 わ れ て い る 。

一方 、独 自の 治 療 コ ン セ プ ト に 基 づ く 、

RNAi

医 薬 も 創 出 さ れ て い る 。

Quark Pharmaceuticals

社は 、

wet-AMD

の 治 療 薬 と し て 、抗

RTP801 siRNA

薬

(PF-4523655

、フ ェ ーズ

II)

を臨 床試験 中で あ る 。

RTP801

は 、

VEGF

経 路と は異な る経 路で

wet-AMD

の 進 行 に 関与す る 分 子 で 、新 規 標

的 分 子 で あ る 。 ま た 、 同社は 、今ま で に根本 的 治 療 薬 が存在 し な か っ た 、 急性 腎 臓 損 傷

(AKI)

、臓 器 移 植 後 臓 器機 能 障害

(DGF)

の

siRNA

治 療 薬

(QPI-1002

、 フ ェ ーズ

I/II)

の 治験を 行 っ て い る 。

QPI-1002

は 、

p53

を 標

的 と す る

siRNA

で 、

p53

の 発 現 を一時 的 に阻 害し て 、正常細 胞 を 急激な損 傷か ら保 護す る と い う 、 新 し い コ ン セ プ ト の 治 療 薬 で あ る 。

RNAi

医 薬 は 、 ま だ 治験 段 階に あ る が 、 数 年 以内に上 市さ れ る と予 測さ

迅 速 な こ と か ら 、今 後も

RNAi

医 薬 の 開 発 は増 加す る と考え ら れ る 。特に 、

“undruggable targets”

を 標 的 と す る も の や 、 新 規 治 療 コ ン セ プ ト に 基 づ

く 治 療 薬 が 創 出 さ れ て 行 く で あろう 。

本 研 究 で は 、 疾 患 の 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を も と に 、

RNAi

を 利 用 し た

in vivo

^、

in vitro

の 遺 伝 子 機 能 解 析 に よ っ て 、 新 規 か つユ ニー ク な 治 療 標 的 分 子 の 探 索 を 行 い 、 さ ら に

RNAi

医 薬 へ の応用 を 検討し た 。

薬品薬品薬品薬品のののの開発状況開発状況開発状況開発状況 siRNA標的分子対象疾患開発ステージ BevasiranibVEGF滲出型加齢性黄斑変性症フェーズIIIで中 糖尿病性黄斑浮腫フェーズII herapeuticsSirna-027VEGFR1滲出型加齢性黄斑変性症フェーズII aceuticals, PF-4523655RTP801 (DDIT4)滲出型加齢性黄斑変性症フェーズII peutics糖尿病性黄斑浮腫フェーズII aceuticalsQPI-1002P53 (TP53)急性腎不全フェーズI/IIa 臓器移植後臓器機能障害フェーズI/II QPI-1007非公開非動脈炎性虚血性視神経症IND 緑内障IND aceuticalsALN-RSV01ヌクレオカプシド (N)RSウイルスフェーズII ALN-VSPKSP (KIF11), VEGF肝がんフェーズI ALN-PCSPCSK9高コレステロール血症2009年IND候 ALN-TTRトランスサイレチンTTRアミロイドーシス2009年IND候 ALN-HTT変異ハンチントンハンチントン病2009年IND候 NUC B1000HBVゲノムB型肝炎フェーズI aceuticalsCALAA-01RPM2固形腫瘍フェーズI TD101ケラチン6aのN171K変異先天性爪肥厚症フェーズI achyonychia Congenita Consortium ational New Drug, 治験許可申請.

1 1

1 1----4 4 4 4

本 研 究本 研 究 の本 研 究本 研 究ののの 取取取 り取りりり 組組組組 みみみみ

本 研 究 で は 、 最 初 に 、 細 胞 レ ベ ル の 網 羅 的 か つ ハ イ ス ル ー プ ッ ト な 遺 伝 子 機 能 解 析 を 可 能 に す る 「 セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ 」 の 開 発 に取 り組ん だ 。 バ イオマ テリア ル の一種 で 、 個 体 に お け る核 酸 導 入 担体 と し て の 有 効性が 報告さ れ て い た ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン を使用 し 、リバ ー ス ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン に よ る 「 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ 」 を 作製し た 。

次 に 、大腸が ん や 薬 剤耐 性 乳が ん の 遺 伝 子 発 現 プ ロ フィル を も と に 、「 セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ 」 を 利 用 し て 、

RNAi

に よ る 遺 伝 子 機 能 解 析 お よ び 新 規 治 療 標 的 分 子 の ス クリーニングを 実 施 し た 。 そ の後、

siRNA

の

in vivo

デリバリー に よ っ て 、 標 的 分 子候 補の コ ン セ プ ト 検証を 行 う と 同 時 に 、

RNAi

医 薬 と し て の 有 用性を 検討し た 。

注 注 注

注 1-1 Lipinskiののののrule of 5 (RO5)

Lipinski らがフェーズ II 試 験 まで進 んだ化 合 物 のプロファイルを解 析 することにより，薬 剤 の多 くが以 下 の5つのルールを満 たすものであることを示 したもので

2)

，経 口 投 与 可 能 な薬 剤 を 開 発 す る 上 で の 指 標 と さ れ る ．1. 分 子 量 ＜ 500，2. cLogP （ 疎 水 性 の 指 標 ） ＜ 5， 3. 水 素 結 合 ドナー ＜ 5，4. 水 素 結 合 アクセプター （NおよびOの合 計 ） ＜ 10，5. トラ ンスポーターや天然 由 来の化 合 物 は適 用外．

2 2

2 2----1 1 1 1

バ イ オ マ テ リ ア ルバ イ オ マ テ リ ア ル に よ るバ イ オ マ テ リ ア ルバ イ オ マ テ リ ア ルに よ るに よ る 核 酸 導 入 技 術に よ る核 酸 導 入 技 術核 酸 導 入 技 術核 酸 導 入 技 術

バ イオマ テリア ル を 利 用 し た核 酸 導 入法 は 、

1999

年 、落 谷ら が世 界で 初 め て 発 表 し た ⁷⁾。落 谷ら は 、バ イオマ テリア ル の一種 の ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と 遺 伝 子 発 現 プ ラ スミド

DNA

を混合 し 、ミ ニ ペレ ッ ト と呼 ばれ る 剤形に 加 工し て 、 ラ ッ ト に投 与し た 。 そ の結 果、

FGF-4 (fibroblast growth factor-4

：繊 維 芽細 胞増 殖因 子

-4)

遺 伝 子 の生体内デリバリー お よ び 、

FGF-4

発 現 の量と 期間の コ ン ト ロ ー ル に成 功し た 。こ の 発見以 降 、ア テ ロ

コ ラ ー ゲ ン を導 入 担体 と す る こ と で 、 プ ラ スミド

DNA

、 ア デ ノウ ィル ス ベ ク タ ー 、ア ンチセ ン スオ リ ゴ ヌク レオ チド 、

siRNA

な ど の核 酸が 、生体 に導 入で き る こ と が 報告さ れ て い る ^8-15)。

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

(Atelocollagen

、 高 研

)

は 、ウシ真 皮の

I

型 コ ラ ー ゲ ン を由来 と す る バ イオマ テリア ル で あ る 。コ ラ ー ゲ ン 分 子 は 、

N-

、

C-

両 末 端に コ ラ ー ゲ ン の主要抗原部 位で あ る テ ロペプチド を 有 す る が 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン は 、 そ の テ ロペプチド を 、ペプ シ ン処 理に よ り除 去し た 分 子 で あ る 。 し た が っ て 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン は 、免 疫原生が 極 め て 低 く 、生体適合 性が 高 い バ イオマ テリア ル で あ る 。 そ れ ゆ え 、 創傷 被 覆剤 や 止血剤 、人 工 臓 器の 基材な ど と し て 、長年 医 療 分野で使用 さ れ て い る 。 ま た 、再 生医 療 や ド ラ ッグデリバリー シ ス テ ム

(drug delivery system

：

DDS)

の 基材と

[[[[

第第第第

2 2 2 2

章章章章

]]]]

治 療 標 的 分 子 探 索 治 療 標 的 分 子 探 索 治 療 標 的 分 子 探 索

治 療 標 的 分 子 探 索 の た め のの た め のの た め のの た め の

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ のののの 開 発開 発開 発開 発

め 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と核 酸の両 者は 、主に静 電 気的 に結合 し複合 体 を形 成す る 。 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と複合 体 化 し た核 酸は 、ヌク レ ア ーゼに よ る 分 解 を まぬが れ 、組 織や 細 胞内に 効 率 よ く送 達さ れ る 。 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と 核 酸の複合 体 は エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ り 、 細 胞内に取り 込 ま れ る と 推 定 さ れ て い る 。 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン に は 、核 酸 導 入 担体 と し て 、 次 の よ う な特 長が あ る 。

① 毒 性、抗原性が 低 い 。

② 生体適合性が 高 い 。

③ 生体内で線 維 形 成し 、局 所に留ま る 。

④ 正電 荷を 持ち、核 酸と安定 な複合 体 を形 成す る 。

⑤ 遺 伝 子 の 分 解 を防 ぎ、長期間発 現 す る 。

⑥ 生体内で徐々 に 分 解 さ れ る 。

⑦ 徐 放 性が あ る 。

本 研 究 で は 、生体 へ の核 酸 導 入 担体 と し て 、優れ た性 質を 有 す る ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン を 、 培 養 細 胞 へ の核 酸デリバリー に適用 す る こ と を 検討し た 。

2 2 2

2----2 2 2 2

方 法方 法方 法方 法

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

////

核 酸 複 合 体核 酸 複 合 体 、核 酸 複 合 体核 酸 複 合 体、、、 セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ ：：：：

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

(

最終 濃 度

80 µg/ml

、

D-PBS(-)

、

pH 7.4)

と プ ラ スミド

DNA

、オ リ ゴ ヌク レオ チド 、 ア デ ノウ ィル ス ベ ク タ ー な ど の溶 液

(D-PBS(-)

、

pH 7.4)

を

1:1 (vol. : vol.)

の割合 で マ イ ク ロチ ューブに と り 、

4

℃ で

20

分間 転 倒 混 和し 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

/

核 酸の複合 体溶 液と し た 。

複合 体溶 液

50 µl/well (96

穴プ レ ー ト 、

BD)

をウェ ル に添 加し 、風 乾、あ

る い は

4

℃ に一晩静置後 上清を除 去し て 、ウェ ル底面 を ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

/

核 酸 複合 体 で コ ー ト し 、 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ と し た 。

細 胞 培 養 細 胞 培 養 細 胞 培 養

細 胞 培 養 ：：：：

293 (

ヒ ト胎 児腎 臓 由来形 質 転換細 胞株

)

、

NEC8 (

ヒ ト精 巣が ん 細 胞株

)

、

HepG2 (

ヒ ト肝 臓が ん 細 胞株

)

は 、

10%

牛 胎 児血清

(FBS

、

Gibco BRL)

含、

DMEM

培地

(Gibco BRL)

を 、

PC12 (

ラ ッ ト副 腎褐 色細

胞腫細 胞株

)

は 、

5% FBS

、

10%

ウマ血清

(Gibco BRL)

含、

DMEM

を使 用 し 、

5% CO

2下、

37

℃ で 培 養 し た 。

EGFP EGFP EGFP

EGFP

発 現 解 析発 現 解 析発 現 解 析発 現 解 析 ：：：： プ ラ スミド ベ ク タ ー

pCMV-EGFP

お よ び ア デ ノウ ィル

ス ベ ク タ ー

Adv-EGFP

に よ る

EGFP (enhanced-green fluorescence protein)

の 発 現強度は 、 細 胞 機 能 解 析装 置

ArrayScan II System (Cellomics)

で イメージングし 数値化 し た 。 ま た 、

EGFP

の 発 現 を蛍 光 顕

微 鏡 観 察し 、 遺 伝 子導 入効 率 を算出 し た 。

細 胞 増 殖 測 定 細 胞 増 殖 測 定 細 胞 増 殖 測 定

細 胞 増 殖 測 定 ：：：：

細 胞増 殖 測定 試 薬

TetraColor One reagent (

生化学 工業

)

を 推奨プ ロ ト コ ー ル に 従 い使用 し た 。

2 2

2 2----3 3 3 3

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ のセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イのの 開 発の開 発開 発開 発

中 性 溶 液 中で ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と核 酸の両 者は 、結合 し複合 体 を形 成す る 。ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と核 酸

(

プ ラ スミド

DNA)

の複合 体 の形状は 、主に ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン の濃 度に よ っ て 規 定 さ れ 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン の濃 度の上 昇と と も に 、粒子状か ら繊 維状に 変 化 し た

(

図図図図

2 2 2 2----1 1 1a 1 a a a)

¹⁶⁾。 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

/

プ ラ スミド

DNA

複合 体 の形状は 、デリバリー の 効 率 に 大 き く影 響す る と予想し 、

293

細 胞

(

ヒ ト胎 児腎 臓 由来形 質 転換細 胞株

)

へ の 遺 伝 子導 入 効 率 を 調 べ た

(

図図図図

2 2----1b 2 2 1b 1b) 1b

¹⁶⁾。そ の結 果、ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン濃 度

80 µg/ml

と し た と き 、直径 数百

nm

の粒子 が形 成さ れ 、 最 も 効 率 良 く 細 胞 に導 入さ れ る こ と が わ か っ た 。 ま た 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン濃 度を

80 µg/ml

以下に設 定 す る と 、複合 体 が形 成さ れ に く く な り 、 培 養 細 胞 へ の導 入効 率 が 低下し た 。

(a)

(b)

図図

図図 2-1 アテロコラーゲンアテロコラーゲンアテロコラーゲンアテロコラーゲン とととと 核 酸核 酸核 酸 複 合 体核 酸複 合 体複 合 体複 合 体 のののの 形 成形 成形 成形 成 とととと 核 酸 導 入 効 率核 酸 導 入 効 率核 酸 導 入 効 率核 酸 導 入 効 率

(a) アテロコラーゲン (80, 200, 300 µg/ml) とプラスミドDNA (pCMV-EGFP, 100 µg/ml) の混合 により形 成 された複 合 体 の形 状 (緑 色，PicoGreen染 色) ¹⁶⁾． (b) 293細 胞 におけ るGFP発 現 の比 較 ．(a) の複 合 体 を293細 胞 に添 加, 7 日 後にGFP蛍 光 強 度を測定 し た (means ± s.d.，n ＝ 4) ¹⁶⁾．

アテロコラーゲン プラスミドDNA

300 µg/ml 200 µg/ml

100 µg/ml 100 µg/ml 100 µg/ml

80 µg/ml アテロコラーゲン

プラスミドDNA

300 µg/ml 200 µg/ml

100 µg/ml 100 µg/ml 100 µg/ml

80 µg/ml

アテロコラーゲン pCMV-EGFP

300 µg/ml 200 µg/ml

100 µg/ml 100 µg/ml 100 µg/ml

80 µg/ml

相対GFP蛍光強度

0 20 40 60 80

Fibrous Particle

アテロコラーゲン pCMV-EGFP

300 µg/ml 200 µg/ml

100 µg/ml 100 µg/ml 100 µg/ml

80 µg/ml

相対GFP蛍光強度

0 20 40 60 80

相対GFP蛍光強度

0 20 40 60 80

0 20 40 60 80

Fibrous Particle

Fibrous Particle

次 に 、ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

/

核 酸の複合 体 を 、よ り簡 便に 効 率 よ く 培 養 細 胞 に導 入し 、核 酸の ハ イ ス ル ー プ ッ ト ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン を 可 能 に す る 方 法 を 検討し た ^16,17)。従 来 、核 酸 導 入は 、あ ら か じ め 培 養 し た 細 胞 に 、核 酸 と 遺 伝 子導 入試 薬 の混合 物 を 用事調製し添 加す る 、 あ る い はウ ィル ス ベ ク タ ー を 作製し感 染さ せ る こ と で 行 わ れ て き た 。 し か し 、 こ の 方 法 で 、 多 検 体 の核 酸を導 入す る に は 、 多 大 な 時間と労 力を 要 す る 。 こ の煩 雑さ を 解消 す る た め 、 わ れ わ れ は 、 画 期 的 な核 酸 導 入方 法 を考案し た 。 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と核 酸の複合 体 を マ ルチ ウェ ル プ レ ー ト のウェ ル に コ ー ティングし 、 そ こ に 細 胞 を播種 、 培 養 す る だ け で核 酸を導 入す る い わ ゆ るリバ ー ス ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 法 で あ る 。ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

/

プ ラ スミド

DNA

複合 体 を 、 一般的 な あ ら か じ め 培 養 し た 細 胞 に滴 下す る 方 法

(

滴 下法

)

と 、 培 養 容器 の 細 胞接 着面 に コ ー ト し 、 そ こ に 細 胞 を播種 す る 方 法

(

プ レ コ ー ト 法

)

の 遺 伝 子導 入効 率 を比較し た と ころ、 プ レ コ ー ト 法

(

リバ ー ス ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 法

)

の 方 が 、 遺 伝 子導 入効 率 が 高 く

(

図図図図

2 2----2 2 2 2 2) 2

、 良 い再現性を示し た 。 こ のリバ ー ス ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 法 に 基 づ き 、 あ ら か じ め ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と 個 々 の核 酸と の複合 体 を 、

96

穴な ど の マ ルチ ウェ ル プ レ ー ト の 各ウェ ル に ア レ イ 化 し て お けば、 細 胞 を播く だ け で 、 多 検 体 の核 酸を短時 間で 同 時 に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン す る こ と が 可 能 で あ る 。わ れ わ れ は 、ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン

/

核 酸の複合 体 を ア レ イ 化 し た プ レ ー ト を 、「 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ 」と名 付け た 。「 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ 」 の 培 養終了後に は 、核 酸 導 入に伴う 細 胞 機 能 の 変 化 を 、既 存の 解 析装 置や各種測定 試 薬 を使用 し 解 析 す る こ と で 、 ハ イ ス ル ー プ ッ ト な 遺 伝 子 機 能 解 析 を 行 う こ と が で き る

(

図図図図

2 2 2 2----3 3 3)))) 3

。

図 図 図

図 2-2 リ バーストランスフェクションリ バーストランスフェクションリ バーストランスフェクションリ バーストランスフェクション 法法法法 ののの 開 発の開 発開 発開 発

(a) 培 養中 の 細 胞 に ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン/核 酸 の 複 合 体 を滴下 す る滴下 法 と ， ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン/核 酸 の 複 合 体 を 細 胞培 養ウ ェ ル底 面に プ レ コ ー ト し ， そ こ に 細 胞 を播 種す る プ レ コ ー ト 法 によるトランスフェクション．(b) 293細 胞 のトランスフェクションにおける，滴下 法 とプレコート 法 の 比 較 ． ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン/核 酸 の 複 合 体 (ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン 80 µg/ml，pCMV-EGFP 100 µg/ml) によるトランスフェクション 7 日 後のGFP発 現 (means ± s.d.，n ＝ 4，*P

＜ 0.05)．

GFP発現(cells/well of 6-well plate)

0 1,000 2,000 3,000 4,000

滴下法 プレコート法

＊

GFP発現(cells/well of 6-well plate)

0 1,000 2,000 3,000 4,000

滴下法 プレコート法

GFP発現(cells/well of 6-well plate)

0 1,000 2,000 3,000 4,000

滴下法 プレコート法 0

1,000 2,000 3,000 4,000

滴下法 プレコート法 滴下法 プレコート法 滴下法 プレコート法

＊

(a) (b)

トラ ンス フェ クショ ン 滴下法

プレ コ ート 法

細胞 を添 加 ア テ ロコ ラ ーゲ ン/核酸 複合体

培養中の 細胞

遺伝子発 現

リバース ト ランス フ ェクシ ョン

遺伝子発 現 トラ ンス フェ クショ ン

滴下法

プレ コ ート 法

細胞 を添 加 ア テ ロコ ラ ーゲ ン/核酸 複合体

培養中の 細胞

遺伝子発 現

リバース ト ランス フ ェクシ ョン

遺伝子発 現

図 図 図

図 2-3 セ ルトランスフェクションアレイセ ルトランスフェクションアレイセ ルトランスフェクションアレイセ ルトランスフェクションアレイ によるによるによるによる ハイスループットハイスループットハイスループット 遺 伝 子 機 能 解 析ハイスループット遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析遺 伝 子 機 能 解 析

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン と 核 酸 の 複 合 体 を マ ルチウ ェ ル プ レ ー ト に プ レ コ ー ト し て お けば， そ こ に 細 胞 を播 種す るだ けで リ バー ストラ ンスフ ェク シ ョン が 成 立 す るため， 多 検 体 の 核 酸 を 同時に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン できる ． 細 胞培 養 終 了 後，自動 化 細 胞 機 能 解 析装 置を使用 し ， ハ イ ス ル ー プ ッ ト セ ル ベ ー ス ア ッ セ イ ， マ ルチプ レ ッ ク ス セ ル ベ ー ス ア ッ セ イ を行い ， 形 態 ， ア ポ ト ー シ ス，増 殖 ，シグナル伝達などを指 標 に，遺 伝 子 機 能 を評 価する．

ア テ ロコ ラ ーゲ ン

複合体

プレ コ ート

マルチウ ェル プレ ー ト

細胞

ArrayScan (Cellomics) リバース ト ランス フ ェクシ ョン

自動化細胞機能解析装置 ハイス ルー プッ ト

セルベ ースア ッ セ イ マルチプ レッ クス セルベ ースア ッ セ イ

核酸

形態, ア ポト ーシ ス, 増殖, シ グナ ル伝達…

遺伝子機 能の評 価 ア テ ロコ ラ ーゲ ン

複合体

プレ コ ート

マルチウ ェル プレ ー ト

細胞

ArrayScan (Cellomics) リバース ト ランス フ ェクシ ョン

自動化細胞機能解析装置 ハイス ルー プッ ト

セルベ ースア ッ セ イ マルチプ レッ クス セルベ ースア ッ セ イ

核酸

形態, ア ポト ーシ ス, 増殖, シ グナ ル伝達…

遺伝子機 能の評 価

2 2

2 2----4 4 4 4

セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ のセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イセ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イのの 特 長の特 長特 長特 長

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ に お い て 、 プ ラ スミド

DNA

量依存的 な 遺 伝 子 発 現 を 認 め た

(

図図図図

2 2 2 2----4a 4a 4a 4a)

^16,17)。ま た 、本 セ ル ト ラ ン

ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ に よ り 、 ア ンチセ ン スオ リ ゴ ヌク レオ チド

(

図図図図

2 2

2 2----4b 4b 4b 4b)

や

siRNA (

第

3

章で詳 述

)

の ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 、 ア デ ノウ ィル

ス ベ ク タ ー

(

図図図図

2 2 2 2----4c 4c 4c 4c)

の イ ン フ ェ ク シ ョ ン が 可 能 で あ っ た ^16,17)。

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ と 、カ チ オン性 リ ポ ソー ム に よ る ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン を比較し た と ころ、カ チ オン性 リ ポソ ー ム に よ る 遺 伝 子 発 現 は

1-2

週間程度し か 持続し な い の に 対 し 、ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン に よ っ て導 入さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 は

50

日間以上継 続し た

(

図図図図

2

2 2

2----5a 5a 5a 5a)

¹⁶⁾。ま た 、

PC12

細 胞 へ の 遺 伝 子導 入で は 、遺 伝 子導 入効 率 は 同程度

で あ っ た が 、カ チ オン性 リ ポソー ム が強い 細 胞毒 性を示し た の に 対 し 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン は何ら毒 性を 持 た な か っ た

(

図図図図

2 2 2 2----5b 5b 5b) 5b

。

さ ら に 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ の保 存 安定 性を 調 べ た と ころ、 作製

8

週間 後ま で 、一定 の核 酸 導 入効 率 を保持 し 、 長期間 保 存で き る こ と を 確 認 し た

(

図図図図

2 2----5 2 2 5 5cccc) 5

。

ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ の 培 養終了後、既 存 の 細 胞 機 能 解 析装 置、測定 試 薬 に よ る

96

穴、

384

穴フォー マ ッ ト の 解 析 を 行 い 、核 酸 導 入に よ る 細 胞 機 能 の 変 化 か ら 、 遺 伝 子 機 能 を 解 析 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。

2-4

、

2-5

に 、 遺 伝 子 機 能 解 析 実 施例を述べ る 。

以下、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン セ ル ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン ア レ イ の特 長を ま と

解 析 が 可 能 で あ る 。

② 安定 な核 酸 導 入が で き 、再現性が 高 い 。

③ 遺 伝 子 を長期 発 現 さ せ ら れ る 。

④ 細 胞毒 性が 低 い た め 、 アポト ー シ ス な ど を誘発 さ せ る こ と な く 、 ノ イ ズの 少 な い 正 確 な 解 析 が で き る 。

⑤ 核 酸を導 入可 能 な状態 で ア レ イ上に長期間 保持 す る た め 、保 存に適す る 。

⑥ 既 存の 細 胞 機 能 解 析装 置、測定 試 薬 が使用 で き 、様々 な 解 析 のニーズ に 対応で き る 。

図 図 図

図 2-4 セ ルトランスフェクションアレイセ ルトランスフェクションアレイセ ルトランスフェクションアレイセ ルトランスフェクションアレイ によるによるによるによる 核 酸 導 入核 酸 導 入核 酸 導 入核 酸 導 入

(a) プラスミドDNA量依 存的 遺 伝 子 発 現 ．pCMV-EGFP (最終 濃 度，0-100 µg/ml) と アテ ロ コ ラ ー ゲ ン の 複 合 体 を調 製し て ア レ イ を作 製し た ．293 細 胞 に お け る ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 7 日 後のGFP発 現 を測定 した

16)

． (b) アンチセンスオリゴヌクレオチド． FGF-4に対す る セ ン ス (1)， ス ク ラ ンブル (2)， ラ ン ダ ム (3, 4, 6)， ア ンチセ ン ス (5) オ リゴ ヌク レ オチド (10 µM) と ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン の 複 合 体 を調 製， ア レ イ を作 製し ， 細 胞播 種 4 日 後の 細 胞 増 殖 を測定 した

16)

．FGF-4依 存的 に増 殖 するヒト精 巣 がん細 胞NEC8は、アンチセンスオ リゴ ヌク レ オチド で 増 殖 が 阻 害 さ れ た ．一 方、FGF-4 と無関係に 増 殖 す る ヒ ト肝が ん 細 胞 HepG2 の 増 殖 阻 害 はみら れ な かった ． (c) ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー ． ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー (最終 濃 度，0-2 x 10⁷ pfu/ml) とアテロコラーゲンの複 合 体 を調 製，アレイを作 製し，マ

相対GFP蛍光強度

20 40 60 100

プラスミドDNA (µg/ml)

0 0 20 40 60 80

相対GFP蛍光強度

20 40 60 100

プラスミドDNA (µg/ml)

0 0 20 40 60 80

1 2 3 4 5 6

NEC8 HepG2

0 50 100

細胞増殖阻害率(%)

ODN NEC8 HepG2

1 2 3 4 5 6

NEC8 HepG2

0 50 100

細胞増殖阻害率(%)

ODN NEC8 HepG2

2x10⁴ 2x10⁵ 2x10⁶ 2x10⁷ 0

アデノウイルス (pfu/ml)

0 20 40 60 80

相対GFP蛍光強度

2x10⁴ 2x10⁵ 2x10⁶ 2x10⁷ 0

アデノウイルス (pfu/ml)

0 20 40 60 80

相対GFP蛍光強度

(c)