膵 蛋白分画 動 膵 障 害 作 能 免疫 成

膵^{リ ボ}蛋 白 分 画 ^の能動免 疫 による イ^ヌ 膵障害作成^{の こ こ} ろみ

富山 県 立中央 病院 ^･ 内科

広 瀬 昭 ^一 郎

石川 郡中 央病院 ^･ 内科

中 島

( 昭和^{5 6}年4 月⁸ 日受 付)

Key ^{w or}ds A uto a ntibod_y, Li_p op^{r o}tein

,P a n c r e atic l nj^ury

慢 性月革灸^の成因にはアル コ ^ー ル飲 用, 胆 石症 な ど が あ げ ら れ^{て い}る が. 成 因不明^の もの も 2 0 ^〜 4 0 % あ

り^{1 ) 2 )}, その成 因と して自己免疫 機 序も想 定さ れて い

る^{3 )}.慢 性 膵 炎^の患者 血 清 中^に抗 膵抗 体が高率に見出さ れ る事 実^{射〜7 )}も そ^の推 測を支持す る^. し か し, これ ま^で に 膵抗 原を能 動 的^に免疫し^て動 物^に膵 外 分泌腺^の障害 を作^っ た報 告は, わ れ わ れ^の知る ところで は存 在し な い. そこ で著 者ら は 異種^･ 同 種^の膵不溶 性リ ボ蛋 白^の 可 溶 化 分画を抗 原と してイ^ヌを長 期 間 免 疫し, 何ら か の膵病 変を作り得な^いか検 討し た^. そ^の結 果, 膵 組 織

へのリ^{ン パ}球 浸潤^のよ う な炎症性 病 変は生 成し な か^っ た が^, 酵 素 原 顆 粒^の減少や消 失^に表 現さ れ た膵 腺 細 胞

の軽^い変 性, お よ び血清^{ア ミ ラ ー ゼ}活 性^の変 動を 認 め たの で報 告す る.

材料お よ び方法 1. 陣^の不溶 性リ ボ 空白分画^の抽 出

新 鮮なウ シ膵 臓を屠 殺場よ り入 手し た. 新鮮な イ^ヌ 膵 臓ほ当村におい て他^の急 性 実 験に用^いら れ た イ^ヌよ り得た.これ ら^の膵 臓は使用 す る まで ^‑ 4 0 ℃^に凍 結 保 存し た^. 膵^の不 溶 性リ ボ蛋 白 分 画 (L P) は S mith ら^{8 )} の方 法^の変法^によ^って抽 出し た^. 通常.5 0 0gm の膵 組 織か ら作 業を開始し,1 0 0 ^〜 1 2 0gm ( 湿 量) のL P を得 た^.約2 0gm のL P に0^.2 % デスオ キ^{シコ ー ル}酸ナ トリ ウム液1 0 0 m ほ加えて ホ モ ジナ イ ズ し, さ ら^に氷 室 内

でマ グ ネチ ッ ク スタ ^ー ラ^ー によ り ^一 夜 撹 拝し た. 翌朝

At te m p t t^o Pr odu c e P a n c r e atic Inj^{u r}y in the

9 ,0 0 0rpm3 0分 間 冷 凍 遠心後, 上 清を と り, こ の上清

の容 量^の1 0倍 容量^の冷^{ア セ トン}を加え,

‑ 20 ℃に^一

夜お き^, 生じ た白 色 沈 澱 (L P s ol) を3 ,0 0 0rpm1 5分 間 遠^jL^､して集め た.20g^m のL P か ら出 発して得ら れ た L P s ol に5 ^〜 1 0 ^mエの生理的 食 塩 水を加えホ モ ジ ナ イ ズ す る と 蛋白 濃 度13 ^〜 4 0^mg/mエの液が え ら れ た.

蛋 白 定量 は Lo w ry ら^{9 )}の方 法^によっ た.

2^. イヌ の免 疫

A ,B,C ,3群^の雑 種 成 犬を準 備し た. A 群は 8頭か ら な り, これ ら^の前 記^の方 法^で準 備し た^{ウ シ}膵L P s ol の 30 ^〜 5 0 ^mg 蛋 白を含む液 2 ^〜 3 ^mL と同量 ^の

Fr e u nd 完 全ア ジエ バ ン ト(Iatr o n 製) ^{を ェ ム ルジョ}

ンと してイヌ の肩 甲骨 下^へ筋 注し た^. こ の注 射は 2 過 ご とに5 回, つい で4過ご とに行な^っ た. 総 計,2 頭の イ ヌ では6 回, 5頭^で9 回, 1頭^で1 5回 免 疫 注射を行 な^っ た^.

B 群は3 頭か ら な り, これ らにイヌ膵を材 料と して

前 記^の方 法^で作 成し た L P s ol を筋 注し た^. 注 射^の間 隔は A 群と同じであ り,投 与^の回 数は 2 頑におい て9 回, 1頭では 1 0 回であ^っ た^.

C 群5 頭を対照 と し た. こ の群^では生理的 食塩 水^‑

ア ジエ バ ン ト ^･ エ ム ル ジョ ンを A や B 群と同じ間 隔

で筋 注し た^. 投 与 回数は 4 頭で8 回^, 1 頭で1 1 回であ

っ た.

3^. 血中抗体の検 出お よ び 血清アミラ ^ーゼ活 性^の測 定.

毎回^の障L P s ol ま た は対照^{エ ム ル ジョ ンの}注 射 直

D og b_y A ctiv eIm m uniz atio n wit h L i_pop^‑ r otein F^ra ctio n of B o vine and Canin e P a n c r e a s. S hoichiro H ir o s e, Dep^{a r}tm ent of Inte^･ rn al M edicin e, T oy^{a m a} Pr efe ctu r al Ce ntr al H o spital, Toy^{a m a.} S hin N ak aj^{im a, De}p^at^･ tm e nt of Inte r n al M edicin e

,Ish ika w a^‑g^un C entr al H o spital_, M ats uto.

前^に5 ^〜 8mエ採 血して血 清を分離し た. こ の血 清^につ

い て. ウシ ま た は イ ^{ヌ の}膵L P s ol を抗 原と して O^{u c}hte rl^{o n}y 法^{1 0 ▲}に よ り抗 体を 検 索 し,

一 方

Ca r a w ay 法^{I l )に}よ り^{ア ミ ラ ー ゼ}癌性^を測 定し た^. 4^. 膵組織^の蛍 光抗体 法^によ る検索.

最 終^の免疫注射^の7 ^〜 1 4 日後にイ^ヌを^{ペ ン} ト ^パ ル ビ タ ^ー ルによ り麻 酔し, 大腿 動 脈か ら採 血L な が ら出 血死さ せ た^. こ の間に開 腹して膵^{の 一} 部を摘 出^し. ド ライアイ^スとア セ ト ^ンの混 合 液^によ り ^‑ 8 0 ℃に冷 却 し た無 水^{エ タ ノ ー} ル へ浸 して瞬 間^に凍結さ せてか ら引 き出し,

‑ 4 0 ℃^に保 存し た.1 2 日 以内^にク リオ スタ^ッ ト で凍結 切 片を作 製し た^.

間接 蛍 光 抗 体 法^には膵 切 片を A ま た は B 群^の イ ヌ

血清を燐 酸 緩 衝 生 食 水 (pH 7^.2 ) によ り8 倍に希 釈し た液によ^っ て約2時 間 披い, つ い で F I T C (flu o r e s^̲ C ein is oth io cy^{a n a}te)標 識 抗イヌ 7^･ グ^ロ ブ リン家 兎 血 清グ^ロ ブリン(M ile s Lab^.,Illin ois, U^.S^.A^.) ^によ り 3 0 ^〜 6 0 分 間染 色し た^.これ ら^の操 作^{は 3 7 ℃の}湿 室で

行なっ た.

な お, 対照にはアジエ バ ン ド対照C 群^のイ^ヌ血 清^を 用^い染色し た.

直接 蛍 光 抗 休 法に は R ig gs ら^{1 2 )}の方 法^に よ り A 群

のイヌ の γグロ ブリンを FI T C によ り標 識しつ い で精 製し た ものを 用^い, ウ シま た は イ^ヌ膵^のク リ オスタッ ト切片を 3 7 ℃の温室^で6 0 ^〜 1 2 0 分 間 染 色^{し た.な お},

C群^のイヌ γグ^ロ ブ リ^ンを同 様^に標識し, 対照 染色 標 本を作 成し た.

Tab le l. Se ru m Pr e ci_pitin to Bo vinePan C r e a SL P s ol

5. 組 織 学 的 検 索

膵^の左 葉と右 腰, 肝, 腎. 牌^. 胃, 小腸, 心, 肺,

唾 液 腺^{の 一}郎を 1 0 % ^{ホル マ} リ^ンによ り固 定し, パ ラ フ ィ^ン切 片を作 製L ,

へマ トキ^シリ^{ン ー エ}オ ジンお よ び アザ^ン染 色を行な^った^.

成 績

1. 血中抗 体の証明^.

膵抗 原 分 画 (L P s ol) に対す る抗 体^の出 現を.ま ず Ou chte rlo ny 法によ り検 討し た. A 群^のイ ヌ8 頭^で はウ シ膵^の投 与を開 始し た2過後か ら沈 降抗 体が陽 性 と な り( 図1),これ は最 終 免疫 後まで継続し た( 表¹).

C 群 ( 対照) ^の 5頭では, ウ シ膵L P s ol に対 する沈 降 抗 体は どの時 期にも出 現し な か^っ た^. B群^の3 頭では イヌ膵L P s ol に対す る沈 降 抗 体^{は Ou chte rlo n}y 法

では 証明^でき な か^っ た^.

F I T C で標 識し た A 群^のイヌ γグ^ロ ブ リ^ンによっ て ウ シ膵^のク リ オスタッ ト切 片を染 色 する と, 膵 腺 細 胞

の_apical po rtio n( 核 上 部) ^に蛍 光が強く,腺 細 胞 核^･ La n ge rha n s 島細 胞 ^･ 膵 問 質^には蛍 光は み と め ら れ な か^っ た( 図2).対 照^のC 群^{の イ ヌ}血 清か らγグロ ブ リンを分離し同様^{に操 作し た が,} 原 形 質 全般^の弱^い非 特 異 的蛍 光が み ら れ た^のみであ^った^.

2^. 間接 蛍 光 抗 体 法の染 色 所見.

ウ シ膵L P s ol によって免疫し た A 群^のイ ^ヌ膵ク リ オスタ^ッ ト切 片を自己血 清^で披^い, つ い で FI T C 標 識 抗イ_{ヌ γ}グ^ロ ブ リ^ン家 兎 血 清グ^ロブ リンで染 色 する と

｡_喝諾^{k o 2 4 6 8 1 0 1 2 1 6}

7 3^‑ 1 7 3^‑ 2 7 3^‑ 5 7 3^‑1 4 74^‑ 1 7 4^‑ 2 7 4^‑ 7

｢ 阿^‑ 8

4 1 6 >3 2 1 6 8 1 6 1 6

8 4 1 6 1 6 8

4 1 6 1 6

2 1 ̀ 8 1 6

8 >3 2 1 6 1 6 2 3 2 1 6 8 1 6 1 6

3 2 3 2 >3 2

1 6 3 2 >3 2

8 8

+

十

十

+

8

̀ U

′

0

1 1

つ_一 つJ

1 6 1 6 8 1 6 ⁺

1 6 >3 2 1 6 8 ⁺

>3 2 ^十

>3 2 ^十

Ma xim al d 血tio n n u mbe r of c anin e s e m m is 血o w n d 血 _{g t}he c o u r s e of 血m u niz atio n wi th bo vine p^{an C r e a S}L P s ol･ T hedog7 3^‑1 w a s s a cd Lic ed at4 8 w e eks･ 0 th e rs w e r e s a cri fic ed _年Sindi^‑

C ated in thetable.

+ de n ote s s a c rific e.

梓 腺 細 胞^の原 形 質 全 般^に蛍 光が あ り, ま た腺 細 胞^の

apic al po rtio n の蛍 光が よ り強かった ( 図 3 ) ^･ 自己 血清^のか わ り^にC 群^のイ^ヌ血 清^で被^っ た対 照 切 片^で は蛍 光は全般^に微弱^であ^っ た.

同 種 膵^のL P s olで免疫し た B 群2 頭^の膵 凍結 切 片 を自己血 清^で披^い, つい でF 汀 C 標 識 抗イヌ γグ^ロ ブ リ^ン家 兎血 清グ^ロブ リ^ンで染 色し た と^ころ, 膵 腺 細 胞

の apic al po rtio n の蛍 光が強か ^った( 図4)^{･ こ の}蛍 光は C 群^のイヌ血清を 用^いた対 照 切 片よ り強か^っ た^･

対 照C 群5 頭^の膵を自 己血 清^で披^い, F I T C 標 識 抗 イ ヌ γグ^ロ ブ リ^ン家 兎 血 清^{グロ ブ リン で}処理 し た場

合. 膵臓 細 胞は微弱な蛍 光を呈し たに過ぎ な^い･ 3^∴肉眼 お よび 光 学顕微 鏡 所 見･

肉 眼的^には A ^･ B ^･ C 各 群^の膵^に異 常を み と め な か

っ た^{, へ マ ト}キシリ^{ン ･ エ} オ ジ^ンま た は^アザ^ン染 色 標 本^の検 鏡^では各 群^の膵^に実 質 壊 死^･ 細 胞 浸 潤^･ 線 維 化 は み ら れ ず^. 従って急 性や慢 性^の膵 灸は発 生し^{て い}な か^っ た^. し か し^,膵L P s olに よって免 疫し た イ^{ヌ で}は し ば し ば腺細月包^の酵 素 原 顆 粒が減 少あ る^いは消 失し た 部が巣 状^に出 現し た( 図5,6 ). 対 照群^におい ても同 様

の部は多 少は み と め ら れ た^{の で}以下^のよ う な計 測を行

った^. すな わ ち^,1 頭^{のイヌ に つ き}膵 左 糞よ り1 ^カ所.

右 農よ り 1 ^〜 2 個 所 組 織 標 本^を作 成し. 1 枚^の組 織 標 本^{で は 1 0}偶^の61 7〃^×4 5 0〝 の区 画^の中^の ,

a. 酵 素 原 頼 粒^の数が ほ ぼ 正常^,

b. 酵 素 原 板 粒^の数が か な り減 少し^, 1個^の細 胞 内^に 5 ^〜 1 0個し か存 在し な^い,

c .酵 素 原 顆 粒が全く存 在し な^いか, 1 ^〜 4 個^のみ存 在す る^.

の各 境 目^に属す る細 胞 数を無 作 為^に計 数し表2 に示 し た. そ^の結果. 上 記^の区 画 内^の腺 細 胞 総 数 (a ^･ b ^･ C

の各項^に属す る細 胞数^の和)は A ,B,C 各 群^の間^で有 意 差は な か^った^. し か し,ウ シや イヌ膵L P s ol投 与 群で

は対 照 群^に比して酵 素 原 顆 粒^の減少し た細 胞 (b) ,あ る^いは ほ と ん ど消 失し た細 胞 (c) が明ら かに多く(そ れ ぞ れ^, P < 0.00 1), 酵 素 原顆 粒 数が 正常と 思 わ れ る 細 胞 (^a) は明ら か^に少な か^っ た(P ^< 0^･0 0 1 . 表2)･

ウ シ膵L P ^{s o}l投 与 群と イ^ヌ膵L P ^{s o}l 投 与 群との比 較では, 後 者^の方が酵 素 原 顆 粒^の減 少し た細 胞 (b) が 多く(P < 0^.0 0 1), ま た酵 素原 顆 粒^の殆ん ど消 失し た 細 胞 (c) も多か^った (P < 0^.0 5 , 表2) ･

膵以外の臓 器^の肉眼検 査^で は, ウ シやイ ヌ膵L P

s ol免 疫お よ び対 照^の各 群^に多 少と も脾 腫 大が み と め ら れ た^{. ウ シ}膵L P s ol 投 与^の2 頭^では肺に米 粒 大^の 褐 色 結 節^が散 在してみ と め ら れ た^･ 肝 ^･ 腎^･Jい 胃^･

小 腸^には肉眼では異 常が み ら れ な か^っ た^･ 組 織 学 的検 索では膵L P s ol投 与 群^の全 例^{お よ び}対照群5例 中^の 4 例^におい て肝お よ び肺^に肉 芽 腫を み と め た^･ 腎^･ 心^‥ 胃^･ 小 腸^･ 唾液 腺^には組 織 学 的に は異常を み と め な かった.

4^. 血清アミ ラ^ー ゼ活 性^の推 移^.

免 疫 開始 後 6 カ月 間は^{ウ シ}膵L P s ol 投 与 群^の血 清

ア ミ ラ ^ー ゼ活 性^は対 照群^のそ れに比 し^て高^い傾 向が み ら れ た ( 図7). ウ シ膵L P s ol投 与群^におい て, 血清

Table 2. Nu mbe r ofPa n c r e atic Acin a r Cells a nd De n si_{t y} of Z y^{m o}g^{e n} Gr a n ule in t he Ce11

Bo vh e C 血 e N o 工m 山S 血 ^e

A

ntig^{e n} G iv e n

pa n c r e a sL P s oI Pan C r e a SL P s ol (^{C O ntr Ol})

Nu mbo rof Dog^s

Nu mbe r of Sp^{e c}im e n sEx aLm ined

つ J

8 Nu mbe r of Acin a lCens

(M e an 土S^ta nda rd De Yiatio n)

a. Acin a = C ells wh ichc o ntain n u m e r o u sZ G 4 8 士9^{* **} 4 4 ^± 7^{** *}

b. Acin a r c eus which c o ntain 5^‑1 0 Z G 9 ±2^{** *} 1 3 ^士 1^{** *}

c. A 血肛 C 曲 w 址 h c o nt血 0^‑4 Z G 2 4 ±6^{* 榊} 3 0 ^土1 0^{* * *}

血 T^ot山ofn n mb￠rS a,b a nd c 7 8 ^±6 # 8 7 ^±1 2 #

7 1

つ J

7

±

±

±

±

̀ U

5 8

Qノ

̀

V

7

Nu mbe r ofc eus w a s c o u nted in t he a I C a Of6 1 7 ×4 5 0F^▲･

Le v el of sigmi fic a n c ein statistical e v alu atio n c o mp^{a r e}dto c o Tltr Ol;^***:P^<0^･0 0 1^･

#^{: n Ot} 痴gⁿi 丘c a nt.

Z G: Zym Og^{e n} 騨^{乱 皿}1e s