臨 床応用 関す 研究 造 器腫 瘍 け 抗腫 瘍剤感 受性試験

造^血器腫瘍^{に お}け^る抗 腫瘍剤感受性 試 験 ^の 臨床 応 用^に 関す^る研 究

金沢 大 学 医 学 部 医 学 科 内科 学 第^三講 座 (^主任^: 松田 保 教 授)

彼 谷 裕 康

これ まで ヒト^の悪性 腫 瘍^{濫つい て}抗 腫 瘍 剤^に対 する種^{々 の}感 受 性 試 験が試み ら れ てきて いる が, 正常 細 胞^の混 入 な どの

技術 的 問 題, ある^いは臨床 的^に使 用さ れ た際^の抗 腫 瘍 剤^の血中動 態^と, 感 受性 試験^{で の}薬剤 量と^の関 係^につ い て検 討さ れて い な^{い こ}と, な ど^の問題^のた めに未だ確立 さ れ た方法は な^い. 本研 究^でほ比 較 的 簡 便な感受 性 試 験^であ^{る 3}‑^(4,5‑^{ジメチ ルチ アゾ}

ルL^{2 イ ル)}‑^2,5‑ ^{ドフ ェ ニ ル テ ト ラゾ リ ウムブロ ミド(3}‑^(4,5‑^{d im ethylth ia z oト2}‑^yl)‑^2,5‑^{dophe nyltetr a z oliu m br o mide, M T T)}

アッ セ イ を 用いて臨 床 応用のた めの基礎 的 実 験と とも^に, 造血 器腫 瘍 患 者よ り得^た臨 床 検 体^{につい て の}試験^を行^い, 有 用性を 検 討^{し た.} 基 礎 的 検 討^の結 果, 分 離し た腰 瘍 細 胞が8 0% 以上にな る検 体で, 培 養 期 間は リ^{ン パ}系細 胞^では 2 日間, 骨 髄 糸細 胞 で ほ 4 日間と し, 阻 害 率^{7 0}% を感 受 性^の有 無^の開 催^と設 定^して , 臨床 検 体^{で の}検 討を行っ た. 末治 療^の成 人 急 性 非^リン パ性 白 血病 (a c ute n o nlymphobla stic Ie uke mia,A N L L) ^におい ては, 真 陽 性 率が9 2% , 真 陰 性 率が 5 0% , 予 測 率^{が 87}% , 未 治 療^の成

人 罪^{ホジ キンリン パ}腫 (^{n o n}‑^{Hodgk in'slym pho m a,N H L) について ほ真 陽性 率が1 0 0% , 真 陰 性 率が 0 % ▲ 予 測 率が 5 0% であっ}

た^. 難 治療 例, 再 発 例^の N H L におい てほ真 陽 性 率が1 0 0% , 予測 率^{が 1 0 0}% ^であり, M T T ア ッセイの結 果^と臨 床^の結 果^{と が}相 関 す^{ること が}証明 さ れ た. しか し, 難 治 療 例, 再 発 例^の A N L L では偽 陽 性が多かった^. こ のた め未 治療 例^の検 討ではある が,

多 剤 耐 性 (m ultidr ug ^{r e s}ista n c e,M D R) と^の閑適を検 討^{した ところ}, M D R 発 現^が偽 陽 性 例^で多^いと^いう^こと ほ なく, ま た, 生 体 外で アン ト ラ サイクリソ系抗 腫 瘍 剤^に対する感 受 性と M D R 発 現^につい て検 討し た が, 有 意な関 連は な か ^った･ こ の原 因^に

つ い ては王 長 時 間薬 剤^と接 触^{さ せ るこ}と に よ り M D R の故 樺^を越え て薬 剤が細 胞 内^に入 る 可能 性と, 別^の耐性 機 序が存 在 する 可能 性と が考え ら れ た^. な お, 造血器 腫 瘍^{におい て,} 感 受 性 試 験と M D R 発 現^の検索^の両者を同時^に行う^ことでl 予 後^を推 測 できる 可能性^が生 存 率^の成 績か ら示唆さ れ た.

K ey ^{w o r}ds che m o sen sitivit y test, M T T a s s ay^,he m atologic m ali_gnancy^{, m u}ltidr ug ^{re s}ista n c e

これ まで ヒ ト の悪 性 腫 瘍に対し て抗 腫 瘍 剤^によ る種^{々 の}感 受 性 試 験が試み ら れてきて お り, 固形 腫 瘍^{に ついて は二}重 寒 天 法 (hu ma n tu m o r clo n oge nic a s s ay, H T C A)^{l ) 2)},3‑(⁴,5‑^{ジメ チ ル チ}

アゾル ^ー2 イ ル)一^2,5‑^{ドフ ェ ニ ル テ ト ラ ゾリ ウム ブ ロ ミ ド} (3‑^(4,5‑^{dim ethylth ia z ol}‑²‑yl)‑^2,5‑^dophe nyltetr a z oliu m br o mide,

M T T) ^{ア ッセイ3)な ど が}開 発^{さ れて}きた. しか し, 検 体 中^の正 常 細 胞^の混入 な ど^の技 術 的な問題, ある^いは使用 さ れ た際^の抗 腫 瘍 剤^の血中動 態と感 受 性 試 験^{で の}薬 剤 畳との関 係^{につ い て の} 検 討^が困 難^である な どの問 題^{のた めに}未^だ確^{立 さ れ た}方法^{ほ な}

い^{4 )}. 白血病 細 胞は固 形痛と比べ て検 体採 取^が容 易で , ま た頻 回^に採 取^でき1 感 受 性 試 験^の検 討^にほ都 合が よ^い. Ho ng^o ら⁵⁾ は小児^の白血病にお^いて M T T ^ア ッセイ を行^い, 予測 率が7 0% を超え精 度^の高^い有 益な方 法である と報 告して いる^{. 一} 方, 下 山ら⁶⁾ほ, 従 来^の感 受 性 試験^で峰, 薬 剤を作 用^{さ せ た}後 も^わず かに生き 残り し かも 増殖 能を有 する ような細 胞を測定 する^こと は困 難^であ^り, 再増 殖試 験^{によ り}検 討す^べき^{だ と}述^{べている.} し か し, こ の方 法では手技が極め て煩雑にな り, 判定ま^でに時

間を要 す るという欠点がある^. 本 研 究^でほ簡 便^にし かも 迅速^に 結 果^を得^{ること がで}き^る感 受 性 試 験^である M T T ^アッ セイ を選

び, 株 化 白血病細 胞を 用い て基 礎 的 検 討を行う と とも^に, 得^ら れ た結 果を基に し て, 急 性 白血病お よ び非^ホ ジキン リン パ腫 (^non‑^{Hodgkin'slym pho m a, N H L ) 患 者よ り得た腫 瘍細 胞を 用い}

て本 法^の臨 床 応 用^への 可能 性を検 討し た^. さ らに_, 抗腫 瘍 剤^に 対す^る薬 剤 耐 性^の発 現^は治療^を困難^{に して いる}大 きな要因^の→一

つであり, 近 年 多 剤 耐 性(m ^ul^tidr ugr e sista n c e, M D R) 磯 序^{7 )の} 関与^が注^{目 さ れて い ること か ら,} 本 研 究で^は同時^に M D R ^の発 現^の有 無を 調^べる と とも^に , M T T アッ セイの結 果^{な ら びに}臨 床 効果と^の関 係を検 討し た^.

対 象お よび方 法

Ⅰ. 材 料^およ び 対 象 1 ^. 細 胞 株

基礎 実 験 用^の細 胞 株^は慢 性 骨 髄性 白^血病^の急 性 転 化 細胞 株^で ある K 5 6 2(理化 学研 究所 細胞 開発 銀 行, 和 光, か ら供 与) お よ

平 成8 年⁵ 月^{1 6}日 受付, 平 成⁸ 年⁷ 月^{1 2 日}受 理

A b br e vi^ati^{o n s :} A L L, aCute l_ymphoblastic le uk emi a; A N L L, aCute n Pnly^m ph^obl_{a s}tic leuke mia; A M ixL ･

a c ute mixed lin eag^el^{e u}ke mia; A P A A P , alkalin è_{pho sh ata se a nti}^‑_{alkalin e ph o sp hata s e ; B S A ,} bovin e ser um albu min ; C R, C O mplete r e mis sio n ; D M S O, dim eth_yl sulfoxide ; F A B , Fr ench‑^{A m eric an‑British ; F B S,}

造血 器腫 瘍^における抗 腫 瘍剥 感受 性 試 験

び そ^の do x o ru bicin 耐性 株^であ^{る K 5 6 2}/^A ( 癌 研究 会癌 化 学 療

法^{セ ンタ ー 1} 東 京, 鶴 尾 隆 博士 よ り供 与) を 4 日^に1 度2 0% ウ

シ胎児^血清 (^{fetal bovi n e s e r u m ,} F B S)(^{G I B C O},Gaithe r sbu rg,

U S A ) 加R P M I1 6 4 0 (^{G I B C O}) で l ^xl O⁵個/ ^mlに希 釈し, 継 代 培養^{し た.} 実 験^には培養4 日 目 で対 数 増 殖 期^にある細 胞^{を 用}

い_, 20 % F B S 加R P M I1 6 4 0 に浮 遊^させ, 実 験^に供し た^. 2 ^. 臨床 検 体

1 9 9 2年^{1 2}月^{か ら1 9 95}年³月まで に金 沢 大学 医学 部 第^三内 科^お よ び そ^の関 連 病 院を受 診した未 治 療 急 性 白^血病 患 者^{2 2}例 (3 2検 体), お よ び末治 療 悪 性^リン パ腫 患 者⁸ 例 (⁹検 体), な ら びにそ れぞれ^の再 発^･ 難 治 療 例⁵例 (⁶検 体) お よ び 3 例 (3 検 体) に つい て検 討し た^. そ^の内 訳は急 性 非^リン パ 性 白血病 (a c ute n o nlymphobla sticle ukemi a,A N L L)^{でフ ラン ス}ー^{ア メ リ カ ー}イ ギリス(Fr e n ch‑^{A m e ric a n}A^{British, F A B}) 分 類^{8 )の} M O が 2例,

M l, 2 例, M 2,1 1例, M 3, 1例, M 4, 3 例, M 6, 1 例^{お よ} び混合 性白血病 (^{a c ute mix ed lin e a}g^e le uke mia, A M i_xL) が 2

例^であ^っ た^. 急 性 リン パ 性 白血 病 (a c ute l_ym phobla stic

le uke mia,A L L ) で は L 2 が 3 例^であ^った. 悪 性^{リ ン パ}腫^でほ全 例が N H L であっ た^. こ のう ち末 治 療 例^の A N L L の1 7例と A M ixL ^の2 例^につ い ては, 同 時^{に M D R の}検 討 も行^った.

1) 骨髄 液1 末 梢血

臨 床 検 体^でほ リン フ ォ プ レ ッ プ(Nyc o m ed P ha r m a As,

Oslo, No r way) ^{に て} 単 核 球^だ け^に 分 離 ^し, 2 0 % F B S 加

R P M I1 64 0 に浮 遊さ せ, 実 験^に供し た^. 2) リン パ節

生検^{リン パ}節^は半 切し たも^のを用^い , 2 0 % F B S 加 R P M I 1 640 の中^で無 菌 的^にハサ ミ で細 切した. そ^の後^{1 5}恥^{m のステ}

ン レ ス メ ッ シ ュ に通^し, さ らにリン フ ォプレップ を 用い て単核 球を分離し, 実 験^に供し た^.

Ⅱ. 方 法

1 ^. M T T ^アッ セイ

M o s m a n n^3}. お よ び Ho ngo ら^{5 )}の方 法^に準^じ, 以 下^の検 討^を 行^った.

1) 基 礎 実験

ドキソ ル ビシ ソが最 終 的^{に 0.0 5}F^Lg/ ^ml,0.5〃g/^{ml,5 FLg/ml に}

な る よ うに 2 0 % F B S 加 R P M I1 640 で調 整さ れ各ウ ^ェ ル

15恥1ずつ分 注^してあ^{る 9 6 ウ エ ル マイ ク ロブ レ ー ト}( 9 6 ^{w e}11

C ellc ultu r eclu ste r359 6) ( Co sta r^, Co r ning^, U S A ) ^に, 上記^の細 胞 株 浮 遊 液を 5仙1 ずつ 分 注し た . 次^に 分 注^{し た}細 胞^を

5% C O2 の存 在 下^で, 3 7℃で 1 時 間, 2 日間お よ び 4 日間 培養し た. こ の後, リン酸 緩 衝 液(pho sphate‑^{buffe r ed salin e, P B S)}

(pH 7^･6) で希 釈^{し た 5m} g/^{ml の M T T} 試 薬を 2 5pl ず^つ添 加 し, 37 ℃でさ らに3 時 間培 養し た^. そ^の後, 2 0 0 0 回転^で1 0分 間 遠心 し, M T T フ ォ ル マザンを 吸引^{し ない}よ うに注 意し な が ら 上清^を除 去し た^. さ らにジ^メ チ ル ス ルフ ォキ^シ ド ( dim ethyl

S ulfo xide, D M S O) ( 和 光純 薬, 大 阪)2 0 0pl を加えて虎 絆^し, マ

イクロ フ ォトメ ^ー タ ^ー (E A R 3 4 0) (^{S L T},V ie n n a,A u stria) で,

測定波長5 5 0n m , 対 照6 3 0n m の条 件 下^で測 定した^. な お, コ

ント^{ロ ー} ルと し て抗 腫 瘍 剤^の替わ り に 2 0 % F B S 加R P M I1 6 4 0

fetal bovine seru m ; H T C A, h um a nt_u m or clonog^{e n}ic

50 7

を 1 5恥1 入 れ たも^のを 用^いた^. 抗腫 疹 剤 非 添加 細 胞^{ウェ ルと}添 加細 胞ウ^ェルとの吸 光 度^の差^の抗腫 瘍 剤 非 添加 細 胞^{ウェ ルの}吸 光度^に対 する割合, すな わ ちl

コ ン ト^{ロ ー}ル に対 する 死滅 細胞

の割合を求め, これ を阻害 率 (^{inh ibitio n inde x,ⅠⅠ}) と した^. 2) 臨 床 検 体

抗腫 瘍 剤が最終 的^に理論的 最 高血中磯 風 お よ び その1/^{1 0},

1/^{1 0 0 にな る ように} 2 0 % F B S 加R P M I1 6 4 0 で調 整し各ウ^ニル に 1 5恥¹ず^つ分 注し てある9 6 ウ^{ニ ルマ} イク^ロ プレ ^ー l^､ に, 上記

のよう^に処理 し た検 体を 5 0〃1ずつ分 注^{した. な お}, 抗 腫瘍 剤^の 最 高 濃度^は本 郷ら^{9) 1 0) の}報 告^のよ うに常用量を静 脈 内 投 与L均 等^に拡散した と仮定した とき^の血中 濃度を原 則と した が, 着 色 性の ア ントラ サイク リン系薬 剤^{で ほ}, 吸光 度^に影 響^を与え ない ように更にl/^{2 ‑1}/^{1 0 に}希釈して用^いた^. 表1 に試 験 薬 剤と そ の濃 度を 示 した. 次^に分注^{し た}細 胞^{を 5 % C O}2の存 在 下^で,3 7 ℃ で培 養^{し た. こ の}後, P B S で希 釈^{した 5m}g/^{rn1の M T T} 試 薬 を 2 5〃l ず^つ添 加し,3 7 ℃^でさ らに3時 間培 養し た. その後,

2 0 0 0 回転^で, 1 0分 間遠心 し, M T T フ ォ ル^マ ザンを吸 引^{し ない} よ うに上宿を除 去した^. さ らに D M S O 2 0 0〃1 を加え^て撹拝^し, E A R 3 4 0 で, 測 定 波 長5 5 0n m , 対 照^{6 3 0n m の}条 件下^で測定^し た. な お, 効 果は基 礎 実験 同様, 阻 害率^で判 定し た^.

2^. 細 胞 株を 用^いた基 礎 的検 討 1) 細 胞 数と 吸光 度^との関係

吸光度は, 細 胞数 ある^いは細 胞^の大 きさ, 細 胞^の種 類な どに よって異な り, 細胞 株^と臨 床 検 体^では異な る^こと が予 想さ れ る. 本実 験では, 細 胞 数と 吸光度との関 係を検 討 する た めに_, K56 2/^{A の}細 胞 数を 2,0 0 0個/ ^{ウェ ル , 1 0 ,0 0 0}個/ ^{ウ ニ ル} ,

2 0,0 0 0個/^ウェル , 1 0 0,0 0 0個/ ^{ウ ニ ル} , 2 0 0,0 0 0個/ ^{ウェ ル},

5 0 0,0 0 0個/ ^{ウェルお よ び 7 50 ,0 0 0}個/^{ウェ ルの}7種 類と な る よ う に調 整し, そ れぞれ M T T 試薬^{と 3} 時 間 反応^{さ せ}, M T T アッ セイによ る感 受 性 試験を行^った^. な お, こ の実 験よ り得ら れ た 結 果か ら, 臨 床 検 体^の感 受 性 試 験^{に おい て の}細 胞 数^を調 整^し た.

2) 細 胞 増 殖 曲線

9 6 ウ^エ ル マ イ ^クロ ブ レ ^ー 1^､ に 1×10⁵ 個/ ^{ml に} 調 整し た K⁵6 2/^{A を 5}0 ノ^Jlず^つ分 注^{し 1, 乙 3.4,5,6} お よ び 7 日間 培 養

Tab l_el･ Co n c e n tratio nsofantic a n c e rdr tlg^S

Antic a n c e rdrug^S

Conc e n tra tio n t e st ed(F^L g /^ml) Lo w I_{n t e rm e}d iat e

D_{o x o m}b icin M ito x a ntr o n e D_{a u n o ru}bicin

Methotr e x ate E t^op^{o s}ide

Cy tar abⁱn e

Cisp l^a血

V in c ristin e 4

5 5

0 0

0

｣

5 0 0 0 0 1 3 4 0

0 4

〇.

〇.

1 1 0 3 0 0 0 5

〇.

5 5 1 0 0 0

∞

∞ 5 0

〇.

1 3 4

a ssay^; JA L S G, J^ap^an A d^ult Leuk emia Stud_y G^{r o u}p M D R, m ultidrug^{r es}ista n c e; M D S, m y^elod_ysplastic syⁿdrorn e ; M T T,(^3‑(⁴,5 ^‑dim eth_yl thia z ol^‑2‑yl)^‑2,5^‑dophe nyl tetraz oliu m bro mide; N H L, nOn^‑Hod_gkin^'s l_y mpho m a; N R, n O r e SP^OnSe; P B S, phosphate‑^{buffe r ed s alin e}; P ^‑_{g p}, P^‑_gl_yc op^rotein ;▲^{P R, pa rtial r emissio n}