研 究 性試 験 抗 癌 剤感 受 対 軟部 性 腫 瘍 用 骨 悪 比色法 l く

金沢大学 十 全医 学 会 稚 託 第1 0 0巻 第⁴ 号 7 5 7−^{7 7 1} り9 9 り

3⁻く^{4，5 −d in1 eth}ylthiaz ol⁻2 ⁻_yll^{−2，5 −d}i ph e nylt etraz oli_{u m}

br o m ide 比 色 法を用^い た骨軟部^悪性腫瘍^に

対す る抗癌剤 感受 性 試験 ^の研 究

金 沢 大 学 医 学 部整 形外 科学 講 座 は 任^二富田勝 郎 教 掛

森 川 精

く平成3 年7 月1 7 日受 付1

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骨 軟 部 悪 性 腫瘍に対す る治 療^において化 学 療法は 重要な位 置を占めて おり， 治 療 成績の向上 を目 指し実用的で簡 便な抗 癌 剤 感 受 性 試 験^が望ま れて いる^T 本 研 究は 3⁻く4，5⁻d 血ethylthia z ol⁻2⁻_ylト2，5^．d iphe n⁻ yltetr a z ohu m br omi deく^{M T T}J と 9 6穴^マイ ク^ロ プレ ^ー トく9 6 w en mic r otit_{e r} plateJ，

マイ ク^ロ プレ ^ー ト

リ^ー ダ^ー く^{m u}ltiw eus c a n nin_g spe ctr ophoto m ete rJ を 用^いた M T T 比色 法 く^{M T T a s s a}yl を骨 軟 部悪性 腰 掛^こ対す る抗 癌 剤 感 受 性 試験と し て応用 し， そ の実用性を検 討^{す る}目 的で行った^． 本 法は テ ト ラ ゾ リ ウ

ムく^tetr a z oliu mト塩^{の 一} 種^である M T T が生細 胞^によ^って暗 青色のホ^ルマ ザンtfo r m a z a nl i ^に変化す る

こと を利 用し て お り， 生じ たホ ルマ ザ ゾ塩の吸 光 度 く^OP tical de n sit y，O Dナは^マイ ク^ロ プレ^ー ト リ^ー ダ^ー によ り半 自 動 的^に測 定す ること が で き る⁻ まず，1 1種^{の ヒ}ト骨 肉腫由 来培 養細 胞 株を 用^いて基 礎 的 検 討 を行^った^． 各 細胞 株^{に お い}て溶 解さ れ た ホ^ルマザン塩の O D と細 胞 数は良 好な相 関 関 係を 示 し た^{． こ}れ らの細 胞 株^に対し て最 大 血 中 濃 度において は ア ク チ^ノマイシ ンD ， ア ド リ アマイシ ン， シ スプ ラ チ^ン，

メ ソ トレキセ^ー ト， ビンク リスチ^ン， サ イ ク^ロ フ ォ ス ファミ ドが高^い有 効 率を 示 し た． 最大 血 中濃 度の 1 0分の1 に お いて はこれ ら薬 剤も有効 率は低かった^{． こ}れ らの薬 剤は骨 肉 腫^に有 効と さ れ て お り最 大 血 中濃 度^{に お} け る効 果 判 定が適 当である と考え ら れ た■ ま た骨 肉 腫に対す る有 効性が未だ報 告さ れ ていな いエト ポ サ イ ド が^いずれの細 胞 株^に対し て も高^い効_{果 を 示 し}， 骨 肉腫に対す る有 効 性が 示唆さ れ た^． こ れ ら の細 胞 株^に対す る基 礎 的 検 討^の結 果をふま え て， 臨床 材料^に対して M T T 此色 法を 周^いた抗 癌 剤 感 受性 試 験を行^っ た^．過 去2 年間に手 術^{ま た は}生 検^によ り得ら れ た骨軟 部悪性 腫 瘍^{6 7}検 体く5 8症 翻 を 用^い

た^■6 7検 体 中64検 体 く9 6％I ^に感受性 判 定が可能^であっ た．1^xl O憫 以上の細 胞を播 種し た検 体は全て判 定 可能で あ^った^一 感 受 性^の判 定が可 能で あっ た薬 剤 数は平均8⁻4剤であった^■ 3 0検 体につ い て臨 床 効 果 との関連 性を前 向き研 究 くpr o spe ctiv e study，お よ び後 向き研 究 tr etr o spe ctiv e stud_yl ^によ^っ て検 討し た− M T T 比色 法を用^いた感 受 性 試 験の結 果と臨 床 効果 との相 関は． 真 陽 性が1 5検体， 偽 陽 性^{が 2} 検 阻 真 陰性が 1 0検 軋 偽 陽 性が 3 検 体^であ り， 裏 陽 性 率が8 8％， 真 陰 性 率が 7 7％で， 全 体 的な 予測 率は8 3％

であった． 本 法は少な^い材 料^で迅速^に多 数の薬 剤の感受性を簡 便^に判 定でき， 成 功 率も高く臨床 効 果と の相 関も高い こと が 示 さ れ た^一 以 上， 本 研 究^によ り M T T 比 色 法を 用^いた感受性 試 験は骨 軟 部悪 性 腫 瘍

に対す る実用的な抗 癌 剤 感受性 試 験にな り う る も^のと考え ら れ た．

Eey ^{w o r}ds C he m o s e n sitivit y te st， M T T a s s ay， bo n e an d s oft tis s u e S ar C O m a

A b br e viatio n s ニ A C D， a Ctin o m y^cin D_ニ A D M ， ad ri am y^Cin _ニ A ra⁻C ， Cy t^{ar a}b in _ニ B L M ，

ble o m y^cin _ニCD D P， Cis⁻platin u 町 C I_， Cy t^OtO Xic in de x 三C P A

， Cy^Clopho sph am ideニ C Y V A D IC ，

Cy^clopho sh am ide＋vin cristin e＋ad ri am y^Cin ＋d 血eth_yl _tri a z e n o imida z ole c atbo x am ideニ 5⁻Fu

，

5⁻flu o r o u r a cil₃ G C T ， gia nt c ell_tu m o rI H T C A

，hu m an tu m O r Clo n og^{e n}ic a s s ay ニM F H_， m al i_gn an t

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抗 癌剤を 用^いての化 学 療 法は， 骨 軟 部悪性腫瘍^に対 す る治療 体 系^{の 一} 環と し て不 可 欠な もの になって き て いる^{． 一} 方 卜腫 瘍の抗 癌 剤^に対す る感 受 性は， 腫 瘍が 同 ^一病理組織 像で あって も異な り， 同^一 個 体^{で あって} も原 発 巣と再発 巣， 転移 巣な ど の時 期， 部位^の違^いに よっ て異な ること は良く知ら れ て^い る^い2I． し か し， 現 在 行わ れ て^い る化 学 療 法のプロ ト^{コ ー ル} は主^にそ^の組 織 型に応じ て， 経 験 的に有 効と考え ら れ る抗 癌 剤が 用 いら れ て^おり^， 個^々の腫 瘍^の感 受 性の差 異^は考 慮さ れ ていな^い． そ の結 果， 無 効な抗 癌 剤を投 与さ れ た患 者 は そ の抗 癌 剤^の副作用のみ を被ることにな る ば か り で な く， 薬 剤 耐 性の発現^によっ て以後の化 学 療 法に対し て反 応しにくく な る． し た がっ て個々の腫 瘍^に対し有 効な抗 癌剤^{を選 択し， 無 効な抗 癌 剤を排 除す ること が} 望ま し^い． 特に骨 軟部 悪 性 腫 瘍 領 域^{に お い}て は多 剤併 用 療 法が主流である^こと， ま た組 織 塾が非 常^に多 彩で ある^こと， 化 学 療 法の支援が そ の治 療 成 績の向 上に大 き く貢献し て^いること， そ して化 学 療 法の効 果 如 何に よって患 肢温 存が可 能^にな る場 合もある^こと な ど か ら， 個々の腫 瘍に対し て抗 癌 剤^の投 与 前^に有 効， 無 効 を知ること が で き れば治 療に大き く貢 献す る^こと は明 ら か である．

今日 ま でに組 織 器 官培 養 法^瑚， 核 酸 前 駆 物 質を指 標 と し た方 法^珊， ヌ ^ー ド^マ ウス法^{力 朝}， ヒト癌^{コ ロ ニ ー} 形 成法 く^{hu ma n t um O r Clo n oge nic a s s ay，H T C A}J^{q l Ol}な ど 数 多くの抗 癌 剤 感 受 性 試験が試 行さ れ て き た が， いず れ の方法も ^一長 ^一短があり， 簡 便 性， 迅 速 性， 予 言 性 といっ た多く の条 件を満た す臨 床 応用可 能な 理想 的な 感 受 性 試験は未だに確 立さ れ て^いな^いの が現 状であ る^． 3⁻く4，5⁻d im ethylth ia z ol⁻2^．_yll^．2，5^．d i_phe nyltetr a z oliu^． m br o mideく^{M T T}ンは テ ト ラゾ_{リ ウ}ム く^{tetr a z o}liu ml 塩

の ^一 種で， 生 細胞 内の脱 水 素 酵 素^によ り還元 さ れ暗 青 色の ホルマザン げ^{o m a 都}血巨結 晶^に変 化す る特 徴を有 す る^．1 9 8 3年， M o s m a n n^{1 11}はこの M T T と 9 6穴^マイ ク

ロプ^レー トく96w e11 mi c r otite r plateJ^{， マ}イ ク^ロ プレ ^ー ト リ ^ー ダ^ー くm ultiw ell s c a n nin_g sp^{e c}tr ophoto m ete rl を用^いた M T T 比 色 法 くM T T a s s ayl を報 告し た． 著 者はこの方 法の簡便 性， 迅 速 性^に注 目し， 骨 軟 邪悪性 腫 瘍に対す る抗 癌 剤 感受 性 試 験と し て確 立す ること を

意 図し， 検 討を行^った^．

材 料^およ び 方 法

工^． 材 料

実 験^に使用 し た材 料は， 培 養 細 胞と し てヒト骨肉腫 由 来 培 糞 細 胞 株 o ste oge nic s a r c o m a Takas e str ain くO S T ， 当 教 室 ^に て樹 立1， H O S， M N N G⁻H O S，

K H O S⁻2 4 0 S，M G 6 3，K H O S⁻3 1 2 fL K H O S⁻N P，G 2 92く大 日本 製 薬． 大 阪か ら購入I， S K E S⁻1， U⁻2 0 S，S A O S^．2 し住 友 製 薬 研 究 所， 大 阪よ り供 与1 の1 1種を 用^いた． 臨

床 材 料と し て過 去2年 間^に骨 軟 邪 悪 性 腫 瘍^の原発巣，

再 発 巣ま た は転 移 巣^に対し生 検ま た は手 術を行^って得 ら れ た6 7検 体 く5 8症 例1 を 用^いた． その 内訳は骨原発 性 腫 瘍で は骨 肉腫 く^{o st}e o s a r c o m al1 3検 体 く1 1症 例ン， 軟骨 肉腫 くcho ndr o s a r c o m a1 8検 体 く8症 例1， 悪性 線経 性 組 織 球 脛 く^{m a}lign antfibr o u shistit xy t^{o ma}，M F叩5検 体 く³ 症 例1， 脊 索 腰 く^{cho rdo ma}1 2 検 体 く2症 例1，

ユ ^ー イ^ング肉 腰 くE w in_g^，s s a r c o m aI l 検 体 く1症 翻，

悪 性 骨 巨 細 胞 腫く^m ali_gn a nt gia ntc elltu m o r，m align a nt G C Tl l検 体 く1症 例1 で あ りく表 り， 軟 部 腫 瘍^では M F H 9検 体 く8 症 例I， 滑 膜 肉 腫 く^sym O Vi al s a r c o m a1 6 検 体 く5 症 例1， 脂 肪 肉腫く1ipo s a r c o m a1 6検体 く⁵ 症 例1， 横 紋 筋 肉 腫 く^rhab do m yo s a r c o ma1 ⁶ 検 体 く5 症 例I， 平滑 筋 肉 腫くIeio myo s ar C O m a1 3検 体く3症 卿， 悪 性 神 経 鞘 腰 く^{m a}hg^{n a n}t s chw a n n o m 如 3 検 体 く2 症 例1^， 線 推 肉 腫 tfibr o s a r c o mal l 検 体 く1症 例1， 中皮腫 く^{m e s otheho m a}l l 検 体 く1 症 例1 ， 膠 芽 濃 くgliobla st_o⁻ m al l 検 体 く1 症 例ン， 悪 性リ ン パ 腫 くm ah_gn a nt l_叩Ipbo m al l 検 体 く1 症 例I ^{で あった}く表21^．

細 胞 株の継 代 培 養や感 受 性 試 験の際^に は培 地 Ro s w eu Pa rk M e m orial h stitute M ed ia⁻1 6 4 0くR P M I^． 1 6 4 0H 月 水 製 薬， 東 剰 10 ．2g を蒸 留 水9 0 0mlに溶解 し， オ ^ー ト ク^{レ ー} プにて1 2 l^OC ， 5 分^で滅 菌し た も の に_， 7 ％炭 酸 水 素ナ ト リ ウム 3 0 ^へ4 0ml，

ペニ シリン

偶 有 製 薬， 東 剰 1 0 0，0 0 0 U と^ス ト^レプ トマイ^{シ ン}く明 治 製 薬， 束 京ン1 0 0m g， グ^ル タ ミ^ンく協 和 発 酵， 東 副 0^．3g， およ び 5 6⁰Cで3 0分 間加 温し非動 化し た牛 胎児血 清 tfetal bo vine s e ru m ， F B Sl くG ibc o， Ne w Yo rk，

U^．S^．A1^{．1 00ml を}加え て作 成し た組 織 培 養 液を 用^いた^． I工． 抗 癌 剤

抗 癌 剤と し て ア ク チノマイ ^{シ ン}D く^{a ctino m ycin D，}

fibr o u s histic K Iy t^{O m a}三 M M C， mito m y^cin C _ニM T T， 3⁻く^{4，5 −d im eth}ylthia z ol^q2⁻_yll^{−2，5−diphe nyltetr．}

a z oliu m br o mideニM T X ， m ethotr e x ate三O D， Op tical de n si_{t y i} O S T ，O Ste Og^{e n}ic s a r c o m a Taka s e str ain _芸P P C，p^{e a}k _pla s m a c o n c e ntr atio n芸S DI， S u C Cin ic d^eh_ydr og^{e n a s e} in h ibitio n te st 三V C R，

vincristinei V D S，Vin de sin eニV L B，Vin b la stin e