関す 研究 抗癌剤感受性試験法 用 泌尿器悪性腫瘍 対す を

金沢 大 学十 全 医学 会雑 誌 第1 0 2巻 第1 号 2 ^‑ 9 (1 9 9 3)

コ ラ ^ー ゲ ^ン ゲ ^{ル マ} ト リ ク ^ス を用 ^{い た}泌 尿 器 悪 性 腫 瘍^に対 す る

抗 癌 剤感 受 性 試 験 法^に関 す^る研 究

金 沢 大学 医 学 部 泌 尿器科 学 講 座 ( 主 任^: 久住 治 男 教 授)

江 川 雅 之

( 平 成⁵ 年1月4 日受 付)

簡 便^で実 用 的^な抗癌 剤 感 受 性 試 験^の開発を目的と して, コラ ^ー ゲ^ンゲ^{ル マ} トリ クス を 用^いた器 官 培 養 法^に , 3‑^[4,5‑^{d ト}

m ethylthia z oト2,yl]^‑2^,5^‑diphe nyトtetr a z oliu m br o mi de(M T T ) を 用^いた生 細 胞 率 評価 法^を応^{用 し}, そ^の抗 癌 剤 感 受 性 試 験と し て の臨 床 応用の可能 性^を検 討した. コ ラ^ー ゲンゲル マ トリ クス を用^いた培 養 法は, 移 植 腫 瘍 塊^の三次元的 観 織 構 築を長 期 間 保 持可能^であり, 従 来^の器 官培 養 法^{には ない}特 徴を持^っ た方 法である^. す^{で に 3}H‑^{thymi d in e を 用いた}生細 胞 率評 価 法^を応 用し た 抗 癌剤 感 受 性 試 験が報 告さ れ, 試 験 管 外 侮 ^血0)感 受 性 試 験^との高^い相 関性が 示 さ れて いる^, し か し放射 性 核 種を使 用 する た め, 施 行^でき^る施 設^が限ら れ る^こと や手 技が煩 雑^にな る^こと な どの問題がある^. M T T を 用^いた生 細 胞率 評価 法は, 生 細 胞 率 判 定ま での過 程^に細 胞 洗 浄な ど^の煩 雑な操作を 必要と^せず, 簡 便 性, 迅 速 性, さ らに定 量 性^に優^{れ た}方法^であ^{る. こ}れ ら^二つ の方法^の特 徴^を生^{か して}, 腫 瘍 細 胞を 4 日間前 培養し, ひき 続 き3 日間^の抗 癌剤 持続 接 触^{をマ トリクス上で}行ない_, 8 日 目^に M T T を 用い て感 受 性 結 果^が得ら れ る新しい抗 癌 剤 感 受 性 試 験 法(^{コ ラ ー} ゲン ^ー M T T 法₎ を確^{立 し た. ヒ ト}膀 胱 癌 由 来 K K‑^{4 7細 胞 株をヌ ー ドマウスに}移 植^して得^{られ た}腫 瘍塊を 用いた検 討^でほ,

3廿thymid in e を用^いた^コ ラー^{ゲンゲル マ トリクス}

法^によ る抗 癌 剤 感 受 性 試 験と同様の感 受 性結 果が得ら れ, 本法^の臨 床 適 用^の可能 性を 示唆L た. さ ら^に臨 床 材 料4 0検 体^{を 用い} た検 討^ではt 8 5% (3 4症 例) と高率^に感 受 性試 験^の施 行が 可能^であ^った. 腎細 胞 癌^{1 4}症 例^の感 受 性^は, 移行上皮 癌1 5症 例と比^べ 明^{ら かに}低^い結 果^を示^{し た.} 臨床 的^にも, 腎細 胞 癌に対する抗 癌 剤の効 果は非常^に低 く, 本 法^の抗癌 剤感 受性 試 験 法と し て^の 高^い臨床 予 言 性を 示唆 するも^のと考え ら れ た^. 現 在 臨 床効 果と^の相 関につき 追跡 検 討 中^であ^{る が}, 本 法を 用いた新^しい抗 癌 剤 感 受性 試 験^はl 簡 便^で迅 速^に結 果^が得ら れ, どの施 設^でも 実施可能な実 用 的な方 法と して期 待^できる と考え ら れ た^.

Key ^{w o r}ds che m o s e n sitivity ^{t e s t,} COllag^en gel m atrix, hu m a n g^{e n}it ou rinary tu m or, K K‑^{4 7} hu m a n t ran sitional c ell c a r cin o m a, 3‑[^4,5‑^{dim e th}yl thia z ol‑²‑yl]^{‑2, 5}‑^diphe nyトt etr a‑

z oliu m br o mide

個^々の患 者^の腫 瘍^に対^し有 効な抗癌 剤^を選 択 する 目的で_, こ れ ま^{で に}種^{々 の}試 験 管 外 侮 リfぴ 0) ま た ほ試 験 管 内^{(f乃 りか0)の} 抗 癌 剤 感 受性 試 験^が開 発さ れてき^た.

試 験 管 外試 験 法は, 試 験 結 果と臨床 効果との高^い相 関性が認 め ら れ るもの の, 手技が煩 雑^であること や, 試 験結 果^が得ら れ る ま^{で に}長期 間を要 する^こと な ど が問 題 と^{なってい る1 )2 ). ま た}

ヌ ^ー ド^マウス など^の実 験 動 物を多 数 使 用する た め′ 費 用^や動物 愛 護^{な どの}観 点か ら, そ れ^に代わ る方 法が求め られて い る^.

一方 試 験管 内試 験 法は, 手 技が簡 便^で迅 速^に結 果が得ら れ る と^いう 利 点^を持^つが, 臨 床 的^に有 効な薬剤を選 択 する方 法^には

いま だ至って^いない のが現 状^である^{3) 4 ).} そ^{の 一} 国と し^て, ほ と

ん ど^の試 験管 内試 験 法が, 機 械 的^{に ま た ほ}酵 素^{によ り}細 胞 単 離 を行^い得られた細 胞を培 養に用^いる た め 上陸 瘍^の組 織 学 的 構 築 が著しく 破壊される^こと が考え ら れ る.

最 近.Ho錯m a n ら に よ り^{コラ ー} ゲンダルマ ト リ^{ク ス}を用^いた 器 官 培養法 ( 以下^コ ラ ^ー ゲン法) が報 告さ れ, 本 法が移 植 腫 瘍 片

の三次 元 的組 織 構 築^を長 期 間 保 持^でき^る培 養 法^であ^ること が 示

A b br e via･tio n s : A C T‑^{D, a Ctin o m}y^cin D _; A D R ,

さ れ た^{5 ‑.} ま た本法を 用^いた抗 癌 剤 感 受 性 試 験はt 試 験 管 内^の 試 験 法^であり な が ら, 試 験 管 外 試 験 法と^の高^い相 関性を持ち,

しかも 短 期 間^に試 験 結 果が得ら れ る という利 点を有する^{6 )7j.} し か し, 本 法は腫瘍 細 胞^の生 細 胞 率^の 評 価^{に 3汁th}ymidin e によ る オ ^ー ト ラジオグラフ ィ ^一法を 用^いて^い るの で, 手技が煩 雑^で あること や, 放射 性 核 種を 用^{い て い} る た め施 行できる施設^が限

られ る という問題^がある^.

今回筆 者は, 試 験 管 外 試 験 法^の持つ利 点を有 する^{コ ラー} ゲン

法に , 3‑[^4,5‑^{dim eth}yl thia z ol‑²‑^yl]T^{2, 5}‑^{diphe nyl}‑^{tetr a Z Oliu m}

br o mide(M T T ) を用いた生細 胞 率^の評 価 法を応 用し, 簡便^で短

期 間^に試 験結 果が得^{られ る}実 用 的^な抗 癌 剤 感 受性 試 験^{と し て}, コラ ^ー ゲン ^ー M T T 法を確 立したの で報 告 する^.

材 料およ び 方 法

Ⅰ^. 培 養 材 料

当 教 室^{に て}樹^立継 代^{して いる ヒト}勝 胱 癌 由 来 培 養 細 胞 株 K K^‑4 7 細 胞^{a }} を , 1 0% (^v/^v) 非 働 化ウ^シ胎 児血清 (Gi bc o,

adria m y^cin ; C D D P , Cisplati_{n ;} D M S O, dim eth_yls ulfo xid_{e ;} H^‑E , he m ato xylin^qe o si_{n ;} M M C, mito my^cin C ; M T T , 3^‑[⁴,5 ^‑dim ethyl thia z ol^‑2^‑_yl]^{‑2 , 5‑di}phe nyl‑^{tetraZ Oliu m} br o mide ; M T X , m ethotr e x ate ; N C S , n u Clear^‑Chic ag^{o s o}lubili_{z e r ;} O D5 4 0, OP tic al de n sit y ^at 5 40 n m ; P B S,

Gr a nd Isla nd,U S A) ^{お よ びペ ニシ リソ G l O O U}/^ml, ストレプ ト

マイ^{シ ン} 1 0 0〃g/^ml 含 有 R P M I 1 6 4 0培 地( 日水 製薬, 東 京) ^に 浮 遊^{さ せ, 5 ×1 0}ソ^{ml の濃 度に調 整し た. こ のうちの0.2ml を}

2 2 G注 射 針^{に て}生 後^{6 〜 8}適 齢^{の B A L B}/^{c, n u}/^{n u} 雌性^マウ^ス (^三協^ラボサ ^ー ビス

. 東 京) ^の背 部 皮 下^に移 植して得られ た腫 瘍 塊 ( 以下 ^{K K}‑^{4 7} 腫 瘍) を基 礎 的 検 討^に用^いた.

ま た臨 床 材 料と して, 1 9 8 9年9月か ら1 9 9 1年3月まで に金 沢 大学 医学 部 附 属 病 院 泌 尿^器科お よ び そ^の関 連 病 院 泌 尿器科^に て, 手 術ま た は生 検^によ り得ら れ た4 0検 体 ( 移 行上皮 癌1 8症 例,

腎細 胞 癌1 7症 例, 転 移を有する褐 色細 胞 腫2症 例, 前立腺お よ び尿 膜 管 腺 病^{そ れ}ぞれ 1 症 例, 後 腹 膜 横 紋 筋 肉 腫¹ 症 例)を 用 い, コラ ^ー ゲ^{ン ー} M T T 法を施 行し た^.

Ⅱ. 抗 癌 剤

用 ^いた抗 癌 剤^は, ア ク チ ノ ^マイ ^{シ ン}I) (^{a ctin o m}y^cin D^, A C T‑^{D ), アド リアマ イシ ン(adria mycin, A D R ), シスプラ チ ン}

(^Cisplatin,C D D P ), エト ポ^シ ド(^etopo side,V P‑^{1 6), マイ トマイ}

シ ソC (mito r ny^cin C, M M C ), メ ソ ト^レ キ^{セ ー} ト(m etho tr e‑

X ate,M T X), お よ び ビンブラスチ ン(^{Vinb la stin e.}V L B ) の7 剤

である^. 腫 瘍細 胞と^の接 触 濃 度ほ, 各 抗 癌 剤の臨床 投与 時^にお ける 血中 最 高 濃度 (pe ak pla s m a c o n c e nt_{r a}tio n,P P C) を基 準に して, その1 0培, 1培^{お よ び 1}/^{1 0}培^の3 点と し た ^. A C T‑^D,

A D R^,C D D P ^, V P‑^{1 6, M M C, M T X,} お よ び V L B の P P C ほ,

そ れぞれ 0.0 8, 0.6, 2.4 9, 3 4.1 8, 1.5, 2.75 , お よ び 0.7 紬g/

ml を 用いた^9‑,

Ⅲ^. M T T による生 細 胞 率 評 価 法 を用^{い たコラ ー ゲン}法^{に よ} る抗癌 剤 感 受性 試 験(^コラ ^ーゲ ン ^ー M T T 法)

腫 瘍 片^の培 養は, Ho打m a nr _{らの方 法に準じ}

て行な っ た^さ‑. 図 1 に 実験 方 法^{を 示}す^{. 2 4}穴^{プ レ ー ト}( C^{o sta r,} Ca mbrid_ge,

田口ma ntr a n sitio n alc ellc 8 r Cin o ma_, K K^‑ヰ7,rr O m n ud￠mic e

l

Cu lin t oabo ut l O m g f^{r a}g^m e nts a nd w eigh befo r e c ult u r e

Coll且g^{e n}g^el matrix de riY ed fr o m p ig ^sk in

l

Imme r s e with R P M I 1 6 4 0 m ed iu m in 2 4^‑W e11m ultip l^atc

Exp^{o s c l o}t he m ed iu m wi l ha J l ti^‑C a n C e rdr u B^S

1 ^{Cult u r ero r3 days}

^ d d 2 0 0 p l^of M T T s olutio nto makeM T T‑^{fo r m a 2: a n C ryStals}

↓ ^{In c llba t ero r4 hr}

^ d d 1 0 0 p l^orc o11agc n a s c t od ig^{e s t t}he C G M c o mp l^etel y

1 ^{In c ub且t efo r3 0 min}

Re mo Y e S up^{e r n a}ta ntafte rc e ntrifug^atio n

l

Solub il iz et hcc ry^stals with lmlof D M S O

1 ^{EO Y e r ne cp l bi g b t i6plnatt hee da rk}

Tr a n sfe rt hcs olt)b iliz ed c ry^stalsinto9 6^‑Wellmultip l^{a t e} Re &d O D5 40Y &1u e su sings c a n n l TlI g ^{m u}ltiw ellsp^{c c t r o}p h^oto 血 etC r

F i_g･1^･ Pr o c edu r e fo r cher n o s e n sitivi_{t y} te st u sing C G M

a s s ay with e v alu atio n of c ell viabili_{t y} u sing M T T (^{C G M ‑} M T T a s s ay)^.

U S A ) の各 穴 内^に,1 0m m 角^のブタ真 皮 由来^{コラ ー} ゲンゲル^マ ト リクス(He alth De signIndu strie s, Ro che ste r, U S A)(以下^マ

ト リ クス) を ^一 個 ず^つ静置 後,

マ ト リ クス全 体を充 分な培 養 液

で浸し た^, 各 穴 中^の培養 液を^いった ん除 去後, 新しい培 養 液^を

マ ト リ クス の上面ま^で添 加し た( 約^2ml). 次い で細 切し た腫瘍 片を重 量測 定 後, 各^マ トリ クス上に ^一 個づつ静 置し, C O2濃 度 5 %, 3 7 ℃ で培 養^を開始^{し た.} 培 養液^は∴ 週^に2 回の割 合^で新 し^い培 養液と交 換し た^.

培 養後, リソ酸緩 衝 液(pho sphat_e buffe r ed s alin e.P B S) (和 光 純 発, 大 阪) ^にて 2mg/ ^{ml に}溶 解 ^{し た M T T} (S igm a,St^. Lo ui^s, U S A ) 溶 液2 0 0F^Ll を , 各 穴^にそ れぞれ添 加し( 最 終 M T T 濃度2 0 0p g/ ^ml) 4 時間 接 触^{さ せ}, M T TT^{フォ ル マザンを} 生 成さ せ た^. 次^いで, 0^.5% ^コ ラゲナ ^ー ゼ(c ollage n a s e t y pe l,

比 活 性 1 3 8 U/r nl) (W o rthing to n B io che mic al Co., Fr e ehold,

しS A ) 1 0恥1 を添 加^し30分間 接 触 後, マ トリ^クスを完 全^に溶 解 し た^. 3 0 00rpm で1 0分 間 遠心 し, 上清を吸 引除 去した. 沈 漆に ジメ チ ルス ル フ _ォキシ ド ( dim ethyls ulfo xide, D M S O )( 和 光純 薬) を 1^ml 添 加し, 暗 所で室 温 下^{に 一} 晩 静 置 後, 生 成し た M T T‑^{フ ォ ル マザンを}溶 解^{し た.} 各穴か ら D M S O に て溶 解^し た M T T‑^{フ ォル マザン溶 液2 0 0pl を, 9 6穴プレ ー ト ( Co sta r})^の 各 穴に移し, 波 長5 40n m における 坂光 度(op tic al de n si_{t y} at 5 4 0n m , O D5 1 0) を測 定^{し た. O D}5｡ ｡ 値^{は s c a n nin}g ^{m u}ltiw ell

SPe Ctr OPhoto mete r (Im m u n oRe a^,de r NJ,^{2 0 0 0, 日本イ ン タ ー}

メ _ッ ド, 東 京) を 用^いて 測定し, こ の値^を腫 瘍 細胞^の生 細 胞 率

の指 標と した^.

抗 癌剤 感 受 性 試験^は, 成績^の項で述^べる基 礎 的 検 討^の結 果^に 基づき 下 記^のご と くに施 行し た. 重 量約^{1 0m}g になる よう 細 切 し た腫瘍 片を重 量測 定 後, 4 日間培 養し た後, 各 穴 内の培 養 液 を各 種 抗癌 剤^を含^む培 養 液^と交換し た^. さ ら^に3 日間培 養 後,

上述^{の M T T} を用^いた腫瘍 細 胞^の生 細 胞 率 評 価 法^にて, 各 種 抗 癌 剤^の抗腫 瘍 効 果を評 価し た. 抗腫 瘍 効 果^は, 抗 癌 剤非処 理群

に対 す^る抗 癌 剤処 理群^の腫瘍 細 胞 残 存 率( % of Co ntr ol) ^{に て}表 し, 次 式^{に て}算 出し た^. 腫蕩 細 胞 残 存 率⁼ T/^{C xl O O:T ,} 抗 癌 剤処 理群^の腫 瘍 片^{1 0m} g あ^{た りの}平均^{O D}5 ｡ ｡ 値: C ^, 抗 癌 剤 非 処 腰群^の腫 瘍 片^{1 0m}g あた りの平 均O D5 ｡ ｡ 値^. 抗 癌 剤非処 理群

お よ び抗 癌 剤処 理群とも^一 群⁶ 穴ずつ を培 養^に用^いた.

Ⅳ.

3H‑^{thymid in e に よ る}生 細 胞 率 評 価 法 を用 い た^コラ ^ー ゲ ン法に よ る抗 癌 剤 感受 性 試 験 (^コラ ^ー ゲン ^ー3H ^‑thymi^‑ d in e 法)

■Ⅲ^. で述^べた方法と 同様^に, 腫 瘍 片^の培 養お よ び抗癌 剤 処^理 を施 行後, 下記のご と くに生 細 胞 率を評 価^し感 受 性 試験を施 行 し た^仙. 培 養 後, 0^.2pC i/ml に溶 解し た ³汁thymidin e (比 活 性 2 4^.8pC i/^{ml) ( A m e r sha m , Gr e e n which,} しS A ) を含む新し^い培 養液と交 換^し, C O2濃度5 % , 3 7 ℃でさ らに2 4時 間 培 養し た^. 培 養後^の各 穴を,P B S に て 3 回洗 浄 後▲1.5ml の1 0% ^{ト リクP}

ロ酢 酸 (^{t richl}o r o a c e tic a cid,T C A)( S igm a) を添 加した^. 4 ℃ で 2 時 間静 置 後∴腫瘍 片と^マト リクス を液^シンパイ^アル(^{B io vial},

Be ckr rl a n, Fulle rto n, U S A) ^に移^し, 再度1 0% T C A を添 加し た^. 4 ℃で ^一 晩静 置 後,1 0% T C A 3ml で2 回洗 浄 後, 可溶化 剤 (n u cle a r‑^{Chic a}go s olubiliz e r,N C S) (^{A m e r sha m}) を 1ml添 加 し,6 0 ℃^の温 浴 中で腫 瘍 片^{お よ びマト リクス}を溶解^した. 各^バ pho sphate b uffe r ed s alin e ; P P C, p^{e a}k _pla s m a c o n c e ntr atio n; T C A ,tri^chl^or o acetic a cid; T U R, tr a n S u r ethral

r e s e cti_{o n ;} V L B , Vinbla.stin e

甘