動 脈 血 栓 症 の 制 圧

132 (290) 特 報 最 新 医 学 .64巻・ 2号

a‑

^第2008

⁴⁵

^年度回

^{ベルツ賞受賞論文}

2等 賞

動 脈 血 栓 症 の 制 圧

‑V WF‑GPlb 

軸依存性血小板血栓形成を調節する

ADAMTS13

の基礎 ・臨床病態解析‑

藤 村 吉博ホ1

杉 本 充 彦*3

松 本 雅 則

*

*1 

小 亀 浩 市川

Summary 

植 村 正 人事² 宮 田 敏 行*5

The m o r t a l i t y  du

e to 

a r t e r i a l  t h r o m b o s i s  

such 

a s  m y o c a r d i a l  i

nfarction and cerebral  infarction exceeds 

t h a t  o f  m a l i g n a n t  n

eoplasm. is increasin

g  f u r t h e r .  and 

is 

a

lso becom‑

ing a 

b i g  s o c i a l  i

ssue 

i n  o u r  c o u n t r y .  C u r r e n t l y .  a r t e r i a l  t h r o m b o s i s  i

s assumed 

t o  

be 

e s

‑ tablished 

i n   v i v o  

under rheological conditions 

where b l o o d  

flow 

c r e a t e s  

high shear  stress.  Under such conditions. 

t h e  vo

n 

W i l l e b r a n d  f a c t o r  

(VWF)‑platelet  glycoprotein  (GP) Ib interaction plays a definitive 

r o

le 

on p

latelet adhesion and a

g g r e g a t i o n  t

hat 

c o u l d  b

e a key 

e v e n t  

for the formation 

o f  

arterial thrombosis. In this 

r e g a r d .  t h e  b

iologi‑ cal a

c t i v i t y  o f  VWF 

under high s

h e a r  s

tress is absolutely dependent upon its unique 

m u l t i m e r i c  s

tructure. 

t h e  s

ize o

f  which 

is thought to b

e  p

recisely regulated 

i n   v i v o   by 

the r

e c e n t l y  i

dentified specific 

VWF‑cleaving 

protease (ADAMTS13. )Thus. t

h e  a

im 

o f  

our r

e s e a r c h  p r o

ject i

s   t o   overcome a

rterial 

t h r o m b o s i s  t

argeting the functional 

r e l a ‑

tionships between 

t h e  

V WF‑GPlb axis 

and 

ADAMTS13 in platelet thrombus 

f o r m a t i o n .  

In t

h e  i

nitial 

s t a g e  o

f our r

e s e a r c h .  we  hav

e 

f o c u s e d  on t

he structure‑function r

e l a

‑ tionships 

o f  V W

F. 

We 

have 

c l a r i f i e d  t

he several functional 

s

i

t e s  w

ithin the 

VWF 

mole‑ cule 

c r i t i c a

l 

f o r  p

latelet t

h r o r n b u s  f o r m a t i o n .  

In a

d d i t i o n .  o u r  f u n c t i o n a

l studies o

f  VWF  u s i n g  a  p e r f u s i o n  chamber 

system that can reproduce physiologic 

b l o o d  f l o w   i n   v i t r o  

elu

c i d a t e d  t

he shear‑dependent function of V羽TFin  platelet a

d h e s i o n  a

nd 

a g g r e g a t i o n

.  as well a

s  t h e  m o l e c u l a r  mechanisms 

of the 

VWF‑GPlb a x i s  r

egulation by ADAMTS13  under 

b

l

o o d  f l o w  c

onditions. Thus. our 

r e s u l t s  a l t o g e t h e r  

contributed 

t o  e

xtend 

o u r  un

‑ de

r s t a n d i n g s  o

f molecular 

mechanisms f o r  t

he arterial thrombosis. 

In t

h e  p r o g r e s s e d  

stage o

f  

our 

r e s e a r c h

. our 

f o c u s  was 

shifted 

t o  t h e  

pathophysiology 

o f  t

he ADAMTS13 molecule. In p

a r t i c u

l

a r

. 

ana

lyzing the 

p h e n o t y p e

‑

g e n o t y p e  r e l a t i o n ‑ s h i p s   o f   c o n g e n i t a

l deficiency 

o f   ADAMTS13. t

ermed Upshaw‑Schulman 

syndrome 

叫奈良県立医科大学 輸血 部 教授 ・ 叫 同 准 教授 ・2 同 第三内 科 准 教 授 叫同 小 児科 講 師 州国立循環器病センター研究所脈管生理官11室長 時間 病 悶 部 部 長

(2009，2)  _{特 報 133}(291) 

(U

S S )

， 

d u e  t o  

ADAMTS13 

g e n e  m u t a t i o n s

， 

c a n  p r o v i d e   i n   v i v o   p r o t o t y p i c  m o d e l  o f   p l a t e l e t  t h r o m b u s  f o r m a t i o n  u n d e r  h i g h  s h e a r  s t r e s s .  But USS i s   a n  e x t r e m e l y  r a r e  d i s ‑ e a s e  o r  o f t e n  m a s q u e r a d e d  a s  a n  i s o l a t e d  t h r o m b o c y t o p e n i a  w i t h  m i l d  c l i n i c a l  s i g n s  d u r ‑ i n g  c h i l d h o o d .  

D u r i n g  t h e  p a s t  1 0  y e a r s

， 

we h a v e  d i a g n o s e d  3 7  p a t i e n t s  w i t h  USS by a s s a y i n g   ADAMTS13 a c t i v i t y  a n d  i t s   i n h i b i t o r  t i t e r s  i n  t h e  l a b o r a t o r y  o f  Nara M e d i c a l  U n i v e r ‑ s i t y .   F u r t h e r

， 

t h r o u g h  a n a l y z i n g  t h e  n a t u r a l  h i s t o r y  a n d  

ADAMTS13 

g e n e  m u t a t i o n s   i n   t h e s e   p a t i e n t s

， 

we f o u n d   t h a t   s e v e r e   n e o n a t a l   j a u n d i c e   t h a t   r e q u i r e s   e x c h a n g e   b l o o d  t r a n s f u s i o n s

， 

a  c l a s s i c  h a l l m a r k  o f  USS

， 

was s e e n  i n  o n l y  1 6  ( 4 3 % )  o f  3 7  p a t i e n t s .   T w e n t y ‑ n i n e  ( 7 9 % )  o f  t h e  3 7  p a t i e n t s  h a d  a  h i s t o r y  o f  t h r o m b o c y t o p e n i a  d u r i n g  c h i l d ‑ h o o d

也

a twas m i s d i a g n o s e d  a s  i d i o p a t h i c  t h r o m b o c y t o p e n i c  p

町

p u r a

(I

T P ) .  N i n e  women 

企

om6  f a m i l i e s  were f i r s t  d i a g n o s e d  d u r i n g  p r e g n a n c y .  F u r t h e r

， 

we d o c u m e n t e d  t h a t   t h r o m b o c y t o p e n i a  i n e v i t a b l y  d e v e l o p e d  d u r i n g  t h e  2nd o r  3 r d  t r i m e s t e r s  o f  a l l   1 6  p r e g ‑ n a n c i e s  i n  t h e s e  9  women. O f t e n  t h e  i n i t i a l  i s o l a t e d  t h r o m b o c y t o p e n i a  was f o l l o w e d  by  o v e r t  s i g n s  o f  m i c r o a n g i o p a t h i c  h e m o l y t i c  a n e m i a  a n d  t h r o m b o t i c  t h r o m b o c y t o p e n i c   p u r p u r a  ( T T P ) .  N o t a b l y

， 

o f  t h e i r  1 6  p r e g n a n c i e s

， 

8  i n f a n t s  were s t i l l b o r n  o r  d i e d  s o o n   a f t e r  b i r t h :  t h e  r e m a i n i n g  8  were a l l   p r e m a t u r e  b u t  s u r v i v e d .  S i x  o f  t h e s e  9  women  h a d  t h e  e p i s o d e s  o f  s e v e r e ‑ t o ‑ m i l d  t h r o m b o c y t o p e n i a  d u r i n g  c h i l d h o o d  t h a t  had b e e n   i n c o r r e c t l y  d i a g n o s e d  a s  I T P .  

I n  e x t e n s i o n  o f  t h e  a b o v e m e n t i o n e d  s t u d i e s

， 

we h a v e  i d e n t i

五

e dt h a t  t h e  f o l l o w i n g  d i s ‑ o r d e r s  i n c l u d i n g  TTP a r e  r e l a t e d  t o  a c q u i r e d  d e f i c i e n c i e s  o f  ADAMTS13 a c t i v i t y  w i t h   a n  a p p e a r a n c e  o f  U レ VWFM:b r a i n  i n f a r c t i o n

， 

r e n a l  i n s u

伍

c i e n c y

，

h a b i t u a l  a b o r t i o n

，日

v ‑ e r  c i r r h o s i s

， 

l i v e r  t r a n s p l a n t a t i o n

， 

a c u t e  s e v e r e  p a n c r e a t i t i s

， 

h e p a t i c  ven ← o c c l u s i v e  d i s ‑ e a s e

， 

c a r d i a c  i n f a r c t i o n

， 

and s l e e p i n g  a p n e a  s y n d r o m e .  Thus

， 

d u r i n g  t h e  p a s t  few y e a r s

， 

C o p e r n i c a n ‑ l i k e  c o n v e r s i o n  h a s  b e e n  made o n  t h e  u n d e r s t a n d i n g  t h e s e  d i s e a s e s .  E v o l u ‑ t i o n  o f  new r a p i d  a s s a y s  e v a l u a t i n g  ADAMTS13 a c t i v i t y  d e v e l o p e d  by o u r  r e s e a r c h   g r o u p  c e r t a i n l y  a c c e l e r a t e d  t h i s .  F u r t h e r

， 

t h e  i d e a  o f  c o n t r a i n d i c a t i o n  f o r  p l a t e l e t  t r a n s ‑ f u s i o n s  t o  t h e  p a t i e n t s  w i t h  s e v e r e  d e f i c i e n c y  o f  ADAMTS13 a c t i v i t y  h a s  a l s o  b e e n  w e l l   e s t a b l i s h e d

， 

b e c a u s e  o f   c o n f i d e n t  o b s e r v a t i o n s   o n  p l a t e l e t   h y p e r a g g r e g a b i l i t y  u n d e r   h i g h  s h e a r  s t r e s s  i n  t h e  p r e s e n c e  o f  U L‑ VWFM. 

目

1 .はじめに

2 .   v o n  W i l l e b r a n d

因子 1)構造と機能

次

2 )

高ずり応力下での

VWF

依存性血小板 血栓形成メカニズム

3 .   ADAMTS13  1 

)構造と機能

2 )   ADAMTS13

産生細胞

3 )   ADAMTS13

活性測定法の開発 4)ずり応力と

ADAMTS13

活性

5 )   ADAMTS13

のずり応力依存性機能特性 に基づく止血メカニズム制御理論

134(292) 特 報

4 .

血小板血栓症の病態解析 1 )血栓性微小血管障害症

( 1 )   Upshaw ‑S chulman

症 候 群 :

USS

の 病態解明と

ADAMTS13

遺伝子解析

( 2 )

後天性

TMA

i )

特発性

TTP

難 治 性

TTP i

i)二次性

TMA

薬剤性

TMA

謬原病合併

TMA

2)肝臓とその他臓器(勝臓，心臓)におけ る微小循環障害

( 1 )

造血幹細胞移植後

VOD

(2)生体肝移植

(3)慢性肝疾患 (4)アルコール性肝炎 (5)重症急性勝炎 (6)虚血性心疾患

5 .

動脈血栓克服に向けて

1 

. は じ め に

平成

1 9

年度の本邦死亡者数の第2位と第3 位を占める心疾患、および脳血管疾患の殆どは，

心筋梗塞や脳梗塞などの動脈血栓症であり，そ の制圧は急務である.

動脈血栓症は，粥状硬化などの血管壁の変 化・変性を起点とした壁血栓形成が病態生理の 基盤で，血管壁のプラーク破裂に引き続く急速 な壁血栓成長による破裂部位局所での閉塞，も

しくは血流にのった破裂壁血栓塊による下流で の血栓性塞栓で引き起こされる.生体での壁血 栓形成は，血管破綻部位の血管内皮下組織への 血小板粘着で始まり，引き続き，粘着血小板が 互いに結合し凝集塊を形成することで血小板血 栓(一次血栓)を生じる.近年，動脈などの速 い血流における血小板血栓形成に，

von W i l l e ‑ b r a n d

因子

(VWF)

が極めて重要な役割を果 たしていることが明らかとなった.

したがって，

VWF

機能の制御は動脈血栓症 の制圧に繋がると考えられ，我々は

1 9 8 0

年代 半ばから

VWF

研究に関して，特にこの因子

最新医学・ 64巻・ 2号

の構造・機能相関や主たる血小板膜受容体

g l y ‑ c o p r o t e i n  ( G P )  I b

との結合反応メカニズムの解 明を進めてきた(後述).

VWF

の血小板凝集・

粘着機能は，

VWF

マルチマー

( M )

構造に依 存し，重合度の低い低分子量

VWFM

は血小 板粘着・凝集活性が低く，出血傾向をもたらす ことは従来から知られていたが，超高分子量

VWFM  ( u n u s u a l l y ‑ l a r g e  VWFM  :  U レ VWFM)

では逆に，血栓傾向を引き起こすことが明らか になってきた1).

2 0 0 1

年に同定された

VWF

特 異的切断酵素ー学術名

ADAMTS13(

後述)ー がこの

U

レ

VWFM

を適度に限定分解し，

i

止 血には適切」であるが， i病的血栓とはならな い」ように，生体で

VWF

機能を精妙に制御 していると考えられるようになった.

VWF‑

GPlb

軸反応は，血流環境に強く依存してお り，心筋梗塞などが生ずる動脈血流で最も効 果的に機能する.すなわち生体動脈内では，

VWF‑GPlb

軸依存性血小板血栓形成と，そし てこの反応を調節する

ADAMTS13

の機能連 関が，生体防御に必須である「止血」から，逆 に生命維持の脅戚となる「動脈血栓症」に至 る双方の機構を支配している.これより現在，

我々の研究の究極の目的は，

iVWF‑GPlb

軸/

ADAMTS13

依存性血小板血栓形成」を制御す ることによって動脈血栓症の制圧を行うことに ある.

このプロトタイプとなる

i nv i v o

モデルに先 天性

ADAMTS13

活性欠損症(別名

Upshaw‑

Schulman

症候群:

USS)

という稀疾患がある.

奈良医大輸血部では過去

1 0

年間に本邦で

8 8 2

例の血栓性微小血管障害症

( t h r o m b o t i cm i c r 。

a n g i o p a t h y  :  TMA)

患者を同定し，これより

3 7

例の

USS

患者を発見した.そこで，

USS

患者 の

n a t u r a lh i s t o r y

解析と共に

ADAMTS13 p h e n o t y p e ‑ g e n o t y p e

解析を行い，本患者の殆

どは小児期に特発性血小板減少性紫斑病

( i d i o

・

p a t h i c   t h r o m b o c y t o p e n i c   purpura: ITP)

と 誤診断されていること，また

USS

女性はその 遺伝子変異に関係なく，妊娠中 後期に全例血 小板減少を来し，その後

TMA

発作がほぼ必

(2009，2) 

発であること，さらに胎児側では約半数が死 産・流産，また生児であっても全例未熟児とい

う驚傍の事実を明らかにした.

ま た ， こ の 研 究 の 延 長 線 上 で ， 後 天 性

ADAMTS13

活性低下を来す病態・臓器は，血 栓性血小板減少性紫斑病

( t h r o m b o t i ct h r o m ‑ b o c y t o p e n i c  purpura: TTP)

に始まり，脳梗 塞，腎不全，習慣性流産，肝硬変，肝移植，重 症膳炎，造血幹細胞移植後の肝中心静脈閉塞症

( v e n ← o c c l u s i v e  d i s e a s e  :  VOD)

や

TMA

，心 筋梗塞，そして睡眠時無呼吸症候群など，まさ に全身諸臓器での微小循環障害(血栓症)に関 与していることを明らかにした(図

1) .  

過去数年間に，これらの病態解析によっても たらされた結果は，まさにコペルニクス的転換 であり，この理由のーっとして，それまでは実 施が困難で，ルーチン検査化が不可能と考えら れた

ADAMTS13

活性の簡易・迅速・鋭敏測 定法が本研究グループで開発され，普及したこ とが理由としてあげられる.またこの普及は，

TTP

のように本来「血小板輸血禁忌

J

とされ る病態を，ほぽリアルタイムで診断できるよう になり，不適正な血小板輸血による医療過誤を 防止することにも大きく寄与している.本論文 では，この聞に我々が明らかにした

iVWF‑

GPIb

軸

/ADAMTS13

依存性血小板血栓形成

J

の分子メカニズムとこれを基盤とした種々の病 態について，基礎と臨床の立場から紹介する.

2 .   von W i l l e b r a n d

因子 1 )構造と機能

von W i l l e b r a n d

因子

(VWF)

は，分子量約

2 5

万の単量体サプユニットがジスルフイド結 合で，

h e a d ‑ t o ‑ head 

(アミノ末端同士)そし て

t a i l ‑ t o ‑

tail(カルボキシル末端同士)様式で 様々の程度に重合した巨大分子からなるマルチ マー (M) 構造を特徴とする糖タンパク質であ る.血液中に循環するほか，血小板の

α

穎粒 や血管内皮細胞の

W e i b e l ‑ P a l a d e

体に貯蔵さ れており，細胞外マトリックス構成成分として も血管内皮下組織に広く分布している2).

VWF 

特 報 135(293) 

の先天性機能欠損症は，

von W i l l e  brand

病と して知られる出血性疾患である.

1 9 7 0

年代の 後半から，

VWF

は血小板膜受容体

( g l y c o p r 。

t e i n  :  GP) I b

との結合反応を経て，血小板粘 着・凝集を司る生体防御に必須の止血因子と理 解されてきた²⁾

我々は

1 9 8 5

年頃から，

VWF

の構造・機能 相関，特に血小板

GP

Ibとの結合反応メカニズ ムの解析に着手した.このために，まず

VWF

蛋白をトリプシンで限定分解し，得られたフラ グメントの解析にて

VWF

サプユニット内の

GPIb

結合機能ドメインの同定に成功し，並行 して行われていた

VWFcDNA

クローニング結 果と照合し，この

GPIb

結合部位が

VWFA1 

ドメインに相当することを明らかにした³⁾ (図

2) 

.次いで，

VWF ー GP

Ib結合反応を制御ある いは修飾する方向に機能すると考えられるコラ ゲンペヘパリン5)および蛇毒ポトロセチン結合 サイト6)も

A1

ドメインに局在することを見出 した.引き続き，合成ペプチドやモノクローナ ル抗体を用いた蛋白生化学的解析を進め，

VWF 

分子の機能解析をアミノ酸レベルにまで発展さ せた川.また，遺伝子組み換え発現蛋白を用 いた遺伝子工学的アプローチで

VWF

サプユ ニットの機能解析をさらに進展させ，

VWF

分 子の

GPIb

結合制御(抑制)メカニズムの概念 を確立したト13) すなわち，正常

VWF

分子に は

GPIb

への結合を正の方向に促進する

On

構 造と，負の方向に制御する

O

妊構造が混在し，

適正な

VWF

の

GPIb

結合機能を維持してい ることを見出した11‑13) これらの

VWF

分子と

GPIb

の結合構造と制御メカニズムの詳細な解 析成果・情報は，後年，我々のグループ研究 員も参画したオランダの研究グループによる

iVWF

分子と

GPIb

分子との複合体の結品構 造解析による立体構造(変化)の解明」ωに結 びついた.

また，これら一連の

VWF

構造機能相関の 研究成果をもとに，

VWF

の

GPIb

結合ドメイ ンの制御をターゲットとする抗血栓療法の開発 を目的として，特異的

VWF

結合蛇毒蛋白や

136(294) 特 報

GP

Ib結合蛇毒蛋白の精製および機能解析も 行った15‑20) また，並行して推進した

VWFA1

ドメインに対する機能阻害モノクローナル抗体 の詳細な解析は，

VWF‑GPlb

軸をターゲット とする抗血栓症戦略における抗体医薬品開発の 端緒となった²¹⁾²²⁾ 構造に関しては結晶構造解 析で大きな山場を越えたが，必

v i t r o

実験系に 血液潅流装置(フローチャンパーシステム)が 導入された

1 9 9 0

年代半ばから，

VWF

の機能 の概念はドラスチックに変貌した.すなわち，

VWF

の

G P l b

結合機能は血流状況(ずり応力) に大きく依存することが判明したかお)

2)高ずり応力下での VWF依存性血小板血栓 形成メカニズム

生体での血流環境は血管により大きく異なる.

特に血液が速く流れている細動脈の狭窄部位や 血管径が細い毛細血管などの血管内壁では，あ る種の流力学的なストレス[ずり応力

( s h e

訂

S廿

e s s )

，または，ずり速度

( s h e a rr a t e ) ]

を受け る(図3)^{却 .}

1 9 9 0

年代半ばにフローチャンパーによる研 究で，

VWF

は高ずり応力下で特異的に，血小 板のローリングから粘着を司っていることが見 出されたお)さらに，心筋梗塞などの動脈血栓 症が成立するとされる高ずり応力下の血小板血 栓形成では，マルチマー構造を持つ

VWF

が 極めて重要な役割を果たしていることが判明し た.このような理由から，我々がフローチャン パーシステムを導入し，可視的なイメージング 手法で，生理的高ずり応力下における血小板血 栓生成過程での

VWF

分子の機能解析を始め た.

血小板はローリングしている聞に次第に活性 化され，固相化

VWF

上に停止し強固に粘着 する

( f i r ma d h e s i o n )

現象が報告されたが，

この過程における血小板活性化メカニズムや血 小板動態は全く不明であった.我々は固相化

VWF

上での血小板粘着過程における個々の血 小板の細胞内カルシウム変化と血小板形態変化 を，新たに構築したイメージング手法で解析し

最新医学・ 64巻・ 2号

たお}お)

固相化

VWF

上での個々の血小板粘着は，

血小板の伸展による非可逆的粘着

( i r r e v e r s ‑ i b l e   a d h e s i o n )

で完結するが，この過程におけ

る血小板内カルシウム動態および血小板形態変 化は図

4

に示すように進行する.まず，血液中 を流れている円板状の血小板は，

G P l b

を介し て

VWF

表面と最初の接触を持つと同時に，

速やかに球状になり偽足を出してローリングを 始める.ローリングの聞に

VWF‑GPlb

相互作 用によって生じる

i n s i d e ‑ o u t

シグナルで活性 化された

α T I b s 3

が

VWF

と結合し，半円球状 に形を変えた血小板が固相化

VWF

上に停止す る

( f i r ma d h e s i o n ) .   f i r m  a d h e s i o n

の時点で は，粘着は未だ可逆的である.次いで，

VWF 

と結合した

α I I b s 3

から

o u t s i d e ‑ i n "

シグナル が入り，血小板内カルシウムが劇的に上昇する.

引き続き，血小板は極端に扇平に伸展

( e x t e n ‑ s i v e  s p r e a d i n g )

し，真の非可逆的粘着が完成 する(図4)却制.このカルシウム上昇は，細胞 外カルシウムの細胞内流入によるものと考えら れた.これらの成績によって，

VWF ー GP

Ib相 互作用を起点としたインテグリンシグナリング の分子機構を解明し，生理的意義が明らかでな かった

VWF

上での血小板の形態変化と機能 相関を明らかにできたと考えている.

粘着に引き続き，

t h r o m b o g e n i c  s u r f a c e  

(固 相化

VWF

やコラゲンなど)に粘着した血小 板は次々と血流にのって供給される血小板を捕 獲・結合(血小板凝集反応)し，壁血小板血栓 が空間的に成長する.古典的概念では血小板凝 集はフイプリノゲンの分子糊機能が司ると考え られていたが，高ずり速度下では粘着過程と同 様，

V W F ‑ G P l b α

相互作用と

VWF

ーインテグ リン

a I I b s 3

結合反応が主役を演じることを明 らかにした(図

5) 

27)28) .高ずり速度下では粘着 蛋白も速いスピードで流れており，この状況下 でフイプリノゲンをはじめとした

VWF

以外 の血柴粘着蛋白は，損傷血管壁に粘着した血 小板

α I I b s 3

に直接反応し得ない.ここでもま ず，

VWF

が

2

段階メカニズムの特性を発揮し

(2009.2)  特 報 137(295) 

図1 VWF‑GPlb軸/ADAMTS13との関連が注目されている臓器・疾 患

豚 原病(SLE等) TMA 

睡 眠時 無呼吸症 候 群

脳梗塞 +ー‑~ ^{IAUAIVlI >:n.)以 ザ1}ヱj一一 + 心 筋 梗塞 もやもや病

(USS) 

/  〆 ^¥ 

^{造血幹細胞移植後}

腎不全 習慣性流産 TMA 

肝硬変 重症騨炎 肝VOO

(USS) 

肝 移植

図2成 熟VWFサブユニットのドメイン構造とV WFのマルチマ一重 合

VWF s u b u n i t  

Tyr1605・Met1606 (842・843)

色

^D3 

^{A l}  

^{A2  A3  D4  1}

1

^‑

1 1

³

‑ ‑

 ^{C1  C2} 

出

VIII (0 ) 

Collagen (A3) 

成熟 VWFサプユニットは 2.050倒のアミノ酸残基で構成され，

N

末端の D'ドメインから始まる 繰り返しドメイン構造をとる.Alドメインには GPlb結合部位， A2ドメインには ADAMTS13 切断音I~位が局在する.このサプユニットが各々アミノ末端，カルボキシ末端のジスルフィド結合に

より，マルチマー構造をとっている.矢印は ADAMTS13による切断部位.

て 粘 着血 小板 上 の GPlba と 相 互 作用 した後，

αllbs3に 結 合 す る.す な わ ち ， 最 初 の 固 相化 V WFへ の 1層 目 の血 小板 粘 着 メ カ ニ ズ ム の 裏 返しの 現 象 ( 固 相化 血 小板 へ の血紫 V W Fの

強固 な 結 合 ) が 起 こ る の で あ る.次 い で ， 粘 着 血小 板 に 捕 獲 さ れ た V WF分 子 上 を血流 中 の 血 小板が，やはり 2段 階 メ カニズ ム でローリ ン

グ し て ， こ れ に 粘 着 す る こ と で2陪 目 の血小 板

138 (296) 特 報

図3血管内のずり応力

c‑コ 1= コ 1= コ 1= コ 1=

。 ^o

^{赤 血 球}

0 0  

血管内皮細胞 流速 (u)

す '

du 

r 

(ず り 応力 :

s h e a r  s t r e s s )   = 

J1 (粘 度)

x

一一 (ずり速度:

s h e a r  r a t e ) 

dr 

最新医学.64巻・2号

1Ul管内では部位によるスピードの追い (内腔の中央部は述く， lUl管壁側は血流が遅い)から，ずり 応力 (ずり速度)が生じる.ずり応力は]11管径に反比例し血流速度に比例するため，一般的に静脈 内は低ずり応力であり，細い動脈内では高ずり応力である.

図4固相化VWF上での血小板粘詰過程における血小板活性化と形態変化

ローリングする 涼状血小板い偽足) 血流中の

1 . 1   ( G P   I b   ‑V W F

相互作用) 円鐙状血小径

G P   I b ‑ V W F

相互作用からの

〆

Inside‑outシグナル

: I f f  

(

非カルシウム

osci Ilation)  ^{....，インテグリンαIIb}

s

³ 

の活性化

v 

V W F I

こ結合した活性化

αIlbβ3からの Outside‑inシグナル

血流中の円板状の血小板は面相化 VWFに接触し，偽足形成とともに球状に形態変化してローリン グする.引き続き図の下部に示すような活性化過程を経て半球状形態→伸展へと進み，非可逆的 粘活に至る.

粘活が完成する.高ずり速度下での壁血小板血 栓の空間的成長は， VWFの機能で粘着過程を 2層目， 3層目と繰り返すことで成立すると考 え ら れ る ( 図5).VWFが血 小板J(fl栓 の 土 台 を作った後，やや遅れてフイブリノゲンなどの 他の粘着蛋白が，速い血流に暴露されない血栓

深 部 の 活 性 化 イ ン テ グ リ ン αIIbs3と結合し，

血栓 強 度 を 高 め て い く と 考 え ら れ たト却) すな わち， 心筋 梗 塞 な ど が 成 立 す る 動 脈血流におい ては， VWF 

‑G P l b  

í1ï1~ がJ([l小板lÚl栓形成機構に 重要な役割を演じている.

( 2 0 0 9

，

2 )  

3.  ADAMTS13 

1 )構造と機能

VWF

を特異的に切断することで血小板血 栓形成能を制御している因子として，近年，

VWF

切断酵素

ADAMTS13

が同定された.

ADAMTS13

遺伝子は，染色体

9 q 3 4

に存在し，

2 9

個のエキソンからなる.一次構造の特徴か ら，細胞外分泌型の亜鉛メタロプロテアーゼで ある

ADAMTS

ファミリーの一員として分類 される.翻訳されるペプチド鎖は

1

，

4 2 7

アミノ 酸残基で，

N

末端側から順に，シグナル配列，

プロペプチド領域，メタロプロテアーゼドメイ ン，ディスインテグリン様ドメイン， トロンポ スポンジン

1

型モチーフ

( T s p 1 )

ドメイン，

システインリッチドメイン，スペーサードメイ ン，さらに

7

個連続した

Tsp1

ドメイン，

2

個 の

CUB

ドメインとなっている(図6).細胞 外に分泌された

ADAMTS13

は，シグナル配 列とプロペプチド領域が切断除去されており，

1 . 3 5 3

アミノ酸残基からなっている.糖鎖が付 加しており，

SDS

ポリアクリルアミドゲル電気 泳動で約

190kDa

のバンドとして検出される.

ADAMTS13

の生理的基質として同定されて いるのは

VWF

のみであり，

A2

ドメインの

Y 1 6 0 5 ‑ ‑M1606

間ペプチド結合が切断される (図

7

).我々は，

ADAMTS13

が

VWF

を切 断するにはメタロプロテアーゼドメインからス ペーサードメインまでが，必要かつ十分な領域 であることを示した31).

ADAMTS13

のシステ インリッチドメインおよびスペーサードメイン を除去すると

VWF

切断活性が消失すること と，後天性

TTP

患者の自己抗体の主要エピ トープがシステインリッチ/スペーサードメイ ンに集中していることから，これらのドメイン は

ADAMTS13

の酵素機能にとって極めて重 要であることを明らかにした(図

8

)31). 

我々は，前記の

Upshaw ‑S chulman

症候群

(USS

，先天性

TTP)

患者家系の

ADAMTS13

遺伝子解析の過程で，健常者にも見られる複数 種のミスセンス多型

( m i s s e n s eSNP)

を同定

特 報

1 3 9 ( 2 9 7 )

し，その中で

P475S

は

ADAMTS13

の活性を 低下させることを見出した却.現在のところ，

ADAMTS13

活性に影響をおよぽすことが明ら かになっている唯一の多型である(後述). 

2) ADAMTS13

産生細胞

2 0 0 0

年，我々の研究グループは「先天性胆 道閉鎖症の末期患者では

VWF

切断酵素活性が 著滅すること，また，これらの患者に生体肝移 植を行い，生着すると同酵素活性が上昇ないし 正常化する」ことを見出し，本酵素の主たる産 生臓器は肝臓であることを報告したお)その 後，

2 0 0 1

年に

ADAMTS13cDNA

が日米欧の 独立した4研究グループから報告されたが^34‑m， 精製酵素の部分アミノ酸配列を用いた

cDNA

クローニングはいずれも肝臓ライプラリーを用 いてなされていたお 却.この後間もなく，我々 は

2

種類の

ADAMTS13

マウスモノクローナ ル抗体

(A10

と

C 7 )

の作製に成功したので，

これらを用いてC型慢性肝炎の凍結肝組織切片 の免疫染色を行った.これにて肝類洞壁細胞が 染色され，形態学的に肝星細胞に合致する所見 であった掛.さらに，共焦点、レーザー顕微鏡に より

A10

抗体と活性化肝星細胞のマーカーで ある

α‑smoothm u s c l e  a c t i n

抗体による二重 染色を行った結果，両者は完全に一致し，本酵 素が肝星細胞(伊東細胞)で産生されることを 同定した甜(図9).また白

s i t u h y b r i d i z a

世.onを 行い，肝星細胞の部分に一致して

ADAMTS13 mRNA

のシグナルが検出されることを確認し たおに肝星細胞はビタミンA貯蔵や肝線維化の ほかに，類洞内微小循環を調節する役割を担っ ている.後に紹介するが， i肝硬変患者の血小板 減少には

VWF

の著増と，反面

ADAMTS13

活 性の著減が関与している」という報告は，この 発見が端緒となっている.

3) ADAMTS13

活性測定法の開発

1 9 9 6

年に報告された最初の

ADAMTS13

活 性測定法は，アガロースゲル電気泳動法40)とポ リアクリルアミドゲル電気泳動法41)であった.

140 (298) 特 報 最新医学.64巻・2号

図5高ずり速度下における壁血小板血栓形成メカニズム

F l o w  

^{‑ ー 司 惨}

司~ ~

淘

P ， 〉 ‑ ‑ ‑ c ， ^{@ GK}

変遷'沿崎忠 義‑ ‑

コラゲジ

Alドメイユムムム..L.RGDS VWF 

4 

盟監

U

̲I̲虫色

1 .

笠 S監

1

.Activated αIlbβ3  GP VI  ̲  Platel ゐ4 α2sl

GPlbα.. 

̲ I I I ! I .  . . .  ̲ ̲  

Kestlngα1 ID t1，j 

〉 ・ ・ 〈

フィブリノゲン フィブロネクチン

高ずり速度下で血小板は障害Jfll管壁に回相化された

VW F

上をローリ ングする.その聞にlUl小板は 徐々に活性化されて， JUl小板の活性化イ ンテグリンαIIbs3が

VW F C l

ドメインと結合することで，

固相化

VWF

上に停止して粘着する.同時に，血小板が内皮下組織コラゲンと結合し，粘着をより 強回にする.その後， 粘着サイクルを繰り返すことで血小板Jfll栓は成長し， フイプリノゲンなどの 粘着蛋白と活性化インテグリンαIIbs3との結合が血栓深部を中心に進行し，JUl栓強度を高めていく.

図6

ADAMTS13

のドメイン構造

v 一 議 ‑

決 P

一 回 ー し い ︑

BR

^{蛇性;宣伝議出血因子:精子表面蛋白}

^{( (MP+D M P + D}

^{構造)構造)}

P475S (

日本人のcommonSNP)  aa  1 

¥一一γ̲̲) 後天性

TTP

自己抗体

200  400  600  800  1000  1200  1427 

9q34:  肝星(伊 東)細胞 血管内皮細胞 血小板

腎臓podocyte

S:

シグナルペプチド，

P

プロペプチ，ド

MP:

メタロプロテアーゼ，

D

ディスインテグリン，

T t ‑T a :

トロンボスポンジン，

C

システインリッチ，

S p :

スペーサー，

CUB:  CUB

ドメイン

いずれも，

VW FM

を血紫 と 反応 さ せ ， そ の 切 断 の 程 度 を ウ エ スタ ン プロッテイングで調べる 手 法 で あ る.ADA MTS13の 同 定 に 結 び つ い た

優 れ た 手 法 で あ っ た が ， 操 作 が煩 雑 で あ り ， 測 定 に 数日を要することから， 臨床 検 査 と し て 広 く 普 及 す る も の で は な か っ た.その後， コラゲ

特 報

(2009，2)  141 (299) 

図7ADAMTS13によるVWFの切断とその切断部位を特異的に認識するモノクローナル抗体N10

2 8 0  kD 

N‑terminal dimer 

〈 惑

Nl 0 

3 4 0  kD 

C‑terminal dimer  act‑ELlSA 

Tissue localization 

×町田

N a

xド国門﹀﹀

×田守守

α

×F

∞町 ト

話

回 由 主 活ZB

否︒∞﹀﹀×由

F D

F﹀﹀

×町内

F Fト

(ト﹀﹀}J=3L

B 

kDa 

ADAMTS13ドメインの機能解析 図8

200 ‑ 116 ‑ 97‑ 66‑

45‑ 31‑

V内問問円ι×h

∞門

﹀〆×AVHU又u

v内 ∞

∞唱EP

V(申守h﹄

t ar

x∞O∞﹀J

V内申一

︹) 一足

︑ r×m

門 = ↑

{ト﹀J)=2

h L

トコ

・ ・ ・ ・ ・ ・ 圃 ・ ・ ・ ・

圃 園 田 園 圃

A 

Full{WT)  T1135X  W1016X  W808X  W746X  W688X  T581X  Q449X  W387X  P285X 

D 

200‑

116 ‑ 97‑

66一

一 一

51 

C 

A : FLAGタグを付けた 10種類の ADAMTS13変異体を HeLa細胞で発現した. B : T581X以外は上清に分泌された.

c :

発現上清の ADAMTS13活性を確認するため， VWF切断反応後 SDSアガロースゲル電気泳 動 (マルチマ一法)を行い， C/Spドメインを欠損すると活性が消失することを確認した. 0:患者I似紫から精製した IgGとの反応性より， C/Spが後天性 TTP患者のインヒピターの認識

部位であることを確認した.

の 特 異 的 基 質 と な り 得 る

の 最小領 域 Asp1596‑Arg1668 (73アミノ酸 残 基 ) を 特 定 す ることに成功し， VWF73と 命 名 し た<12) VWFMに 比 べ る と は る か に 短 い べ ADAMTS13  VWF 

ン結合能測定法， 抗 体 サ ン ドイツチ法， リス

ト セ チ ン 血 小 板 凝 集 測 定 法 な ど が 考 案 さ れ た が ， こ れ ら も 再 現 性 や 感 度 に 問 題 が あ り ， 汎 用 化 さ れ る に は 至 ら な か っ た . そ こ で 我 々 は ，

1 4 2 ( 3

∞ ) 特 報

プチド基質が利用できることになり，活性測定 系のデザインの自由度が上がった.

VWF73

を 利用することにより，我々の研究グループは 二つの簡便測定法，すなわち

FRET

法制と

act‑ELISA

法ωを開発した.

最初の

FRET

法 で は ， 消 光 性 蛍 光 基 質

FRET S ‑ VWF73

を 用 い て い る . こ れ は ，

VWF73

の切断部位をはさむように蛍光基と消 光基を付加した化学合成ペプチドである(図

1 0 )  

.蛍光基と消光基の間で起こる蛍光共鳴エ ネルギ一転移(自

u o r e s c e n c er e s o n a n c e  e n e r g y   t r a n s f e r  :  FRET)

により，反応前には励起光

を照射しでも蛍光は弱いが，

ADAMTS13

に よって切断されると蛍光が強くなる.測定手順 の簡便性と，結果が得られるまでの迅速性に特 に優れており，現在最も普及している方法であ る.次に開発した

c h r o m o g e n i cact‑ELISA

法 では，

VWF73

の

N

末端側に

GST

タグを結合 した大腸菌組み換えタンパク質

GST‑VWF73

を基質に用いている.本法においては，

VWF  A2

ドメインが

ADAMTS13

で切断された際に 生じる断端アミノ酸残基

( T y r 1 6 0 5 )

を特異的 に認識するマウスモノクローナル抗体

( N 1 0

， 後述)の作製に成功したことが，その開発に結 びついた.正常活性の

0 . 5 %

という低活性を判 別できる感度と，汎用的な

ELISA

操作で活性 を測定することができる利点がある.

FRET

法および

act‑ELISA

法は，近年，複 数社からそれぞれの測定用キットが販売される ようになり，その利便性と実用性から国内外で 高く評価されている.我々の研究グループで，

まずその「汎用化

ADAMTS13

活性測定法 の原理」が明らかにされ，次に「キット化」さ れて世界に出回るようになり，これにて新規

ADAMTS13

活性依存性疾患が数多く発見され るようになった.それ故，我々はこれらの病態 解析で，世界の競合研究のフロントラインにい る.

4)

ずり応力と

ADAMTS13

活性

ADAMTS13

の

VWF

切断活性の重要性が

最新医学・64巻・ 2号

広く認識されるようになった当初から，生体に おける

ADAMTS13

活性発現メカニズムにつ いての情報は乏しかった.実際

， i n   v i t r o

の 静止実験系において，生理的な中性バッファ ー条件下では，

ADAMTS13

は

VWF

切断活 性を示さない.我々は，生体ではずり応力が

ADAMTS13

活性に関与しているのではないか と考え，必

v i t r o

血液潅流装置を用いたフロー 実験を行った.

ADAMTS13

活性を完全にプロックする抗

ADAMTS13

モノクローナル抗体

( A 1 0 )

却を用 いた阻害実験で，高ずり速度血流状況下の固相 化コラゲン上での血小板血栓形成過程における

ADAMTS13

機能を評価した.

1 2

，

0 0 0  

S‑1とい う

VWF‑GPlb

結合反応よりもはるかに高いず り応力での血液潅流において，

ADAMTS13

活 性をプロックした場合のコラゲン上での血栓形 成はコントロールに比較して迅速かつ有意に充 進していた(図

1 1 )

.この成績は，

ADAMTS13 

が高ずり応力下における血栓成長を制御してい ることを明確に示している.

次に，この極めて高いずり応力下で形成され た血栓内のどの部位で実際に

ADAMTS13

が

VWF

を切断しているのかを，前述のユニーク なモノクローナル抗体

( N 1 0 )

を用いて検討し た.この

N10

は，

ADAMTS13

により切断さ れる

VWFA2

ドメインの断端アミノ酸残基

Tyr1605

からアミノ末端側に連続

1 0

個のアミ

ノ酸配列からなる合成ペプチドを作製し，これ をキャリア蛋白に結合後，免疫原に用いて作成 した.特にクローン抗体のスクリーニング時に は様々の合成ペプチドを用いることにより，ア ミノ酸残基

Tyr1605

を特異的に認識する抗体

( N 1 0 )

が得られたω.

N10

抗体は切断された

VWF

にのみ特異的に反応するため，この抗体 の反応性は

ADAMTS13

の

VWF

切断活性を 直接的に反映する.形成された血栓に対するこ の抗体の反応性を検索したところ，血流に直接 暴露され，かつ血栓成長の前線基地である血栓 表面部で優先的に

VWF

が切断されているこ とが判明した(図

1 1 )

樹.さらに，この血栓外

(2009.2)  _{特 報 143(301)} 

図9ADAMTS13は肝星細胞に局在

A  I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y   B 

._a (A~JOl 、

三

戸

、 . 〆，

^'l .. 

、 ‑ k ¥ シリ

St凶latecell (ADAMTS13) 

Endothellal cell (VWF)  Endothelial cell fenestrate  C型慢性肝炎の凍結肝組織切片を ADA MTS13に対する2種類のモノクローナjレ抗体 (A10とC7) を用いて免疫染色を行った結果， JJ干類洞壁細胞が問機に染色され，細長い突起を有し形態学的にJJ干 星細胞に合致する所見であった .111 situ hybridizationでは樹校状に ADAMTS13mRNAのシグナ

jレが検出され，本酵素が肝星細胞で産生されることが明らかとなった.

図10VWF73とADAMTS13活性測定法

VWF‑cDNA  Denl el 01.  (PNAS USA， 1991) 

Kokome 針。，.

(Blood，2004)  Kokome el 0 .1 (Br J Hoemolo .l2005) 

140 Kd 

G 

1605・1606 Y M  

v 

、_、

、、

176 Kd 

FRETS‑VWF73  assay  Kolo el 0 1.

(Tronsfuslon.2006) 

I

開曜掴^団

9

軍部

CI

^{ChADAMTS13arcomogenlc t‑ElISA ‑}

144 (302) 特 報 最新医学.64巻・ 2号

図11高ずり応力下で形成された血栓におけるADAMTS13による VWF切断活性の解析

Control 

+ 

anti‑ADAMTS13 Ab 

A 

^{;UIlII"‑‑ ¥'¥VF} 

l

^{lmIl  VWF} 

lI 

4

    . .

₄

    . .

B 

^{園 町}

品量謹

^Fl₍^o₁^w _2， ^d

‑

₀₀₀ ^ircc_s‑^ti_I^o₎ ⁿ 

^{F F} _{E 3}

^竺

_{哩 跡 岨} ^{T ー竺竺}

C  ‑

D 

‑・盟国園田園・圃哩園

‑ ・ 圃 ・ 園 田 園 田 園 田 ・ ・ ・

‑ 園 開 ・ 圃 ・ ・ ・ ・ ・ 圃 ・ ・

〆日 圃

恒軍 司 樋幽置園町周

12

，

000 S.I  一寸 4

，

500 S‑I 

1

，

500 S‑I 

Shear rate 

̲ j  

A:高ずり述度下で形成された血栓を

N I O

抗体(赤色)とVWFポリクローナル抗体(緑色)で二 重染色した.

B:コントロール血栓は全体的に黄色調，抗 ADAMTS13阻害抗体存在下で形成された血栓は緑色 優位である.

C:B

画像の縦断而.コントロール血栓では， 血栓の外表而辺縁が優位に赤く染色されているが，

抗ADAMTS13阻害抗体を添加した場合にはこの傾向は著明ではない.

0:種々のずり応力下で形成されたコントローJレ血栓の二重染色縦断画像.ADAMTS13によるj血 栓外表而辺縁での優先的な VWF切断は，より高いずり速度で顕著である.

表面 部 に 優 先 的 な ADAMTS13による VWF

切 断 は，ず り 速 度 が 高い ほ ど顕 著 で あ っ た ( 図 11) . 血 流 に直 接 暴 露 す るj血栓成長先進部では，

VWFに血 小 板 が 結合 す る こ と で，ず り 応 力 に よる VWFMへ の ス トレッ チ ン グ効 果 が 増 強 され，切断部位である A2ドメ イ ン が よ り 露出 す る こ と が 推 定 さ れた夙 これらの成績から，

ADAMTS13の ず り 応 力 依 存 性 の 機能 特性，お よびずり応力による ADAMTS13による VWF

切 断 活 性 増 幅 メ カ ニ ズ ム が 明 ら か と な っ た.

5) ADAMTS13の ず り 応 力 依 存性 機 能 特 性 に 基づく止 血 メ カ ニズ ム 制 御 理 論

血管壁が傷害を受け，その音15位 か ら 出 血 が 生 じた場合，ここに壁血 小板l血栓が形成され止Jfll

と共に血管 傷 害 部 位 の 修 復 が 起 こ る.しかしこ の反応が無制限に生じた場合には， 血管 を 閉塞 し，微 小 循 環 機 能 不 全 か ら 臓 器 機 能 不全に至る

(l

f

n̲栓症).こ の 説 明 は ， 前 章 の実験 結 果 を以 下 の よ う に 解析 す る こ と に よ り可能となった.

す な わ ち，高 ず り 応 力 下 で ま ず VWF‑GPlb

相互作用が促進され， VWF依 存 性 の血小 板42占 着 ・ 凝 集 が 進 行 す る ( 止血機

i

l正). 血 小板 粘 着 ・ 凝 集 反 応 、 の 進 行 に つ れ ， 徐 々 にJfJl栓 が 大 き く なっていき， 血管内 腔の フ リ ー ス ペース が 狭小 化す る こ と に な る.Il(rl管 腔 が 狭 い ほ ど ず り 応 力 が 高 い 」 こ と か ら 考 え る と ， 結 果 と し て血栓 の 増 大 に呼 応 して 局 所 ず り 応 力 が 高 く な る.理 論 的 に は ， 閉 塞 直前の血管 腔 に お け る ず り 応 力 は 無 限 大 に 上 昇 し て い る は ず で あ る.同 時 に，

lfll流に直接暴露する1fll栓 成 長 先 進 部 で は，VVvF 

へ の On‑goingな血小 板結 合 で ADAMTS13

に よ る VWF切 断 活 性 が 飛 躍 的 に 充 進 す る (図12).言い換えれば， 血栓 が 成 長 す れ ば す る ほ ど，ADAMTS13のJfll栓 成長ス トッパー (制 御 ) 機 能 が 増 幅 さ れて致 命 的 な血管 閉 塞 を 回 避

( 2 0 0 9

，

2 )  

させることになる(抗血栓機転)制.すなわち生 体では，

VWF

，血小板，および

ADAMTS13

の三者が，ずり応力のタクトの下で絶妙なハー モニーを奏でて，致命的な動脈閉塞を防御しつ つ，適正な止血血栓形成を司っていると想定さ れる46)

4  .血小板血栓症の病態解析

1 )血栓性微小血管障害症

血栓性微小血管障害症(出

r o m b o t i cm i c r

か

a n g i o p a t h y  :  TMA)

は，細血管障害性溶血性 貧血，破壊性血小板減少，血栓による臓器機能 障害を

3

主徴とする病理学的診断名である(

血栓性血小板減少性紫斑病

( t h r o m b o t i ct h r o m ‑ b o c y t o p e n i c  p u r p u r a  :  TTP)

と溶血性尿毒症 症候群

( h e m o l y t i cu r e m i c  syndrome: HUS) 

は，

TMA

を代表するこ大疾患である.しかし 今日，この両者を症状から分類することは殆ど 不可能かつ無意味と考えられている.しかし，

ADAMTS13

活性著減が確認されたものはより 特異的に

TTP

と診断されている.

奈良医大輸血部は，

1 9 9 8

年以降，本邦で唯 一の

TMA

解析センターとして機能し，

2 0 0 8  

年

4

月末までに

ADAMTS13

活性，臨床症状，

ルーチン検査データから最終的に

TMA

と診 断した症例は

8 8 2

例になった(図

1 3

，表

1) .  

このうち，先天性

TMA

と考えられたものは

6 1

例で，うち

3 7

例が後述の

Up s h a w ‑ S c h u l ‑ man

症候群

(USS

，別称先天性

TTP)

であっ た.一方，後天性

TMA

に分類されたものは

8 2 1

例であった.

( 1 )   Upshaw ‑S chulman

症候群

(USS) :  USS 

の病態解明と

ADAMTS13

遺伝子解析

「幼小児期からの慢性血小板減少と溶血性貧 血」を特徴とする

USS

は，

Schulman

ら48)や

Upshaw

酬によって報告された後も長らく，そ の病因・病態は不明であった.

1 9 8 2

年，米国 の

Moake

ら加は

Schulman

らの症例を解析 し正常血祭には存在しない

U レ VWFM

が患 者血築中に出現することを見出し，この疾患の 病態形成における

U L‑ VWFM

の関与の可能性

特 報

1 4 5( 3 0 3 )  

を示唆した.引き続き，

1 9 9 7

年に

F u r l a n

ら は，当時は未だ

TTP

が先天的に生ずるとの概 念がなかったものの， i慢性再発性

TTPJ

患者 では

VWF

切断酵素活性が著滅しているとの 報告を行った叩.そこで我々は，本邦で

USS

と臨床診断されていた

3

家系の同酵素活性を測 定し，患者はいずれも正常の

3%

以下と著減し ていること，またその両親は正常値の

50%

な いしそれ以下に低下していることを発見した回.

この後間もなくして，

L e

vyら31)は家族性

TTP

7

家系の

p o s i t i o n a lc l o n i n g

で

，

ADAMTS13  を原因遺伝子として同定した.

ADAMTS13

の

cDNA

クローニングでは他 の

3

グループの後塵を拝することになったが，

我々は引き続き

USS

の病態解析を進め，

USS 

の 一 家 系 (

US S‑ A)

内 に R 2

68P

，

Q

必

8E

，

P475S

と

C508Y

の四つの

ADAMTS13

変異を 同定した.

HeLa

細胞を用いた個々の発現実験 にて，

R268P

と

C508Y

は培養上清に分泌さ れない責任変異であること，一方，

Q448E

と

P475S

はいずれも培養上清に分泌されるが，

Q448E

はほぼ正常活性を持ち正常多型

( c o m ‑ mon SNP)

と確認，しかし

P475S

は，その酵 素活性は尿素存在下に測定する

VWFM

アッ セイでは著しい低活性を示すことを示した32)

ADAMTS13

遺伝子の野生型と変異型共に

， i n   v i t r o

発現実験にて培養細胞からの蛋自分泌障 害やその活性有無の検討を報告したのは，これ が世界で最初の論文となった却.

発見されたこの

P475S

変異のヘテロ接合体 は日本人の約

1

割に見られ，そのアレル頻度は

5 . 6 %

であることも示された.また最近の諸外 国でのデータでは，

P475S

アレル頻度は韓国 人で

4 . 0 %

，中国人で1.

5%

，そして白人

( C a u ‑ c a s i a n )

で

0%

の数字が報告されており，この

gene f l o w  map

はかつてのシルロード上にほぼ 一致するようである.

2 0 0 8

年

4

月末までに，奈良医大輸血部で診 断・登録された

USS

は，表

2

に示す如く

3 2

家系

3 7

症例である.この中で

ADAMTS13

遺 伝子解析が実施されたものは

2 7

家系

3 2

症例