141. 子宮内膜症の病態の解明と新しい薬物療法の開発
奈須 家栄
Key words：子宮内膜症，エピジェネティクス， マイクロ RNA，細胞増殖，アポトーシス大分大学 医学部 産科婦人科学
緒 言
子宮内膜症は全女性の３～10%に発生し，慢性骨盤痛，月経痛，性交痛や不妊などの症状を呈するエストロゲン依存 症の良性疾患である1)．そのため子宮内膜症を有する女性の quality of life は著しく低下する．良性疾患でありながら 悪性腫瘍と同様に転移や播種，再発を起こし，炎症や癒着，瘢痕を形成するため，子宮内膜症は類腫瘍性疾患，類炎症 性疾患と位置付けられている2,3)．子宮内膜症は年々増加しているが，その病因，病態形成のメカニズムに関しては未 だ不明な点が多い4-6)． 近年，子宮内膜症において DNA のメチル化，ヒストンのアセチル化といったエピジェネティクス異常が，その発症 に関与していることが報告されている7,8)．今回，子宮内膜症の病因としてのエピジェネティクス機構の解明のひとつ として，microRNA (miRNA) の役割について検討した9)．方法および結果
１．子宮内膜症細胞および正常子宮内膜細胞の分離･培養4,9) 卵巣子宮内膜症性嚢胞に対する手術時に，患者より文書による同意を得て子宮内膜症組織を採取した4)．また対照と して，子宮筋腫に対する子宮全摘術の際に，患者より文書による同意を得て正常子宮内膜組織を採取した．なお，本研 究は，平成 22 年 7 月に大分大学医学部ヒトゲノム研究倫理審査委員会の審査に基づく許可を受けた．子宮内膜症組織および正常子宮内膜組織を collagenase 処理し，卵巣子宮内膜症間質細胞（endometriotic cyst
stromal cell: ECSC）および正常子宮内膜細胞（normal endometrial stromal cell: NESC）を分離･培養し，以下のin
vitro の実験を行った．
２．マイクロアレイによる遺伝子発現異常の網羅的解析9)
培養子宮内膜症細胞および培養正常子宮内膜細胞から total RNA を抽出し，miRNA マイクロアレイ（G4470C, Human Rel. 12.0, Agilent Technologies）を用いて，miRNA 発現の網羅的解析を行った．
その結果，正常子宮内膜間質細胞と比較して，子宮内膜症間質細胞では 8 つの miRNA が減少し，4 つの miRNA が 増加していることが分かった (Table 1)．
Table 1． miRNAs differentially expressed between ECSCs and NESCs
Eight miRNAs were downregulated and four miRNAs were upregulated in ECSCs compared with NESCs.
３．Quantitative real-time PCR による miR-196b およびHOXA10 遺伝子の発現の検討9)
子宮内膜症間質細胞で発現が減少していた 8 つの miRNA のうち，子宮内膜症の病因遺伝子の 1 つとして注目されて
いるHOXA10 遺伝子のプロモーター領域に miR-196b 遺伝子が位置することから (Fig. 1)，miR-196b に着目して以下
の実験を行った．
Fig. 1． Schematic display of the genomic position of the miR-196b gene identified via a search of the UCSC Genome Browser database (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway).
The miR-196b gene is located between the HOXA9 and HOXA10 genes in chromosome 7p15.2. Dense CpG islands are present around the miR-196b gene. The figure is not drawn to scale. The EST transcript and the putative transcription start site are also shown.
まず，子宮内膜症間質細胞における miR-196b および HOXA10mRNA 発現を real-time PCR により確認したところ， 正常子宮内膜間質細胞と比較して，子宮内膜症間質細胞において miR-196b の発現が増強していることが確認できた (p<0.01, Mann-Whitney U test) (Fig. 2)．同様に，HOXA10 の発現も子宮内膜症間質細胞において増強していた (p<0.001, Mann-Whitney U test) (Fig. 3A)．さらに，miR-196b と HOXA10 mRNA の発現の相関について検討したとこ ろ，強い相関を認めた (Pearson's correlation coefficient : r=0.678, p<0.005) (Fig. 3B)．
Fig. 2． miR-196b expression in ECSCs and NESCs accessed by quantitative RT-PCR.
The levels of miR-196b in ECSCs were significantly lower than those in NESCs. *p<0.01 vs. NESC group (Mann-Whitney U test). Error bars show the means ± SE of the samples. The quantitative RT-PCR results for miR-196b expression in ECSCs and NESCs were consistent with those obtained from miRNA microarray.
Fig. 3． HOXA10 mRNA expression in ECSCs and NESCs accessed by quantitative RT-PCR and correlation between the HOXA10 and miR-196b expression in ECSCs and NESCs.
(A) The levels of HOXA10 mRNA in ECSCs were significantly lower than those in NESCs. Error bars show the means ± SE of the samples. *p<0.001 vs. NESC group (Mann-Whitney U test). (B) A significant positive correlation was observed between the HOXA10 and miR-196b expression in ECSCs and NESCs. Pearson's correlation coefficient and the corresponding p value were r=0.678 and p<0.005, respectively. Closed circle, ECSCs; open circle, NESCs.
４．培養子宮内膜症間質細胞における miR-196b 遺伝子の強制発現系の確立9)
培養子宮内膜症間質細胞に Pre-miRTM miRNA precursor- hsa-miR-196b (Ambion) を transfection し，以下の細胞機
能解析を行った．遺伝子導入効率は 84.5±9.2%であった．
５．培養子宮内膜症間質細胞の細胞増殖および apoptosis に対する miR-196b の作用9)
子宮内膜症間質細胞の細胞増殖および apoptosis に対する miR-196b の作用について，CellTiter 96® AQueous One
Solution Cell Proliferation Assay (Promega)，5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation using a Cell Proliferation ELISA (Roche Diagnostics)，Cell Death Detection ELISA assay (Roche Diagnostics) および Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) を用いて検討した．その結果，miR-196b の強制発現により，子宮内膜症間質細胞の細胞増殖は抑制され， apoptosis が誘導されることが分かった (p<0.005, Student t test) (Fig. 4)．
Fig. 4． Results of (A) CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, (B) BrdU incorporation assay, (C)
Cell Death Detection ELISA assay, and (D) Caspase-Glo 3/7 Assay.
The data are presented as percentages of relative to the values of ECSCs transfected with negative control precursor miRNA. *p<0.005 vs. negative controls (Student t test).
６．培養子宮内膜症間質細胞の c-myc および Bcl-2 発現に対する miR-196b の作用9)
miR-196b の downstream target gene として，c-myc および Bcl-2 に着目し，これらの遺伝子発現に対する miR-196b
の作用について検討した．その結果，miR-196b の強制発現により，子宮内膜症間質細胞の c-myc および Bcl-2 発現は 有意に抑制されることが分かった (p<0.05, Student t test) (Fig. 5A, B)．miR-196b による子宮内膜症間質細胞の細胞増 殖および apoptosis の制御は c-myc および Bcl-2 の発現調節を介していることが示唆された．
Fig. 5． The effects of miR-196b transfection on the (A) c-myc and (B) Bcl-2 mRNA expression in ECSCs as assessed by quantitative RT-PCR.
The effects of 5-aza-dC treatment on the (C) miR-196b and (D) HOXA10 mRNA expression in ECSCs as assessed by quantitative RT-PCR. (A, B) Transfection of miR-196b precursor significantly suppressed the mRNA expression of c-myc and Bcl-2 in ECSCs. The data are presented as ratios relative to the values of ECSCs transfected with negative control precursor miRNA. (C, D) Treatment with 5-aza-dC significantly
induced the expression of miR-196b and HOXA10 mRNA, suggesting that miR-196b and HOXA10 gene
expression is epigenetically silenced in ECSCs via DNA hypermethylation. The data are presented as ratios relative to the values of untreated controls. *p<0.05 vs. negative controls (Student t test).
７．子宮内膜症間質細胞における miR-196b および HOXA10 mRNA 発現に対する DNA 脱メチル化剤の作用9)
子宮内膜症間質細胞における miR-196b および HOXA10 mRNA の発現抑制機序について検討した．子宮内膜症間 質細胞を DNA 脱メチル化剤 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC, Sigma-Aldrich) (10μM)で 4 日間刺激したところ， miR-196b および HOXA10 mRNA の発現は有意に増強することが分かった (p<0.05, Student t test) (Fig. 5C, D)． ８．子宮内膜症間質細胞および正常子宮内膜間質細胞における miR-196b 遺伝子の CpG island のメチル化に関する検 討9)
子宮内膜症間質細胞および正常子宮内膜間質細胞における miR-196b 遺伝子の CpG island のメチル化状態につい て，methylation-specific PCR を用いて検討した．その結果，正常子宮内膜間質細胞では，miR-196b 遺伝子の CpG island はメチル化されていないことが分かった (Fig. 6)．一方，子宮内膜症間質細胞では，miR-196b 遺伝子の CpG island はメチル化されていた (Fig. 6)．子宮内膜症間質細胞における miR-196b の発現抑制は，CpG island のメチル化 を介するエピジェネティクス機構によって生じていると考えられた．
Fig. 6． MSP of miR-196b gene in ECSCs and NESCs.
Bisulfite-converted genomic DNA extracted from ECSCs showed the PCR products for both unmethylated alleles and methylated alleles of miR-196b gene, suggesting that miR-196b gene in ECSCs was partially methylated. Whereas, bisulfite-converted genomic DNA extracted from NESCs showed the PCR products for the unmethylated alleles of miR-196b gene only. Similar results were obtained from all individual samples. U, unmethylated alleles; M, methylated alleles.
考 察
本研究から，miRNA の発現異常が子宮内膜症の病態形成に関わっていること，子宮内膜症間質細胞における miR-196b の発現は miR-196b 遺伝子のメチル化によって抑制されていること，さらに，miR-196b の発現抑制は，増殖 能の増強や apoptosis 耐性という子宮内膜症に特徴的な性質の形成に関与していることが示唆された．今後，miRNA を含むエピジェネティクス機構についてさらに検討を重ねることにより，子宮内膜症の病態形成のメカニズムが解明さ れ，新たな治療法や biomarker の開発，さらにはハイリスク群の診断と予防法の開発につながることが期待される．
共同研究者
本研究の共同研究者は，大分大学医学部産科婦人科学の阿部若菜，川野由紀枝，楢原久司および大分大学医学部分子病 理学の中田千里，守山正胤である．本稿を終えるにあたり，本研究を御支援いただきました上原記念生命科学財団に深 く感謝申し上げます．文 献
1） Nasu, K., Tsuno, A., Yuge, A., Kawano, Y. & Narahara, H. : Combined oral contraceptives for the medical treatment of endometriosis-associated pain. Recent Adv. Endocrinol. Metab., 1 : 1-14, 2009.
2） Sato, S., Nasu, K., Iwanaga, N., Furukawa, Y., Matsumoto, H. & Narahara, H. : Spontaneously developed, solitary endometriosis of the umbilicus. J. Endometriosis, 4 : 117-121, 2012.
3） Nasu, K., Okamoto, M., Nishida, M. & Narahara, H. : Endometriosis of the perineum. J. Obstet. Gynecol. Res., 39 : 1095-1097, 2013.
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6） Adachi, M., Nasu, K., Tsuno, A., Yuge, A., Kawano, Y. & Narahara, H. : Attachment to extracellular matrices is enhanced in human endometriotic stromal cells: a possible mechanism involved in the pathogenesis of endometriosis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 155 : 85-88, 2011.
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8） Nasu, K., Kawano, Y., Tsukamoto, Y., Takano, M., Takai, N., Li, H., Furukawa, Y., Abe, W., Moriyama, M. & Narahara, H. : Aberrant DNA methylation status of endometriosis: Epigenetics as the pathogenesis,
9） Abe, W., Nasu, K., Nakada, C., Kawano, Y., Moriyama, M. & Narahara, H. : miR-196b targets c-myc and Bcl-2 expression, inhibits proliferation and induces apoptosis in endometriotic stromal cells. Hum. Reprod., 28 : 750-761, 2013.
