Pkdl ノックアウトマウスの作製と解析 学位論文内容の要旨

博 士 （ 医 学 ） 柴 崎 跡 也

学 位 論 文 題 名

Cre710xp ンステムを用いた

Pkdl ノックアウトマウスの作製と解析 学位論文内容の要旨

    

緒言

  

常 染 色 体 優 性 遺 伝 型 多 発 性嚢 胞 腎

(ADPKD)

は最 も 頻 度 が高 い 遺 伝 性腎 疾 患 で ある ． 加 齢 とと も に 嚢胞 が 両 腎 で増 加 し ， 進行 性 に 腎 機能 が 障 害 され ，

70

歳ま で に 患 者の 約 半 数 が腎 不 全 に 至る ．

ADPB:D

の 原 因 遺 伝 子 と し て ，

PKD1

遺 伝 子 と

PKD2

遺 伝 子 が 同 定 さ れ て い る ．

PKD1

の 遺 伝 子 産 物 で ある ポ リ シ スチ ン

1

は ，大 きな細 胞外ドメ インを もつ膜 貫通型 蛋白で ，機械 的セン サーの 役割を果 た す． ー 方

PKD2

の 遺 伝子 産 物 で ある ポ リ シ スチ ン

2

は 膜 貫 通型 蛋 白 で ，カ ルシウ ムイオ ンチャ ンネ ルとして作用する．

  

現 在 ま で

Pkdl

ノ ック ア ウ ト マウ ス が 数 編報 告 さ れ てお り ， ホ モ接 合 体 で は胎 生

15.5

日 か ら腎 嚢 胞 を認 め ， 胎 生致 死 と な る． 胎 生 致 死の た め これ らのマ ウスは 詳細な

ADP

くDの病 態解析 や薬剤 投与 実験 には不十 分なモ デルで あった ．Cre/lcKPシ ステム を用い たコン ディショ ナルノ ックア ウトマ ウス は， くねトラ ンスジ ェニッ クマウ スのく ぬ蛋白 の発現 部位， 発現時期 の違い によっ て，異 なる表 現型 を得 られる．現在まで円ヒd聖，円と〔勿遺伝子では，腎H時異的なコンディショナルノックアウトマウス は作製されていない．

  

本 研 究 に おい て は ， 胎生 致 死 で なく ， 緩 徐 に腎 嚢 胞 が 出現 し ， 進 行性 に 腎 機 能が 低 下 す るヒ ト

ADPKD

類 似 の 動物 モ デ ル を作 製 す る こと を 目 的 とす る ． 私 は腎 臓 特 異 的カ ドヘリ ン遺伝 子のプ ロモ ータ ーを使用 したksp‑（コ．

e

マウス を用い て，腎臓 特異的な円a丑コンディショナルノックアウトマウ スを作製したのでここに報告する．

    

方法と結果

1

．夕ーゲッティングペクターの作製

マ ウス

B

气Cライ ブ ラ リ ーより 同靦ヱ 遺伝子 を含むク ローン を得て ，そこ からェ クソン

215

を含む 断片 を

pBHK3

り へ の サ ブ ク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た ． 次 に

pI

§246の

1c

叩断 片 を イ ント ロ ン

1

に ，

PI

ぐ

n

の

1

〔鬮plRu斗℃KN＆H琅T断片をイントロン4に挿入した．

2

．ES細胞への遺伝子導入，序d7俄灰マウスの作製

夕 ーゲ ッ テ イ ング ベ ク タ ーを マ ウ ス のES細 胞 に遺 伝子導入 した． セレク ション はジフ テリア トキシ ン ，ネ オ マ イ シン を 使 用し た．ES細 胞のDNAを 用いて

3

．側を

P

（ニR法 にて，

5

側を サザン プロッ ト 法 にて ス ク リ ーニ ン グ を 行っ た ．

600

個 中5個陽 陸 で あ った

ES

細 胞の ク ロ ー ンを 用 い て 円尚

fk

斑 ヘ テロマウス（磁dpめを作三磊！した．丑cKヘテ口マウス同士を交配し，F2マウスを得るも円とd！庇価 マウ ス は得 ら れ な かっ た ． 次 に皿

cK

ヘ テロ マ ウ ス とRJ亀 マウス を交配 し，ネオ マイシ ン耐性 遺伝子 を欠 失 し た 円 體 轡 め ／ ＋ マ ウ ス を 得 た ． 同

R

カ 出 め ′ ＋ 同 士 を 交 配 し ， 弼 泣

dw

幽 マ ウ ス を得 た ．

ー 42 ‑

3．F￥aゴ7コ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ 卜 マ ウ ス の 作 製 と 発 現 解 析

Pkdlヘ テ ロ マ ウ ス(Pkdl均 ， 鬥 め 出W幽 マ ウ ス とkspく ぬ マ ウ ス を 交 配 し ，Pkdl＋‑ Creマ ウ ス ， 円 池 甜 ∞ 岸 〇eマ ウ ス を 作 製 し た ． 円 【d喧 舮 〇eマ ウ ス ， 弼 油 甜 め ′ ＋ 〇 ℃ マ ウ ス を 円 拙 甜 ぬ 僧 マ ウ ス と 交 配 し ， 円 虹 ぬ 甜m 〇 葛 円5泣 出m侶 〇 む マ ウ ス を 作 製 し た ． 円 絃 甜 め 組 〇 書 マ ウ ス と 円 を む 桝 〇e マ ウ ス か ら 腎 臓 ， 肝 臓 ， 心 臓 ， 肺 を 摘 出 し ， そ のDNAを 用 い て サ ザ ン プ ロ ッ ト 解 析 を 行 っ た ， 各 臓 器 で 丑cKア レ ル を 示 す バ ン ド を 認 め た が ， エ ク ソ ン2〜4の 欠 失 を 示 す パ ン ド は 腎 臓 の み 認 め ら れ た ． 腎 臓 に お け る エ ク ソ ン2〜4の 欠 失 を 示 す パ ン ド の 割 合 は ，mロgび に よ る 解 析 で は 約30％ で あ っ た ． 4． 胤 灯 コ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ 卜 マ ウ ス の 表 現 型

ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は 生 後7日 こ ろ か ら 腹 部 の 膨 隆 を 認 め ， 生 後14日 セ1日 に 死 亡 す る ， 生 後4 7， 14日 目 の 弼 【 加 幽 が0B弼 洫 甜 剛 幽 くjeマ ウ ス と コ ン ト ロ ー ル 群 を 各 々10匹 ず っ 採 血 し ， 血 液 尿 素 窒 素 を 測 定 し た ． 生 後7日 の ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス 群 で 有 意 な 上 昇 を 認 め ， 生 後14日 で は 腎 機 能 は さ ら に 悪 化 し た ． 体 重 ， 腎 重 量 も10匹 ず っ 測 定 し ， 腎 重 量 ・ 体 重 比 を 用 い て 比 較 検 討 し た ， 生 後4日 で コ ン ト ロ ー ル 群 と ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス 群 に お い て 有 意 差 を 認 め た ， 日 齢 毎 の 腎 重 量 ・ 体 重 比 で は 個 体 差 が ほ と ん ど な く 比 較 的 均 一 で あ っ た ．

5． 病 理 組 織 学 的 解 析

4％ パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド （ 4％PI矼 り た BS） に て 還 流 固 定 を 行 い ， 腎 臓 を 摘 出 し た ． バ ラ フ ィ ン 包 埋 し て 切 片 を 作 製 し ，HE染 色 お よ びP AS染 色 を 行 っ た ． 生 後1日 で 腎 臓 に 嚢 胞 を 認 め た ． 嚢 胞 は 髄 質 に 多 く 認 め ら れ た が ， 皮 質 に も 散 在 し て い た ． 近 位 尿 細 管 で は 嚢 胞 形 成 を 認 め な か っ た ． 生 後14日 目 で は 腎 臓 全 体 が 嚢 胞 で 占 め ら れ ， 問 質 は ほ と ん ど 消 失 し て い た ．

6， 免 疫 染 色

％P． 渦 佃Sに て 還 流 固 定 し ， 腎 臓 を 摘 出 し た ． バ ラ フ イ ン 包 埋 し て 切 片 を 作 製 し ， 螢 光 免 疫 染 色 を 行 っ た ． 切 片 を 一 次 抗 体 で4℃ に て 一 晩 ，2次 抗 体 で 室 温 に て1時 間 反 応 さ せ た ． 観 察 お よ び 撮 影 は 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 に て 行 っ た ． 近 位 尿 細 管 マ ー カ ー （L1L） ， 集 合 管 マ ー カ ー くDB心 を 用 い て 染 色 し た ． L1L陽 性 の 嚢 胞 は 認 め ず ， 嚢 胞 の ほ と ん ど はD．BA陽 性 で あ っ た ．L1LDEAと も に 陰 性 の 嚢 胞 も 認 め た ． 嚢 胞 は ほ と ん ど が 集 合 管 由 来 で ， わ ず か に へ ン レ ル ー プ ｜ 遠 位 尿 細 管 由 来 の 嚢 胞 を 認 め た ． 集 合 管 の 主 細 胞 と 介 在 細 胞 を 区 別 す る た め に ，DBAH丶 虹 ぬeの 二 重 染 色 を 行 っ た ． 集 合 管 由 来 の 嚢 胞 に お い て 主 細 胞 と 介 在 細 胞 両 方 が 認 め ら れ た ． 次 に 線 毛 を 観 察 す る た め に ，ace蹴 両 ］b1】 ぬ 染 色 を 行 っ た ． コ ン ト ロ ー ル 群 ， ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス 群 で は 線 毛 の 形 態 に お い て 差 異 は 認 め 超 か っ た ． さ ら にa肥 回 も ぬ1】 ．H丶 、 皿 をseの 二 重 染 色 で は ， 両 群 と も に ，H丶 虹R瞬 陰 陸 細 胞 だ け で な く ， 陽 陸 細 胞 に も 線 毛 を 認 め た ．

    考 察

  本 研 究 で は 腎 臓 特 異 的 な 磁 田 コ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 製 し ， そ の 解 析 を 行 っ た ． 表 現 型 に 影 響 を 及 ぽ す ネ オ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 の 除 去 カ 泌 要 と 考 え ，FRr． ／RPシ ス テ ム を 導 入 し た ． 磁 田 畑 ／q士 の 交 配 で は ， 露 洫 幼 紅 マ ウ ス は 誕 生 せ ずI胎 生 致 死 で あ っ た 可 能 性 が 高 い ， そ こ で 磁 加 曲 噺 廿 マ ウ ス を 作 製 し た と こ ろ ， 胎 生 致 死 と な ら ず に 表 現 型 は 野 生 型 マ ウ ス と 同 様 だ っ た ．   次 に 同 泣 出 び （jぞ マ ウ ス ， 弼dZ幽 り 縫 蛔 匸 冶 マ ウ ス を 作 製 し た ． サ ザ ン プ ロ ッ ト 解 析 に よ り 腎 特 異 的 に ノ ッ ク ア ウ ト さ れ て い る こ と カ 瀧 認 さ れ た が ノ ッ ク ア ウ ト さ れ て い る 欣 ぬ 遺 伝 子 は 約30％ で あ っ た ． そ の 理 由 は ， 腎 臓 内 の 細 胞 に お い て ，K叩 プ ロ モ ー タ ー が 働 く 細 胞 が ， 全 て の 細 胞 で は な く 一 部 の 細 胞 （ ヘ ン レ ル ー プ 遠 位 尿 細 管 ， 集 合 管 な ど ） に 働 く た め と 考 え ら れ る ，   今 回 の 集 合 管 由 来 の 嚢 胞 に 主 細 胞 と 介 在 細 胞 を 認 め ， 集 合 管 に お け る 嚢 胞 形 成 は ， モ ノ ク ロ ー ナ ル な 細 胞 増 殖 に よ ら な い こ と が 示 唆 さ れ た ． 本 研 究 の ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス の 嚢 胞 で は ， 線 毛 に 形 態 異 常 を 認 め な か っ た ． 従 来 ， 線 毛 は 集 合 管 の 介 在 細 胞 に は 認 め な い と 報 告 さ れ て い る ． し か し 本 研 究 で は

‑ 43 ‑

コントロール，ノックアウトマウス共に介在細胞に線毛を認めており，介在細胞も主細胞と同様に線 毛による尿流感知システムが存在する可能性を示唆された．

  Hontek

らが作製したPkdlコンディショナルノックアウトマウスは，生後20週で腎嚢胞，肝嚢胞 を認めるが，嚢胞の数は少なく，腎不全に至らなかった．LeeuweriらのpkdPmマウスは胎生致死で はなく腎嚢胞を形成するが，同週齢における表現型のぱらっきが大きい，pkd2において，胎生致死を 免れる遺伝子改変マウスカ鉾き在し，不安定なアレル

(WS25

アレルうをもつノックアウトマウスカミ報 告されている．表現型としては大小様々な嚢胞が出現しADPIく

D

に非常に類似していたが，個体毎に 嚢胞形成の程度が異なり腎不全の程度も比較的不均一である，

  

本研究で作製したマウスは，同一日齢での腎臓腫大，腎不全の程度が比較的均一であり，さらに腎 不全によって死亡する．そのため薬剤投与における評価が行いやすいモデルマウスと考えられた，

Pkdl ctka/cbhfD

マウスは使用するCreマウスを変更することで，ノックアウトする臓器，時期の変更が 可能である．異なるCreマウスとの交配により，ヒトADPKDの病態に近い表現型をもつマウスカ雛 製 さ れ ， 嚢 胞 形 成 機 序 の 解 明 や 薬 剤 投 与 実 験 に 適 用 さ れ る こ と カ ミ 期 待 さ れ る ．

− 44 ‑

学位論文審査の要旨 主 査    教 授    小池隆夫 副査   教授   野々村克也 副 査    教 授    畠山鎮次

学 位 論 文 題 名

Cre/loxp システムを用いた

Pkdl ノックアウトマウスの作製と解析

  常 染 卮 体 優 性 遺 伝 型 多 発 性 嚢 胞 腎(ADRくD） は 最 も 頻 度 が 高 い 遺 伝 性 腎 疾 患 で あ る 。 加 齢 と と も に 嚢 胞 が 両 腎 で 増 加 し 、70歳 ま で に 患 者 の 約 半 数 が 腎 不 全 に 至 翫ADPKDの 原 因 遺 伝 子 の ひ と っ にPKD1遺 伝 子 が 同 定 さ れ ー て い る。Hrdlノッ ク ア ウ ト マ ウ ス は、 ホ モ 接 合 体 で は胎 生15.5日 か ら 腎 嚢 胞 を 認 め、 胎 生 致 死 と な る。

胎 生 致 死 の た め こ れ ら の マ ウ スは 詳 細 な 病 態 鰯 帯p轗 薬 斉iJ投 与 実 験 に旧 ： 不 ： 十 分 な モデ ン レ で あ っ た 。 今回 腎 臓 特 異 的 カt八 リ ン 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー を 使 用Lア たksvCreマ ウ ス を 用 い て 、 胎 生 致 死 と は な ら な い 腎 臓 特 異 的 なPkガ コ ン デ 心 ／ ヨナ ソ レ ノ ッ ク ア ウト マ ウ ス を 作 製 し也

  タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ ベ ク タ ー と し て 、 マ ウ ス ヰ 甜 遺 伝 子 の イ ン ト ロ ン1にk即 断 片 を 、 イ ン ト ロ ン4に bx叫WH℃ 除 め ーF両 断 片 を 挿 入 し プ 己 タ ー ゲ 疔 イ ン グ ツrタ ー を マ ウ ス のES細 胞Iこ 遺 伝 子 導 入 し 丶 鯏 生 ク ロ ー ンを 用 い て 風 田n． ば ＾ 、 テロ マ ウ ス （ 履 め師つ を作 製し也 霞丿7マウス 、k叩 くbマ ウスを 交配 し、風 田献 。廱畑 匸冶 マ ウ スを 作 製1た 。

  風 ： 田 曲 淵 〇 ヨ マウ ス と月 托灯 屮〔冫8マウ スから 腎臓 、嗣職 、´ 心臓kロ 市を 摘出し 、そ のDI、Aを用 しヽて サザ シブ ロ ッ ト角 劇 斤 を 行 っ た 。 エク ソ ン2へ4の欠 失 を 示 す ン く ンド は 腎 脯 め み 認 め られ ゴ 己 生 後4日 の ノ ッ ク アウ トマ ウスで 腎 臓 の 腫 大 し 、 生 後7日 の り ′ ク ア ウ ト マ ウ ス 群 で 腎 不 全 を 呈 し 、 生 後14日 一21日 に 死 亡 す る 。 病 理 組 織 で は 、 生 後1日 で 腎 臓 の に お い て 嚢 胞 を 認 め 、 生 後14日 目 で は 腎 臓 全 体 が 嚢 胞 で 占 め 嚠M己 近 位 尿 細 管 で は 嚢 胞 形 成 を 認 め な か っ た 。 近 位 尿 細 管 マ ー カ ー （L1L） 、 集 合 管 マ ー カ ー （DB心 を 用 い た 螢 光 免 疫 染 色 で は 、 L1叫 昜 陞 三 の 嚢 胞 ｜ 潟 め ず 、 嚢 胞 の ほ と ん ど はDBA淵 生 で 沈 灼 たL1kDBAと も に 陰 性 の 朝 包 も 認 め た 嚢 胞 は ほ と ん ど が 集 合 管 由 来 で 、 へ ： ／ レ ′ レ ー プ 、 遠 位 尿 細 管 由 来 の 嚢 胞 も 認 め たDBA丶H一m毯eの 二 重 染 色 で は 、 集 合 管 由 来 の 嚢 胞 に お い て 主 細 胞 と 介 在 細 胞 両 方 が 認 め ら れ た 。 さ ら にa傍 囁ItL蜘 血 ・Hやmぬ の 二 重 染 色で は 、 ― に 小 ・A1RSe嚠 轡 佃 胞 熾 ナ でな く 、 馴 蜘 胞 に 蝋餌 猗 認 め た

  今 回 の 集 合 管 由 来 の 嚢 胞 に 主 細 胞 と 介 在 細 胞 を 認 め 、 集 合 管 に お ｜ ガ 鑓 馳 形 成 は 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル な 細 胞 増 殖 に よ ら な い こ と が 示 唆 さ れ た 本 研 究 の ル ク ア ウ ト マ ウ ス の 嚢 胞 で は 、 線 毛 に 形 態 異 常 を 認 め ず 、 コ ン ト ロ ツ レ 丶 ル ク ア ウ ト マ ウ ス 共 に 介 櫛 ロ 胞I線 毛 柿 恥 て お り 、 介 在 細 臓 ） 主 細 胞 と 同 様1辮 ｜ ふ る 尿 流 感 知

一 45 ‑

シ ス テ ム が 存 在 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 本 研 究 で 作 製Ljt̲マ ク ´ を ま 、 同 ー 日 齢 で の 腎 臓 睦 大 、 腎 不 全 の 程 度 が 比 較 的 均 一 で あ り 、 腎 不 全 に よ っ て 死 亡 す る 。 そ の た め 薬 剤 投 与 に お け る 評 価 カ 暫 孔 嘩 す い モ デ ン レ マ ウ ス と 考 え 舗 し たPkdldrhstyfマ1ウ ス は 使 用 す るCreマ ウ 刈 凌 更 獄 と で 、 丿 ッ ク フ‑H一 る 臓 器 、 時 期 の 変 更 が i丁 肓 皀 磁 ふ 異 な るCreマ ウ ス と の 麪 己t球 り 、 ヒ トADPKDの 病 態 ｜ こ 迅 淒 兜 蝋 つ マ ウ スbを 憾 熔 れ 嚢 胞 形 成 機 序 の 解 明弋 囑Sil事 与 実 験 に 適E用 さ れろ こ と カ 琴 舛 待 され る 。

  質 疑 応 答 は 、 副 査 の 畠 山 鎮 次 教 授 よ り 開 始 コ ト ／ の 位 置 、 エ ク ソ ン2・4を 削 除す る こ と で ド ミ ナン ト ネ ガ テrブ に な ら な い か 、嚢 胞 で は 孫 田 胞 が増 殖L‑C丶 ヽ る の か どう か に つ い て の 質 問が あ っ た 。

  次 い で 副 査 の 野 々 村 克 也 教 授 よ りH丶 で は 集 合 管 に 限 局 す る よ う な 病 態 は あ る の か 、 ラ パ マ イ‑′ 、 ソ マ ト ス タ チ ン ぬ ど カ 辷 の モ デ ノ レ に 投 与 す る こ と で 丶 効 果 は 期 律 囓 の カ ゝ に つ い て の 質 問 が あ っ た   更 に 主 査 の 小 池 隆 夫 教 授 よ り 今 回 の マ ウ ス の 集 合 管 由 来 の 嚢 胞 で は2種 類 の 細 胞 が 存 在 す る が 、 人 と の 鐵 ヽ は ど う か 、 ツ ー ヒ ッ ト が 起 こ る 場 合 に な ぜ 片t1の 腎臓 の み ｜ こ 嚢 胞 カ淵 誌 ら 机 ヽ の カ ゝ、 今 後 の 臨 床 的 ア プロ ー チ に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 い ず れ の 質 問 に 対 し て も 、 申 請 者 は 過 去 の 論 文 や 自 験 例 を 引 用 し 畠 山 教 授 の 質 問 に 対l′ て は 、 開始 コ ド ン は エ ク ソン1に あり 、3n+aで エ クn噬 消 ｜j除 レaヽ ること から 心こナ ：ノ トネガ テrブ に な ら ない 、 ノ ッ ク ア ウ ト細 胞 は 噌 殖 し 一a丶 る と 解答 しf.̲o野 々 村 教 授 の 質 問 に対lては 、 ヒ ト で 限 局 さ オル と 病 態 は 起 き な ぃ ヽ 、 シ や 州 シ ン 、 ソ マ ト ス タ チ ン ´ の 作 用 機 勵 ゝ ら 考 え て 、 こ の モ デ ノ レ で も 効 果 カ湖 符 嚇 と 解 答 し た

′J、 池 教 授 の 質 問 に 対1て は 、2襪 頃 の 細 胞 カ ミ 存 在La喝 が 、 多 数 の 細 咆 が ル グ ア ウ ト さ れ る 点 が 異 な っnヽ る 、 禰 舜 幼 甥 え て 左 右 均 等Iこ な っnK、 異 な るCreマ ウ ス を 嫺1て 新uゾ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 作 製1、 シ く マ イ シ ン や ノ く ニ ク レ ッ 、 ン ン ／2受 容 体 拮 抗 薬 な ど の 薬 剤 を 投 与 し 丶 効 果 の 評 価 を す ‐ る と 角 翠 答 し た 。   こ の 論 文 は 、 ヰ 甜 遺 伝 子 を 腎 臓 特 異 的 に ノ ッ ク ア ウ トljt初 め て の モ デ ン レ マ ウ ス で あ り 、 表 現 型 の 評 価 も 十 分 に 行 わ ・ れ ′nヽ る 点 で 高 くi刊 函 さ れ 、 今 後 薬 剤 投 坐 チ に お け る 嚢 胞 形 成 抑 制 の 評 価 が 期 待 さ れ ´ る 。   審 査 員 一 同 は 、 コ ん ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学位 を 受 け る の に 十分 な 資 格 を 有 す る もの と 判 定Lア た 。

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