博士（薬学）須藤雄気 学位論文題名
フォボロドプシンと共役蛋白質との 膜蛋白質問相互作用・光情報伝達機構
学位論文内容の要旨
本 論文は、 ファラ オニスフ ォボロド プシン（ ppR)と共役蛋白質（pHtrlI)の 膜蛋白質相互作用を基底状態・中間状態において、生化学的、分光学的、物理化 学 的 な 方 法 を 用 い 解 析 を 行 っ た 結 果 を ま と め た も の で あ る 。 人をはじめとした様々な生物種においてゲノム解析が行われてきている現在に おいて、ゲノム情報をもとに作られる種々の蛋白質がどのような機構のもと機能．
を発揮しているのかを解明することが、生物学の主目的となっており、今後もな っていくと考えられる。細胞膜に発現する膜蛋白質は、全ゲノムの約3割を占め、
外界との情報や物質のやり取りを行うなど生命活動の維持に極めて重要な蛋白質 群である。しかしながら実験材料としての取り扱いづらさから、可溶性蛋白質に くらべ、機能発現機構の理解が極めて遅れている。
古 細菌の一 種であ るNatronobacterium pharaonisには熱・酸・アルカりに強 い7回膜 貫通型蛋 白質、 ppRが存在し 、2回膜貫通 型蛋白 質、pHtrnと細胞膜中 で 複合体を 形成している。筆者はこの高い安定性と光により機能発現のon―off を制御できるという特徴から、膜蛋白質問の情報伝達機構を分子レベルで解明で き る数少な い系であ ると考 え、夘R/pHtrHを介 した情報 伝達系 に着目し研究を 行 った。膜 中で複合 体を形 成する卯R/pHtrn複 合体にjやRの極大 吸収波長であ る500nm付近 の光が 照射され ると、卯Rの 発色団レチナールが異性化を起こし、
K、M、Oと 呼ぱれる 光中間 体を経て もとに もどる「phota拶cle」と いう反応が 起こる。M中間体の寿命の変化に伴い、j）HtrIIの活性化の程度が変化することか らM中間 体が活性 型中間 体の1つである と考えられている。この情報伝達機構を 一 連の流れ （ダイナ ミック ス）とし て理解 するため には、jやR/mmrH複合体の 基底状態及び光中間体時における相互作用・構造変化を解析することが重要であ ると考えられる。
本 研究では 、初期不活性化状態を理解する上で「基底状態J、活性化へとっな
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がる初 期構造 変化の解 析とし て「K中間体」、活性化機構の理解のために「M中 f ゛
間体」 、活性 型から不活性型への構造変化過程の解析として「O中間体」に関し てppRとpHtrII問 の 相 互 作 用 及 び 構 造 変 化 の 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 卯R/pHtrn複 合 体の化学 量論比（ 約1）や解離 定数（ 約011メM）を 算出す るこ とに成功し、卯Rの活性化に伴って構造変化を起こし、j）HtrHとの結合親和性が 大きく低下（O．1メM→15メM）するととを明らかにした。この解離定数の変化は、
おもにj）HtnIG83々149のj爾Rからの解離に由来することを示唆する結果を得た。
ま た相 互 作 用・ 構 造 変 化に 重 要 なア ミ ノ 酸残 基 （T虹199賦 、Asp193賦、
j〕lHtrIIG8＿Q149、Asn74州trlI、Thr204ppRなど）を同定することに成功した。これ らの結 果及ぴ これまで 報告さ れている 結果を踏まえ、1）卯Rが活性化されると E―Fループ部分が構造変化を起こす。2）E−Fループと相互作用しているj）HtrII G83q149がppRか ら解離 する。3）下流 のシグ ナリング ドメイ ンの相対配置の変 化をもたらす。これら1〜3の一連の流れにより光情報を伝達するという「linker 恥dtchmodel」を提唱した。
さ らにpHtrIIに水 溶性tagを付加 すること で、pHtrnを膜蛋 白質の モデルと した新 規無細 胞膜蛋白 質合成 系の開発 にも成功した。これらの研究成果から、
j弔R/pHtrIIを介した光情報伝達系は、膜蛋白質を介した情報伝達機構の中で最 i
も理解の進んでいる系の1っとなった。
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学位論 文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 助教授 助教授
加 茂 直 樹 稲 垣 冬 彦 宮 内 正 二 森 岡 弘 志
学 位 論 文 題 名
フ ォボロ ドプシンと共役蛋白質との 膜蛋白質 問相互 作用・光 情報伝達機構
本 論 文 は ， フ ァ ラ オ ニ ス フ ォ ボ ロ ド プ シ ン(ppR)と 共 役 蛋 白 質(pHtrII)と の 細 胞 膜 内 で の 蛋 白 ／ 蛋 白 問 相 互 作 用 を ， 生 化 学 的 ， 分 光 学 的 ， 物 理 化 学 的 な 方 法 を 用 い 解 析 を 行 っ た も の で あ る ・ppRは レ チ ナ ー ル を 発 色 団 と す る7本 の 膜 内 ヘ リ ッ ク ス を も つ 膜 蛋 白 で ， 高 度 好 塩 菌 の1種 で あ るNatronobacterium pharaonisの 負 の 走 光 性 の レ セ プ タ ー で あ る ． す な わ ち ，ppRが 吸 収 す る 光 で あ る 緑 か ら 青 色 の 光 が こ の 細 菌 に 当 た る と ， そ の 光 か ら 逃 げ る 行 動 を 起 こ す ． 光 量 子 を 吸 収 し たppRは 励 起 さ れ ， 種 々 の 光 化 学 中 間 体 を 経 て ， 元 のppRに 帰 っ て く る と い う 光 化 学 反 応 を 示 し ， こ の 光 化 学 反 応 を フ ォ ト サ イ ク ル と 呼 ん で い る ． フ ォ ト サ イ ク ル 中 に お い て ，ppRの 光 化 学 中 間 体 は 元 のppRと は 異 な っ た コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン を と っ て い る ． ど の 光 化 学 中 間 体 に お け る コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン 変 化 で あ る か は 不 明 で あ る が ， 何 か の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン の 変 化 がppR に 膜 内 で 隣 接 し て い るpHtrlIに 何 らか の 機 構に よ っ て「 情 報 」が 伝 わ り，pHtrII の 細 胞 内 ド メ イ ン に 存 在 す る り ン 酸 化 部 位 の 活 性 を 変 え ， 「 情 報 」 が べ ン 毛 に 伝 わ り ， 走 光 性 の 発 現 に い た る ． な お ， 高 度 好 塩 菌 の 代 表 的 な 菌 株 は ，
〃alobacterium salinarumで あ り ，こ れ に はフ ォ ポ 口ド プ シ ン と称 せ ら れる 緑 青 色 の 光 に 対 し て 示 す 負 の 走 光 性 のレ セ プ ター が 存 在す る ．ppRは ，〃 ・pharaonis に 存 在 す る フ ォ ボ ロ ド プ シ ン で ある ． フ ォボ 口 ド プシ ン は 安定 性 が 低く ， ・ 大腸 菌 で の 機 能 的 大 量 発 現 系 が 確 立 さ れ て い な い ． 一 方 ，ppRは 極 め て 安 定 で ， か つ ， 遺 伝 子 操 作 の 容 易 な ， 大 腸 菌 で の 機 能 的 大 量 発 現 系 が 確 立 し て い る ． こ の た め ， 標 題 は フ ォ ポ 口 ド プ シ ン の 研 究 で あ る が ， 実 験 材 料 にppRを用 い て いる ・ 申 請 者 の 研 究 は ， 基 底 状 態 （ 暗 所 ） お よ び 種 々 の 光 化 学 中 間 体 に お け るppR /pHtrlI結 合 の 相 互 作 用 を 種 々 の 方 法 で 検 討 し た も の で あ り ． 国 際 的 に 高 く 評 価 さ れ て い る ．ppR7pHtrll間 の 相 互 作 用 と い う 本 論 と は ず れ る が ， 無 細 胞 系 の
膜 蛋 白 の 発 原 形 の 新 し い 試 み に も 成 功 し て い る ． こ れ は ， 申 請 者 の 研 究 に お い て ， 必 要 な 変 異 体 を 大 腸 菌 で 発 現 さ せ て 作 成 し よ う と す る と ， 蛋 白 質 が 取 れ な い こ と が あ る ． こ れ は ， 大 腸 菌 の 菌 体 内 で 生 成 さ れ た 蛋 白 質 が 分 解 す る た め で あ る と 推 定 し ， 蛋 白 質 分 解 酵 素 の 存 在 し な い 無 細 胞 系 で 蛋 白 質 発 現 を 行 え ば ， この問題を回避できると考えたことによる．
本 論 文 は ， 第1章 序 論 ， 第2章 実 験 材 料 及 び 方 法 ， 第 3章 結 果 ・ 考 察 ， 第 4章 総 括 か ら な る 学 位 論 文 で あ る ． 70ベ ー ジ か ら な る 和 文 の 論 文 で あ る ． や や 小 さ な 文 字 で 書 か れ て い る の で べ ー ジ 数 は 少 な い が ， 中 身 の 濃 い 学 位 論文であり，上記のように，国際的に高い評価を受けている・
第1章 の 序 論 で は ， 光 受 容 蛋 白 質 ， 古 細 菌 型 レ チ ナ ー ル 蛋 白 質 ， ト ラ ン ス ジ ユ ー サ 蛋 白 質 等 に つ い て 解 説 を 行 っ た 後 ， 本 研 究 の 目 的 を 述 べ て い る ． 第2章 の 実 験 材 料 及 び 方 法 で は ， 生 物 試 料 ， 発 現 ベ ク タ ー ， 分 光 学 的 測 定 ， 電 気 化 学 測 定 を 述 べ ， 相 互 作 用 を 解 析 す る に 用 い た 方 法 で あ るpull‑down assay， 熱 安 定 性 測 定 ， 等 温 滴 定 型 熱 量 計 に つ い て ， 申 請 者 が 改 良 し て 点 を 含 め て ， 詳 し く 説 明 し て い る ． 第3章 は 結 果 ・ 考 察 で あ り ； 得 ら れ た 結 論 は 以 下 に 述 べ る 通 り で ある．
基 底 状 態 （ 暗 所 ） で のppR7pHtrlI複 合 体 の 化 学 量 論 比 （ 約1） や 解 離 定 数
（ 約0.1ルM)を 算 出 す る 事 に 成 功 し ，ppRの 活 性 化 に 伴 っ て 構 造 変 化 を 起 こ し ，pHtrIIと の 結 合 親 和 性 が 大 き く 低 下(0.1ロM‑*15ルM)す る こ と を 明 ら か に し て い る ． ま た ， 相 互 作 用 ・ 構 造 変 化 に 重 要 な ア ミ ノ 酸 残 基(Tyr199ppR， Asp193ppR，pHtfIIG83‑0149，Asn74pHtrI； Thr204ppR等）を同定することに成功している・
さ ら にpHtrIIに 水 溶 性tagを 付 加 す る こ と で ，pHtrIIを 膜 蛋 白 質 の モ デ ル と し た 新 規 無 細 胞 膜 蛋 白 合 成 系 の 開 発 に も 成 功 し て い る ． こ れ ら の 研 究 成 果 か ら ， ppR/pHtrIIを 介 し た 光 情 報 伝 達 系 は ， 膜 蛋 白 質 を 介 し た 情 報 伝 達 機 構 の 中 で 最 も理解の進んでいる系の1っとなったと言えるであろう．
こ の よ う に ， 申 請 者 の 学 位 論 文 は ，ppR7pHtrIIを 介 し た 光 情 報 伝 達 系 の 理 解 に 多 大 の 貢 献 を し た も の で あ り ， 薬 学 博 士 の 称 号 を 授 与 す る に 十 分 に 値 す る と 認めた．
