Polyoxometalateが有するcysteine検出能の検討及びジスルフィド結合形成反応への展開

山形大学 理工学研究科

バイオ化学工学専攻

准教授

今野 博行

Polyoxometalate (POM)

 金属元素に酸素が6個配位した MO₆を基本骨格とする金属酸化物 クラスターアニオン  構造・構成元素・対カチオン等を 制御することで、様々な機能性を 付与できる可能性 MO₆ (octahedron) ( P_xM_yO_z )n 1 nm • 酸触媒 • 酸化剤 • 医薬品 (癌、HIV、アルツハイマー病) • ナノマテリアル • フォトクロミック材料

金属酸化物クラスターアニオン：

ポリオキソメタレート

0 25 50 75 100 150 200 Concentration of α-K₆[P₂W₁₈O₆₂]·nH₂O (μg/mL) 2013年、POMの細胞膜破壊作用を並河らが発見*  POMの抗菌活性試験を行った結果、グラム陽性菌のブドウ球菌に 対し MIC ( 最小阻害濃度 ) = 100 μg/mL の抗菌活性  ブドウ球菌培養液が青色に呈色

* Nabika, H., et al., RSC Adv. 2013, 3, 21271-21274

After 3 h

ブドウ球菌表面上で酸化還元 反応が進行したと仮定 チオール含有アミノ酸である cysteine水溶液にPOMを添加 したところ、青色に呈色 Ox. Red. この呈色反応は速やかに進行し、極めて視覚的であるにも 関わらず、先行研究はほとんど行われていない POM L-cysteine [P₂W₁₈O₆₂]6- _[P 2W18O62]

7-本研究の背景

POMのcysteine検出能の検討

ジスルフィド結合形成反応への展開

1

2

Keggin type POM1. メタタングステン酸アンモニウム (NH₄)₆[H₂W₁₂O₄₀]·nH₂O POM2. ケイタングステン酸 H₄[SiW₁₂O₄₀]·nH₂O POM3. リンタングステン酸 H₃[PW₁₂O₄₀]·nH₂O POM4. リンモリブデン酸 H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O POM5. リンモリブデン酸アンモニウム (NH₄)₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O Dawson type POM6. リンタングステン酸カリウム α-K₆[P₂W₁₈O₆₂]·nH₂O POM7. 1欠損リンタングステン酸カリウム α-K₁₀[P₂W₁₇O₆₁]·nH₂O POM8. 3欠損リンタングステン酸ナトリウム α-Na₁₂[P₂W₁₅O₅₆]·nH₂O • Blue octahedrons : W or Mo • Red dots : O

Keggin type Dawson type

[PW₁₂O₄₀]3- _[P

2W18O62]

POMの作製法

85% H₃PO₄ Na₂WO₄ H₂O reflux 100℃, 8h KCl Na+_P 2W18O62 6-1) recrystallization 100℃, H₂O 2) cooling 5℃, 1 day K₆[P₂W₁₈O₆₂] • 10H₂O washing XRD pattern of POM6

Mixture of 10 mg/mL L-cysteine (500 µL) and 10 mg/mL POM1-8 (100 µL) POM1〜8 を用いたcysteineの検出 0 1 2 3

POM1 POM2 POM3 POM4 POM5 POM6 POM7 POM8

A

bsor

ban

ce

After 24 h, 700 nm

POM1 POM2 POM3 POM4 POM5 POM6 POM7 POM8

After 24 h

POMを用いたcysteineの検出 (1)

POM4

Cysteineに対してH₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O (POM4) が最も高い反応性

After 10 min

Gly Ala Val Leu Ile Phe Cys Ser Pro Met

Gln

Asn Thr Tyr Trp Asp Glu His Arg Lys

Mixture of 10 mg/mL L-amino acid (100 µL) and 10 mg/mL H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O (20 µL)

H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O (POM4) を用いたcysteineの検出

H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂Oはcysteineのみを選択的に検出

ab un dan ce 0 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0

X : parts per Million : Proton

4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 (t ho us an dt hs ) ₀ 10 .0 20 .0 30 .0 40 .0 50 .0

X : parts per Million : Proton

4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 4. 08 4 4. 07 6 4. 06 8 4. 06 0 3. 94 1 3. 93 0 3. 38 5 3. 32 3 3. 31 5 3. 29 3 3. 28 5 3. 24 4 3. 12 9 3. 11 3 3. 10 0 3. 08 2 3. 03 8 3. 02 6 3. 00 7 2. 99 5 2. 95 3 2. 94 5 2. 92 3 2. 91 5 -5 2. 15 u

Fig. 2. 1_{H-NMR spectra of L-cysteine and}

POM mixture (3 days)

チオールの酸化に伴う ジスルフィド結合の形成 1 2 2 [PMo₁₂O₄₀]3- _[PMo 12O40] 4-酸化還元状態の変化に 伴うPOMの呈色反応

POMを用いたジスルフィド結合の形成

Mixture of L-cysteine (500 µL) and 20 mM H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O (500 µL) After 2 h 100 mM 10 mM 1 mM 100 μM 10 μM 1 μM control After 2 h, 700 nm 0 0.5 1 1.5 2 Absorban ce

Final concentration of L-cysteine

100 mM* 10 mM* 1 mM 100 μM 10 μM 1 μM _Control

Detection limit

Fig. 3. Transition of absorbance by concentration of L-cysteine

After 24 h

Mixture of 10 mg/mL protected cysteines (1 mL, DMSO) and 10 mg/mL H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O (200 µL)

Boc-Cys-OH Z-Cys-OH H-Cys-OBn H-Cys-OMe Fmoc-Cys-OH

保護基の立体障害がPOMとの反応性に大きく影響する

--1 5 .7 2 ---13 87 187 287 4 9 mV Time (min) --1 6 .1 2 -- --2 9 .8 ---11 89 189 289 389 4 9 mV Time (min) After 10 min Addition of H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O (1.8 mg) to 10 mM glutathione aqueous solution (1 mL)

Fig. 4. HPLC profile of glutathione and POM mixture

GSH GSSG H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O H₂O, r.t., 24 h GSH GSSG t_R = 5.72 t_R = 9.80

POMを用いたglutathioneの検出

Mixture of 10 mg/mL pentapeptides (800 µL) and 10 mg/mL H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O (200 µL)

Table 1. Reaction of pentapeptides with POM

entry sequence with POM

1 Ac-Ser-Cys-Ala-Phe-Ile-NH2

2 Ac-Ser-Gly-Ala-Cys-Ile-NH2

3 Ac-Ser-Phe-Cys-Phe-Ile-NH2

4 Ac-Ser-Gly-Cys-Gly-Ile-NH2

ペプチドのアミノ酸配列によりPOMとの反応性は大きく異なる After 24 h, 700 nm 0 1 2 3 3 4 5 6 Cys Absorban ce 4 Cys

Fig. 5. Absorbance of

penta-peptides and POM mixture

3 2

1

POMを用いたpentapeptideの検出

Oxytocin

H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O DMSO, r.t., 24 h

[M+H]+

= 1007.2919

Fig. 6. HPLC profile of oxytocin and POM mixture Fig. 7. ESI-MS of oxytocin

--5 1 3 .5 6 --6 1 3 .9 8 -- ---50 450 950 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 mV Time (min) --1 1 3 .3 9 -- --2 1 4 .7 4 ---50 450 950 12 13 14 15 mV Time (min) t_R = 13.98 t_R = 13.39

Oxytocin linear peptide

Oxytocin

[M+H]+

= 1009.4436

Bactenecin

H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂O

0.1M HCl aq./DMSO (1:2) r.t., 24 h

Bactenecin

Bactenecin linear peptide

Fig. 9. ESI-MS of Bactenecin

[M+H]+ = 1485.7446 --3 1 0 .3 4 -- --4 1 1 .4 7 20 70 120 170 10 10.5 11 11.5 12 mV Time (min) 2 1 0 .1 2 --3 1 0 .3 8 --4 1 0 .5 9 --5 1 1 .4 8 --20 70 120 170 10 10.5 11 11.5 12 mV Time (min)

Fig. 8. HPLC profile of Bactenecin and POM mixture

t_R = 11.47 t_R = 10.38

[M+H]+

= 1483.6105

POMのcysteine検出能

ジスルフィド結合形成反応への展開

 Keggin型Polyoxometalateの H₃[PMo₁₂O₄₀]·nH₂Oがcysteineと 選択的に反応し、青色に呈色  POMのcysteine検出能は保護基の 有無やペプチドのアミノ酸配列に より大きく変化  POMを用いたチオールの酸化によるジスルフィド結合性 環状ペプチドの生成を確認

結論

従来技術とその問題点

グルタチン、システイン、ホモシステインなどに代表と される生体チオールは、生体酸化還元ホメオスタシスを維 持し、代謝を司る重要物質の一つである。 酸化ストレスや疾患への関与が示唆されている特定のチ オールを検出する手法として分光学的な方法が用いられ る。 エルマンズ試薬（DTNB法） DTNB (λ_max = 325 nm) 5-Mercapto-2-nitro benzoic acid (λ_max = 412 nm) Mixed disulfide On/off シグナル比が低い 洗浄・単離を必要とする 難水溶性 チオール以外の攻撃を受けやすい

新技術の特徴・従来技術との比較

エルマンズ試薬 _POM 水溶性 低い 高い 有機溶媒溶解性 高い 低い 安定性 様々な求核攻撃を受ける 加水分解を受けやすい チオール特異的_{>pH9で分解する} 後処理 洗浄・単離が必要 必要としない 5,200円/1 g (同仁化学） 価格 7,600円/100 g （東京化成）

想定される用途

本技術の特徴はその手軽さにある。市販の高額な試薬と比較 して感度（シグナル比）が十分でないため、その効果的な 用途を模索中である。 チオールの架橋反応を基盤にしているので、バイオコン ジュゲート（蛋白質と蛍光分子等）試薬としての用途を 想定している。 生体内検査試薬のみならず、水質検査など環境測定分野への 応用も視野に入れて検討している。

実用化に向けた課題

現在、アミノ酸、ペプチドについて集中して検討している。 今後、他の生体分子（核酸、糖鎖、脂質など）、チオール系低 分子への検討が必要である。POMの構造改変による感度の向上 にも取り組み必要がある。 さらに蛋白質中のチオールの検出、蛋白質のバイオ コンジュゲート試薬としての可能性を追求する。

企業への期待

本方法論を適用可能フィールドの提供

講演者は大学、創薬研究、有機合成などの狭い世界しか

知らないため、本技術が真に活躍できる場所がどこにあるか はっきりと見定めができていない。

本研究に関する知的財産権

・発明の名称 ： チオール検出剤及びチオール

検出方法

・出願番号

： 2017-042821

・出願人

: 国立大学法人山形大学

・発明者

: 今野博行、並河英紀、鵜浦啓

産学連携の経歴

・2006年−2007年 地域イノベーション創出事業・

重点地域研究開発プログラム

シーズ発掘試験に採択

・2011年-2012年 第2回A-STEP FS探索タイプに

採択

・2017年-2018年 地域産学バリュープログラムに

採択：セルスペクト社と共同研究

お問い合わせ先

山形大学 国際事業化センター

知的財産部門 事務担当 馬場

TEL 0238-26-3024

FAX 0238-26-3633

Mail [email protected]