蛍光抗体間接法による伝染性軟属腫患者血清中の抗ウイルス抗体の検出

(1)

( 東女医大誌第54巻第8

号)

頁 706-712 昭和59年8月J

蛍光抗体間接法による

伝染性軟属腫患者血清中の抗ウイルス抗体の検出

川上

東京女子医科大学皮膚科学教室(主任:肥田野信教授〉

コ子

げ理

( 受付昭和59年6月 7日〉

Detection and Titeration of Virus-Specific-Antibodies in Serum of Patients with Molluscum Contagiosum

by Means of Indirect Immunofluorescent Study Michiko K A W AKAMI

Department of Dermatology (Director: Prof. Akira HIDANO) Tokyo Wom巴n'sMedical College

Molluscum contagiousm (MC) is a common viral dermatosis among children， but little is known about its immunity. About 10 percent of cases develop an eczematous reaction surrounding the MC lesions and this is supposed to be the clinical expression of immunity. And recently several cases of spontaneous remission of MC lesions are reported and in these cases also immunity is suggested.

In order to study the humoral immunity of MC， sera of ten children suffering from MC were examined by means of indirect immunofluorescent study. The titer of the antibodies was compared with the clinical parameters of MC such as severity and inflammation. As control， ten children with no histry of MC were examined by the same method.

The results were as follows.

1. In all MC patients， the serum antibodies were detected: IgG was positive in 9 cases (90%)， IgM 6 (60%)， IgA 1 (10%) and IgE 1 (10%)， whereas IgD was detected in none. In contrast， the control group showed no positive reactions. No correlation was found with the age of the patients and extent of skin involvement. 2. Three patients with clinically inflammed MC showed high M C virus-specific-antibody titers as compared with patients having MC without inflammation. 3. The positive reaction to virus-specific-IgM was found in patients with a history of M C less than 3 months duration. 緒言 Molluscum contagiosum (以下MCと略〉は M Cウイルス感染によっておこる皮膚の良性ウイルス性疾患で，主として幼児が擢患しそのピークは4-5歳にみられる. M Cウイルスはボックスウイルス群に属する DNAウイルスで，成熟すると亜鈴型のコアを有し， 300

x

200

x

100nmのレンガ型を呈するヒトに感染する最大のウイルスである.現在のところのこのウイルスはヒト以外の動物に感染させることは難しく，組織培養中で増殖させることにも成功していない.感染様式はヒトーヒトの直接感染によるものが大部分で，恐らくウイルスは毛孔または傷口より侵入し，表皮基底細胞に感染すると考えられる.即ち，電顕的観察によればその感染様式は他のボックスウイノレス群とほぼ同様で， pinocytosisにより細胞内にとりこまれたウイルス粒子は宿主細胞の消化酵素によって外皮を脱ぎ一706

(2)

(五rststage of uncoating)，コアが露出される. 露出されたコアの中で，コアが保有するDNA依存RNA合成酵素により初期メッセンジャー RNA (mRNA)の合成が開始され，合成された mRNAはコアの外に遊出して初期蛋白の合成が関始される . その後コア膜も分解され (second stage of uncoating)， DNAが細抱質中に放出され，本格的に初期mRNA合成，初期蛋白合成と DNA合成が開始される.DNA合成が進行するにともない後期mRNAおよび後期蛋白が合成され，ウイルス粒子が組み立てられてし、く.組織培養においてはヒ卜表皮細胞， Vero細胞などで first stage of uncoatingまで観察できるが，その増殖までは成功していない. M Cの免疫に関してはPinkusらの接種実験以来，遅延型アレルギ一反応の関与が推論されてきた.近年M Cの自然消槌現象を観察した報告がし、くつかあり，この際にも細胞性免疫の関与が主張されている. 一方，液性免疫にしても患者血清中にウイルス特異抗体を認めた報告はあるが，特異抗体と皮診の状態との関連につき詳細に検討した研究はない.そこで液性抗体と皮疹との関係を調べる目的で，蛍光抗体間接法を用いて患者血清中の抗ウイルス抗体の検出と抗体価の測定を行なった. 実験および方法 1.実験材料対象としたのは東京女子医科大学病院皮膚科外来を昭和59年2~ 3月の聞に受診した 6歳以下の小児で， MC感染児10名(男6名，女4名〉及び同年齢層のMCの既往のない児10名(男 7名，女 3 名〉である.採血は受診時に行ない，血液一般検査と免疫グロプリン定量(IgG，IgA， IgM，以上はレーザーネフロイムノ法， IgEはRIST法にて測定〉を行ない，一方，蛍光抗体用として分離した血清は使用まで-800 C凍結保存した.この血清は使用直前に室温にて融解後， 560 C30分間恒温槽中で加温し非働化して用いた. 基質として多発性M C患者皮膚よりトラコーマ摂子で、採取したM Cを各数コずつOCT com-poundで包埋し， -80o C凍結保存したものを使用した

抗血清はFITC標識抗ヒト IgG，IgA， IgM， IgD

血清(免疫動物ウサギ〉はいずれも DAKO社製 (molar F /P ratio2.3)を，同抗ヒト IgE血清(免疫動物ヒツジ〉はCappel社製 (F/P ratio4.30 mg/g)を用い，いずれも使用に際しては10倍希釈液を用いた. 2. 方法まずクリオスタットで-20o

_C

の低温下で基質の 4μ凍結切片を作製し，卵白アルブミンを塗布した無蛍光スライドグラスに貼布した.これをphos -phate bu任eredsaline(以下PBSと略〉で10分間ずつ3回，毎回PBSをかえて振量洗浄した.次に被検血清の原液と10倍， 20倍， 40倍， 80倍， 160倍， 3201倍， 640倍PBS希釈液を基質上にかけ，湿箱内で3TC 30分間インキュベートした後，再びPBS で10分間ずつ 3分間振量洗浄した . 基質上に FITC標識抗血清をかけ，再び湿箱内で3TC30分間インキュベートした.最後にPBSで10分間ずつ3回振量洗浄した後，緩衝グリセリン液で、封入し，直ちにオリンパス社製落射型蛍光顕微鏡にて UVフィルターを使用して観察した. 結果 1.対照児における蛍光抗体所見まずコントロール児 (4 カ月 ~4 歳) 10名では全例陰性で，免疫グロプリンIgG，Ig，AIgM， IgD，

IgE共沈着を認めなかった(表1).

2 .

MC児における蛍光抗体所見

次にMC児10例中で陽性を示したのはIgG9 例， IgM 6例， IgA 1例， IgE 1例であった.IgD

は全例陰性であった.

蛍光抗体所見をIgG，IgM， IgA， IgEで比較してみると， IgGが最も著明で蛍光も強く密な粒子状に認められるが， lgMでは筒状， IgAではレース状で蛍光も弱く， IgE もごく~~\，、蛍光で網目状に認められた(写真1，2， 3).

3 .

皮疹の程度と抗体価との関連 MCの皮疹の程度と抗体価との関連について検討するため，まず皮疹の数により MCの程度を3 段階に分け， 1 ~19 コを十， 20~49 コを斗十， 50コ以上多発したものを+仲とした.皮疹+の

4

例につ 707ー

(3)

表1 コントローノレ群の抗体価抗体価症例年齢性別病名 IgG M A DIE 1 1 4ヵ月男乳児湿疹 2 1 7ヵ月男乳児湿疹 3 1歳女乳児湿疹 4 3歳男脱毛症 5 4歳男アトピ性皮膚炎 6 4歳男アトピー性皮膚炎 7 4歳男 7トピー性皮膚炎 8 4歳男血管腫 9 4歳女尋常性魚鱗癖 10 4歳女アナフィラ_ド紫斑病Fトイ写真1 症例9の蛍光抗体間接法によるIgG陽性所見.軟属腫小体に一致して明らかな蛍光を認める. (x 200) 写真2 症例9のIgA陽性所見.軟属腫小体の表面にレース状に蛍光をみる.(x 200) 写真 3 症例10のIgM陽性所見軟属腫小体に一致して淡い筒状蛍光を認める.(x 200) いてみると陽性はIgGは全例， IgMでは2例であった.そして IgG抗体価は症例

3

の1例のみ

8

0

倍と高値を呈し，他の

3

例は

1-10

倍であった. 高抗体価を示した症例3は臨床的には炎症症状を伴なっていた.皮疹十十の2例はし、ずれも炎症も伴わず，陽性所見はIgGのみで抗体価は

2

0

倍であった.皮疹十件の 4例ではIgGが3例， IgMは全例，

IgAとIgEがl例陽性であった.IgG抗体価は症

例

8

で

3

2

0

倍，症例

9

で

1

6

0

倍と高値を示したが，臨床的にみるとこの

2

例共炎症症状を伴ったM C であった (表

2 )

.

4.炎症の有無と IgG抗体価以上より M CのIgG抗体価は皮疹の程度ではなくむしろ炎症の有無と関連するのではないかと表2 M C群の抗体価抗体価症例年齢性別現病歴皮疹炎症 IgG M A D E 1 1 4歳男 1ヵ月

₊

X1 X1 214歳女 2-3ヵ月

+

X10 315歳女 5ヵ月

+

X80 416歳女 2-3ヵ月

+

X10X1 515歳男 7ヵ月十十 x20 615歳男 2-3ヵ月 +十 x20 711歳女 3ヵ月 -ttt x1 x1 814歳男 3ヵ月 +朴

+

x320 x1 915歳男 2ヵ月 +件

+

x 160x1 x1 x1 10 6歳男 2ヵ月判+ x1 708ー

(4)

抗体価現病歴 IgG IgM 1M X1 X1 2M X160 X1 λF X1 2-3M x 10 11 X20 11 X10 X1 3乱f x320 x1 ゲ x1 x1 5M x80 7M x20 M Cの濯患期間と抗体価表4 炎症(+)群と炎症〔ー〉群の抗体価の比較抗体価症例年齢性別現病歴皮疹 IgG M A D E 315歳女 5ヵ月 + x80 814歳男 3ヵ月 +朴 x320 x1 91 5歳男 2ヵ月十廿 X160 x1 x1 〉く1 一一一」一一一一一一一一一よ一一一一表3 炎症(十〕群認められたが， IgMは皮疹出現後3カ月までの症例で揚性であった(表4).なお症例8では擢患3 カ月後と 3カ月半後に抗体価を測定したが 3カ月半後ではIgM抗体は消失していた.

6 .

アトピー性皮膚炎との関係今回対象としたM C児をアトピー性皮膚炎の有無で分けてみると，アトピー性皮膚炎児にM C の皮疹+仲のものが多く，しかも擢患期聞が2-3 カ月で炎症症状を生じていることがわかった.また予測されるごとくアトピー性皮膚炎児では血中好酸球数，血清IgE値の高値がみられた(表5). 次に今回検査したアトピー性皮膚炎児について抗体価症例年齢性別現病歴皮疹 IgG M A D E 114歳男 1ヵ月

+

x1 x1 214歳女 2-3ヵ月

+

x10 416歳女 2-3ヵ月十 x10 x1 515歳男 7ヵ月十十 X20 615歳男 3ヵ月十十 x1 x1 7 1 1歳女 2ヵ月十件 x1 10 6歳男 2-3ヵ月十汁 x20 炎症(ー)群予想されたため，症例を炎症の有無で分類してみると，果して炎症 ( + ) 群ではIgG抗体価は 80-320倍と高いのに対し，炎症(一〉群ではIgG 抗体価は1-40倍と，明らかに前者の方が後者に比し， IgG抗体価の上昇を認めた〔表3). 5. M C擢患期間との関係次にM Cの擢患期間と IgG，IgM抗体との関係をみると， IgG抗体はM Cの躍恵期間に関係なくアトピー性皮膚炎(+)群と(-)群の比較抗体価 _EOS (mIgg/Gdl〕 A M E 症例年齢性別皮疹現病歴炎症 WBC _% _(mg/d_J₎_(mg/d_J₎_(IU/mO IgG IIgM 4 6歳女十 2-3M x 10 x1 7.600 6 960 104 142 1.087 7 1歳女十件 3M x1 x1 9.600

。

1.042 138 23 44 8 4歳男十朴 3M + x320 x1 7.500 6 702 112 90 129 9 5歳男十件 2M + x 160 4.900 7 971 131 122 1.775 10 6歳男 +什 2M x1 7.900 13.5 1.258 98 91 1.255 表5 AD(十〉群 918 207 128 379 AD(ー〕群 -709 唱 iη41υFhdpo

(5)

MC(+)群表6 アトピー性皮膚炎児の MC(十)群と(-)群の比較症例年齢性別 M C WBC Eos _% (mI立E/Gdl〕_{(mg/d]) (mg/dI}A M ₎_C_I_U/E _m_j₎ 4 6歳女十 7.600 6 960 104 142 1.087 8 4歳男 +仲 7.500 6 702 112 90 129 9 5歳男十仲 4.900 7 971 131 122 1. 775 10 6歳男十仲 7.900 13.5 1.258 98 91 1.255 MCCー)群剛剛剛・圃E守 -1) 2) 3) ︼戸 qtuq 合 υ v i ハ H U ハ H U -ょ 1 よ

MC

(+)群と

MC

(-)群につき血液検査及び免疫グロプリン値を比較してみると，

MC(+)

児が

MC(-)

児に比し，血中好酸球数，血清

I

g

G

値及び

I

g

E

値の上昇傾向を認めた(表

6)

.

考察

MC

の液性免疫に関しては

1

9

3

7

年

B

r

a

i

n

1 )は患者血清中に抗体を証明することはできなかったとし，

MC

病変部より作製したワクチン注射は無効であったと報告した.1凹95臼3年にいたつて

Mi

抗

t

c

h

陀凶

e

1

l ら陽性でで、あつたとし，この3例はいす守れも外陰部に多発した

MC

で，躯幹に多発したものでは抗体は陰性であったと報告している.また

MC

の補体結合抗体は可溶性で，56'Cで

1

時間加熱すると破壊消失し， 4

'

c

で保存すると徐々に消失し 6週で大部分、消失する性質があるとした.

MC

病変部抽出液の遠心上清を無菌的に週一回を 4週にわたり (初回

0.5ml

，以後1

m

l)接種したところ，局所的ならびに全身性の反応は認められなかったが，補体結合抗体価の上昇が認められた.しかし抗体価は

4-8

倍と低かった.一方

MC

の補体結合抗体を有する患者血清を痘癒，牛痘及びニワトリ痘抗原と交又補体結合反応を施行したが，これらのボックスウイルスとの交又反応は認められなかった

1

9

6

1

年

E

p

s

t

e

i

n

ら3)は

MC

病変部より作製した組抗原を用いてゲル内沈降反応

(

O

u

c

h

t

e

r

l

o

n

y

法〉を行ない，

MC

患者

2

1

例中

9

例

(

4

3 %

)

に沈降線を生じたが，正常児11例では沈降線を生じたものは 1例もなかったと報告し，中でも皮疹数の多いほど沈降線は著明であるとした.また成人例

7

3

例で、は8例 (11%)に陽性がみられたが，この中には内臓悪性腫虜，多発性骨髄腫，肝炎などで γグロプリン高値の患者が含まれ

f

a

l

s

ep

o

s

i

t

i

v

e

の反応と考えられた.本邦では

1

9

6

8

年，

1

9

6

9

年に谷垣ら州が同様にゲル内沈降反応、で

MC

患者

1

2

例中

3

例

(25%)

に血中抗体を証明しているが，抗体価は2- 4倍と低かった.赤血球凝集反応に関してはまだ陽性の成績が得られていないが，中和抗体に関しては

1

9

6

1

年

Chang

&

W

e

i

n

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t

e

i

n

6₎_が

_MC

患者

4

例中

3

例

(75%)

に陽性であったとしたが，

1

9

6

2

年

Neva

ら7)の4例における追試では中和抗体は検出されなかったとしている. 蛍光抗体間接法による血中抗体の検出は，

1

9

6

2

年

E

p

s

t

e

i

n

ら8)によるものが最初で，

MC

患者

1

8

例中

1

6

例

(

8

9 %

)

に陽性で，非擢患者はすべて陰性であり，特異蛍光は

MC

小体を含む有練層頼粒層に認められるが，時に角層においてケラチンに対する非特異蛍光がみられることを報告した.そしてその結果を

O

u

c

h

t

e

r

l

o

n

y

法と比較し後者では

MC

患者

4

0

例中

1

5

例

(

3

8 %

)

と陽性率も低く，

f

a

l

s

e

p

o

s

i

t

i

v

e

反応があるに比し，前者では特異度も鋭敏度もすぐれ，抗体検出法として最適であると述べている.この特異抗体は

MC

患者との接触者で上昇することはなく，皮疹が出現して始めて上昇する.しかしその抗体価は低く，しかも皮疹治癒後に急速に消失すると述べている.

1

9

7

年

S

h

i

r

o

d

a

r

i

a

ら9)は

MC

患者

6

7

名につい -710ー

(6)

て蛍光抗体間接法にて患者血清中のIgG，IgA， IgM抗体の検出を行ない，その結果検出率は69% で，うち IgGは39例(58%)，IgMは20例(30%)， IgAは7例(10%)であったとしている.これらの抗体はM Cの曜患期聞が短い新鮮例ほど(ことに6カ月以下〉認められた.また蛍光抗体法によっても M Cウイルスと他のボックスウイルスー痘清，ウサギ痘，マウス痘ウイノレスーとの交又がないことを認めた.IgG， IgMの蛍光抗体所見を比較すると IgGが最も著明に認められ，封入体内に密な粒子の集合としてみられるのに対し， IgMは筒状にみられ，この染色性の違いはM Cウイルスの異なった抗原に対する反応として考えられるとした. しかし， Epsteinらも Shirodariaらも血中抗体が陽性か陰性かの判定のみで，抗体価の測定までは行なっておらず，また皮疹との関連につき検討を加えたのは自験例が最初である. 自家成績と上記2者のデータを比較すると，まず陽性率に関して自験例では100%でShirodaria らの69%をはかるに上まわっており，この中， IgG は90%とShirodariaらの58%を上まわり， IgM も60%と後者の30%を上まわっているが， IgAは 10%と同率であった.なおIgD，IgE に関しては Shirodariaらは行なっていないので比較できない.これらIgG，IgMの陽性率の違いは使用した抗血清の違いや対象とした患者の年齢及び擢患期間の差によるのではないかと考えられる . また Epsteinらの陽性率89%は自験例IgGの90%にほぼ一致する. 次に抗体価と皮疹との関連について従来の研究では言及されていないが，今回データで皮疹の程度(数〉との関連は認めず，むしろ皮疹に炎症を伴なう症例にIgG抗体価の上昇を証明し得た.炎症を伴なう M CにおいてはM C小体を含む表皮構造の破壊が認められ，それに伴う周囲のリンパ球を主体とする強い細胞浸潤を認め，肉芽腫様を呈するものもある10)1九このような炎症反応は表皮破壊に伴って表皮の成分であるケラチン，皮表脂質などの他， M Cウイルス自体が真皮内に入ることにより惹起された現象で、あり，その結果としてウイルス特異抗体の産生されることは当然予想される.それが今回蛍光抗体間接法によって証明されたことになる. 一般にアトピー性皮膚炎児にM C感染の多いことはひろく知られており，その原因として免疫学的素因が重要な役割を演ずるといわれ，血清 IgE値の高値，血中のIgG

・

FcR陽性T細胞の減少，リンパ球のmitogenに対する反応の低下，頼粒球，単球のchemotaxisの低下に加え，

K

リンパ球に関連したADCC(antibody-dependent cel -lular cytotoxicity)能の低下が皮膚におけるウイルス，真菌などの感染をおこしやすくしている可能性が指摘されている12) 今回対象としたアトピー性皮膚炎児でもM Cの多発傾向が認められ，またMC(+)とMC(-)群の比較では， MC( +) 群で血中好酸球の増加を認め， MC( -)群に比し， IgG， IgE値の高い傾向のみられたことは疫学的見地からも興味深い. 結盟関口蛍光抗体間接法を用いて M C患者血清中の抗ウイルス抗体の検出を行ない，以下の結果を得た. 1)陽性率は100%で， M C患者10例中IgGは9 例(90%)，IgMは6例(60%)，IgAは1例(1%)， IgDはO例 (0%)， IgEは1例(10%)に陽性所見を得た.なおMC(一〉のコントロール児で、はすべて陰性であった. 2)M C児10例中，臨床的に炎症所見のみられた 3例においては著明なIgG抗体価の上昇を認めた 3) IgM抗体陽性は皮疹出現後3カ月までの新鮮例でみられた. 以上より M Cの蛍光抗体間接法はすぐれた抗ウイルス抗体検出法であり， M C における炎症反応によって抗体の上昇することが証明された. 稿を終るにあたり，御指導，御校聞を賜わりました肥田野信教授に深謝致します. (本論文の要旨は日本皮膚科学会第610回東京地方会で発表した.) 文献 1)Brain， R.T.: The treatment of virus diseases

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