〔総説〕 松本歯学14：139∼153，1988 key words：エナメルタンパク質一アメロゲニンーエナメリンー生化学 エ ナ メ ル タ ン パ ク 質
―アメロゲニンとエナメリソの生化学―
原 田 実
松本歯科大学 口腔生化学教室（主任 原田 実教授） Enamel Proteins-Biochemistry of amelogenin(s)and
enamelin(s)-MINORU HARADA
DePartment（ゾOral Bioche〃zistry，」VatSu〃zoto Deηtal College （Chief：」Prof M．正larada）Summary
During the process of enamel fomlation by ameloblasts the extracellular matrix that is secreted first is relatively high in protein（20％）， but， this percentage decreases during the maturation phase to less than 1％． Enamel proteins may be divided into two classes designated amelogenins and enamelins based upon their solubility， affinity to hydrox・ yapatite， amino acid compositions， and apparent molecular weight． Neutral salt or guanidine・HCI soluble amelogenins gradually hydrolyzes into small peptides during hydroxyapatite crystal formation， while enamelins， which solubilize after EDTA decal・ cification， remain in apatite crysta】after maturation． In this paper， biochemical studies on the amelogenins and the enamelins are described． This includes extraction from tissue preparation， purification procedure， primary and secondary structures of amelogenin， antibody production and their cross reactivity， amelogenin cDNA cloning and analysis of its nucleotides sequence， and the function of both proteins on crystal formation． は じ め に 萌出歯のエナメル質に存在するタンパク質の研 究はすでに1942年Deakinsi｝によりはじめられて いたが，エナメル質のタンパク質量は極めて少な く，純粋な試料を得ることが困難であった．しか （1988年7月30日受理） し，エナメル質形成中の未萌出歯ではタンパク質 の存在が15∼20％と多量存在するため，研究者の 注目をあつめ，1960年にはエナメルタンパク質の 研究が本格的になった．これらはタンパク質の研 究の第一段階である，そのアミノ酸組成の分析に， 重点がおかれたものであった2∼5｝． これらの結果からエナメル質に存在するタンパ ク質はヒト，ウシ，ブタなど各種動物で，アミノ140 原田 アメロゲニンとエナメリンの生化学 酸組成が，すでに知られているコラーゲンやケラ チンなどと相違するタソパク質であることがわか り，エナメル質に特有なタンパク質を“アメロゲ ニン（amelogenines）”と命名することを提案した のはEastoe6）であった．また実際に，この名称をエ ナメルタンパク質に関する論文に使用したのは Eggertらηがはじめてであった． 一方，“エナメリン（enamelins）”という名称は Mechanic8）がウシ胎児のエナメルタンパク質に 用いたのが最初であった．しかしエナメル質から 得たタンパク質に二種の名称が使用される混同を さけるため，エナメリンは成熟エナメル質のタン パク質に限定することが推奨された9｝． この様な経過からアメロゲニンとエナメリンは 区別して使用されることになったが，化学的性質 の相異に基づいて両者を区別して使用したのは Temineら1°）である．幼若エナメル質中のタンパ ク質を，EDTA脱灰操作前後で両者を区別した． すなわち，EDTA脱灰前に塩酸グアニジソで溶出 されるタンパク質をアメロゲニン，脱灰後同一溶 媒で溶出されるタンパク質分画をエナメリンと称 した． エナメル質に関する国際シンポジウムのPro・ ceedingsもすでに第4巻11）が出版され，国内にお いても，昨年エナメル質研究に関する成書12）が出 版されている．このように多くの報告から，生体 で最も硬度の高いエナメル質の結晶形成に，エナ メル芽細胞が合成・分泌するエナメルタソパク質 がいかにかかわりあっているかを理解するため， エナメルタンパク質の生化学的特徴を中心に本文 をまとめた，
試料調製法
1．エナメル質試料の調製法とタンパク質含量 エナメルタンパク質を抽出精製するにあたっ て，幼若エナメル質試料が必要になる．分離部位 やタンパク質収量が明示されている報告を記載し た． −Temineら1°｝は発育月数の異なるウシ胎児か ら未萌出臼歯歯胚を切開し，軟組織を機械的に除 去後，歯を取出し，各種タンパク分解酵素阻害剤 を含有する冷却（4℃）水溶液（0．05MNaC1，0．05 MベンザァミジソHC1，0．01 Mフェニルメタン スルポニルフルオライド，pH 7．2）に浸す．水溶 HE D SE 図1 ウシ胎児（4−5ケ月）臼歯尖端部の切片模式 図：e｝ The cross−hatched areas（SE）represent soft， scrapable ename1， the gray areas repesent rnineralized dentin（D）， while the plain white areas repesent more fully mineralized， har− dened enama1（HE）． After removal of the soft enamel layer， cuts were made at the arrows separating the remaining tissue into lateral dentinal remnants and cusp tips． 液を数回交換しながら超音波処理し，細胞成分を 除去した．このように処理した幼若な歯は液体窒 素で凍結し，−75℃に保存した． この試料を氷上で融解し，歯料用エキスカベー ターを使用し，（a）軟エナメル質（SE），（b）薄い硬エ ナメル質を含む象牙質層◎，と（c）硬エナメル質 （HF）と石灰化象牙質を含有する三層をそれぞ れ分離採取し，−75℃に保存した（図1）．各層の 剥離は形態学的に，またX線マイクロラジナグラ フで検索し，軟エナメル質試料中に象牙質の混入 がないことを確認している．表1に総タンパク質 量（％）／凍結試料湿重量，アパタイト量（％）／凍 結試料湿重量，アメロゲニン量，エナメリン量が ウシ胎児の発育月数と比較されている． 清水13）は生後約6ヶ月のブタの新鮮な下顎骨か ら前歯，臼歯の歯胚を取り出し，軟組織と歯髄を 除去後，図2に示す部位の石灰化の程度の異なる 4種類の幼若エナメル質を得ている．チーズ状の エナメル質の表層部はつくられて間もないエナメ ル質であり，ついでチーズ状エナメル質，チーズ 状とチョーク状の移行部のエナメル質，チョーク松本歯学 14（2）1988 141 表1 ウシ未萌出臼歯エナメル質のアメロtr’ニン（溶出1）とエナメリン（溶出2）が胎児（発育月数）に存在 する量lo） Fetal Tissue exalnined age ％Apatite ％Total rnineral／ protein／ tiSSUe tiSSUe frozen wet frozen wet weight weight Fraction of total matrix protein present as Amelogenin Enamelin months 2−4 Soft scrapings 5−6 Soft scrapings 7−8 Soft scraPings 5−6 Hardened cusp enamela 60−65 70−75 80−85 ∼90 10−12 8−10
4−6
1−2 ％total tlssue protem 65−70 85−90 65−70 ∼50 μ9／average molar cusp 105 400 325 60 ％total tissue proteln 30−35 10−15 30−35 ∼50 μ9／average molar cusp 45 65 105 60 ゜Extract 2 proteins from hardened cusp tips were composites of enamelins and dentin proteins． The proportions of enamelins in these preparations were estimated from amino acid analytical and electrophoretic／chromatographic data． 象牙質 エナメル質 試料番号｝一
｝一
図2：幼若エナメル質の試料採取部位13） 状のエナメル質と，石灰化の程度が増加すると報 告している．表2に含水量とタンパク質含量を示 した． 2．アメロゲニンとエナメリンの溶出法 エナメルタンパク質の可溶化条件は研究者によ りそれぞれ異なっている．大別すると，1）水， 塩化ナトリウム溶液可溶性5），中性可溶性として 0．05Mトリスー塩酸緩衝液（pH 7．4）14・15）， 0．02−0．05Mリン酸緩衝液（pH 7．5）13・16｝，4．O M塩酸グアジニンーO．05Mトリスー塩酸緩衝液 （pH 7．4）17｝などで可溶化するもの，2）EDTA を使用し中性で脱灰可溶化する方法5・1°・13∼15・17）や， アルカリ性で処理7）している場合，3）酢酸酸性で 脱灰可溶化する方法7・13∼15・17“’19）がある．Fincham 表2 ウシとブタの幼若エナメル質の含水量とタンパ ク含量．試料番号は図2参照13） 試料 ウシ ブタ 番号 水 タンパク 水 タンパク 38．2±2．129．7±1．8 R2．9±1．017．4±0．8 R5．6±0．4 9．3±1．0 Q8．6±0．8 1．8±0．6 37．1 29．6 @ 35．1 18．8 R6．0±0．88．3±1．25 Q6、3±1．11．1±0．43 湿性重量当たりの％ ら18）は酢酸（10％v／v）のみによる抽出を行なっ たがそのほかは2あるいは3種の可溶化方法を組 合せて使用した．また，タンパク質の加水分解を 阻害し，分解修飾を受けない生来のタンパク質を 分離するため，各種タンパク分解酵素やリン酸の 加水分解酵素の阻害剤を添加した0．5M EDTA （pH 8．3）で脱灰可溶化し，不溶性残渣をさらに， 0．05M重炭酸アンモニウムで溶出する方法2°）．さ らに，セシウムクロライド溶液（dニ1．9，25℃） あるいは，セシウムホルメート溶液（d＝2．3， 35℃）を使用し，密度の相違で分画後，溶出する 方法21｝がある． アメロゲニンとエナメリンを最初から分画溶出 する方法としてTermineら1°）は採取した軟エナ メル質5gの凍結材料に対し，1000 mlの溶媒 （4．OM塩酸グアニジン，0．05Mトリス，0．1M 6一アミノヘキサノイン酸，0．005Mベンザアミ ジンCl，0．001 Mフェニルメタンスルポニルフル オライド，pH 7．4）4℃で72時間一定速度で撹拝142 原田ニアメロゲニンとエナメリソの生化学 して溶出を行なった（溶出液1），その後3000回転 で遠心沈殿し，残渣は次の溶出に使用した．第2 の溶出は1回目と同様に行っているが，組成とし
てさらに0．5MEDTA−4Naで72時間，
4℃1000 mlで溶出した（溶出液2）．溶出液1はウルトラフィルトレーション
（AmiconPM−10フィルター）で濃縮後，透析 チューブ（Mr＝6000−8000cut off）を使用，4℃ で水に対して十分透析し，凍結乾燥した．溶出液 2も1同様に処理した．この方法で溶媒は塩酸グ アニジンであり，EDTA脱灰前後でアメロゲニン とエナメリンを分画したことになる． 3．エナメルタンパク質の分画精製法 アメロゲニンの精製はウシ永久切歯歯胚のチー ズ状エナメル質から行われた．0．5N酢酸で脱灰 溶出，透析後，凍結乾燥したタンパク質をSepha・ roseCL− 6 Bカラムクロマト，等速度電気泳動 法で精製し，SDS一ポリアクリルアミド電気泳動 的に均一な試料を得た23）． 一方，エナメリンについては未萌出ブタ下顎臼 歯の幼若エナメル質を剥離し，材料とした．10％ （v／v）酢酸で6日間，4℃で脱灰，透析処理 （12，000Da以下透析），さらに1％酢酸で透析 後，不溶性成分を除去した後，精製を行なった． Bio−Ge1−P 100クロマト操作（0．1Mギ酸）， polyanion調製用カラム（0．05 MトリスーHCI緩 衝液pH 7．4，7M一尿素を含有する）でクロマト を2回行ない，ポリアクリルアミド電気泳動的に 均一なバンド（銀染色）を得た17）． アメロゲニンとエナメリンの生化学的性質 1．構成アミノ酸と糖組成 エナメルタンパク質がケラチンやコラーゲンと 相違する特異なタンパク質であることはアミノ酸 組成の分析結果から証明されたが，エナメルタン パク質は不均一性を示し，エナメル質形成過程に おける相違，動物種による相違などにより分析値 は各研究者で必ずしも一致していない． Takagiら23）はウシ切歯歯胚からアメロゲニン を精製し，一次構造を明らかにした．構成アミノ 酸は170残基で分子量19，350であった．アミノ酸組 成を1，000残基に換算し表3に示した．この結果と 比較のため，ヒト18），ブタ16），ウシ1旬の分析結果を あげた．一方，エナメリンについての報告は少な く，一次構造はまだ決定されていない．アメロゲ ンニンと比較のため，Termineらの結果10｝と，・・ ムスターについての分析値2‘｝を記載した．一般に アメロゲニンはプロリン，グルタミン酸（グルタ ミンとして存在），ロイシン，ヒスチジンなどが多 く疎水性であるのに対し，エナメリンはプロリン， グルタミン酸，アスパラギン酸，グリシンが多く， シアル酸（3∼5％）を含有する糖タンパク質（糖 組成約15％）であることが受け入れられている． ただし，エナメリンについてはセリン，プロリン の値は報告によって相違がある． 2、分子量ならびに不均一性 ウシ幼若エナメル質から4M塩酸グァニジン で溶出されるタンパク質分画，アメロゲニン（第 1画分）を除いた後に0．5MEDTAを含有する同 一溶媒で溶出されるタンパク質分画（第2画分） の両者をSDS一ゲル電気泳動（7．5％トリス／グリ シン／尿素）し，泳動パターンを分子量マーカーと 比較すると，EDTA脱灰によって得られたタンパ ク質分画のパターンは未脱灰溶出タンパク質より 分子量が大きい位置に泳動されている．両者のア ミノ酸組成の分析結果，SDS一電気泳動パターン， アパタイトとの吸着実験，EDTA一脱灰で得られ るタンパク質の抗体との反応性などからTer・ mineら10）は前者をアメロゲニン，後者をエナメリ ンと同定した． アメロゲニン分画はSephacryl S−200でゲル炉 過を行ない，ウシ胎児の発育月数（2−4，5−6， 7−8ケ月）によるクnvトパターンを比較した 結果，主ピークは∼25，000，15，000，9，500，7，500， 6，000などあり，しかも月数が進むにつれ，高分子 量のピークは低分子量のピークへ置換する様子が クロマト上で見られた．一方，エナメリン分画は Fergusonプロット（ゲル濃度T％に対するlog Rf値）や， Sephacryl S−200のクPtマトパターン から一一72，000，56，000，42，000の高分子量のもの と8，000−−30，000の低分子量のものを同定した．発 育にともなう分子量の低下はエナメリンでも観察 された1°｝． ウシアメロゲニンの分子量については，先にア ミノ酸組成のところで述べたように，19，350と報 告23）されたが，ブタのアメロゲニンについても 26，000と21，000の2種が同定され，前者から後者 への変化がC一末端側の切断で生じたことが証明松本歯学 14（2｝1988 された16）．また，ヒトのアメロゲニンに関する報告 では主ピークとして25，000∼23，000の分子量のタ ンパク質を同定ls｝している． エナメリンの分子量はヒトの材料18）で70，000， ブタの材料16）で67，000と63，000をそれぞれゲル戸 過法によるクロマト上で同定している．ブタから 精製したエナメリンは50mM酢酸緩衝液， pH 6．0，37℃で48−72時間処理し，60℃に加熱反応停 止後，ポリアクリルアミドスラブゲルで電気泳動 すると，63，000のパンドが完全に消失しているこ とがわかった．これは加水分解酵素がエナメル質 からの溶出操作の段階で除去されていないか，エ ナメルタソパク質が自己消化能を示すと考えられ る．分子量63，000のエナメリンは分解され易く， アパタイトを反応系に添加しても分解は抑制不可 143 能であった．一方，分子量67，000のエナメリンは 分解に対し抵抗性を示すことは成熟エナメル質中 にエナメリンが残存することと関連すると述べて いる．さらに，アメロゲニンは分解され安くエナ メリンは抵抗性を示す報告25｝がある． このように，アメロゲニンやエナメリンが不均 一性を示すのは加水分解が生じるためで，加水分 解酵素の部分精製と性質13），タンパク分解酵素の 組織化学的検索26｝が行われている．強い反応がエ ナメル基質とエナメル象牙境に沿う象牙質の幅狭 い層に観察されている． 3．一次構造と二次構造
アメロゲニンの一次構造に関する報告は
Fukaeら16）によりN一末端より54残基が決定さ れ，次いでウシ，ブタ，アメロゲニンについて， 表3 エナメルタンパク質のアミノ酸、糖質組成 アメロゲニン エナメリン ウシ＊ ウシ ヒト 19，350 19，350 25，000 分子量 ブタ ウシ 25，000∼ 21，000∼ 26，100 28，000 ウシ 42，000∼ 72，000 ハムスター ブタ 160，000∼ 67，000 200，000 アスパラギン酸 アスパラギン スレオニン セリン グルタミソ酸 グルタミン プロリン グリシン アラニン シスァィン バリン メチオニン イソロイシン ロイシソ チロシン フェニルアラニン リシソ ヒスチジン アルギニン トリブトファン リン酸 シアル酸 ガラクトサミン グルコサミン 総糖質含量（アンスロン法） 1 3 3 5 0 31 49 6 4 0 8 8 8 18 6 3 1 12 1 3 ｝23・・ ；；：1 ｝23｝35・・ 34 32 38．3 41．6 ｝182・・｝・67｝・75・・ 288．2 35．3 23．5 0 47．1 47．1 47．1 105．9 35．3 17．6 5．9 70．6 5．9 17．6 298 42 18 46 48 35 85 45 14 9 91 11 237．8 40．3 28．3 32．3 60．9 36．4 96．5 34．7 16．0 26．3 87．3 11．5 ｝35 ㌶ ｝235 311 41 41 34 1106
187
764
tr O．90 0．17 0．14 8．2 ｝・・5 ； ｝・5・ 1豆 56 33 21 23 32 55 32 25 36 0．22 4．71 1．08 3．24 15．2｝73｝99
40 198 54 55 ｝・57｝・77 36 211 94 33 6 20 32 15 15 23 37 11 83 75 87 tr 17 tr 35 95 7 57 85 32 42 文献番号 23） 18） 16） 10） アミノ酸組成：残基数／1，000残基，但し＊印は残基数／1分子Mr＝19，350 その他の組成：パーセント／タンパク重量 tr：徴量存在，一：測定値なし 10） 24） 17）144 原田：アメロゲニンとエナメリンの生化学 アミノ末端からの分析が行われた結果，動物種や 分子の大きさにかかわりなく，アミノ末端から27 残基のアミノ酸配列は共通性が認められた22）． 完全な一次構造の決定はTakagiら23）により報 告された．ウシ幼若切歯エナメル質の精製アメロ ゲニンをクロストリパン，キモトリプシン，トリ プシン，カルボキシペプチターゼYによる酵素処 理と，CNBrによる限定分解を組合せてペプチド を分離精製後，Edman法でアミノ酸配列を決定し た（図3）．この構造は今日までに報告された分泌 タンパク質と相同性はなく，全く新しいもので あった． アメロゲニンの二次構造については固体と溶液 状態でそれぞれ，crossβ一構造，β一構造を示す Boviロe Comp−8 P19−G Hu皿an’工 Human’J Pig 1 5 10 15 20 25 Me．t−Pro−Leu−Pτo−Pτo−H工s−Pro−Gly−His−Pro−G］．y−Tyr−11e−Asn−Phe−Seξ一TyエーGln−Va1−Leu−Thr−Pro−Leu−Ly8−Trp− ｝！et−Pro−Leu−Pro−Pro−His−Pτo−Gly−His−Pエo−Gly−Tyτ一工1e−A3n−Phe−Ser−TyτrGlu−Va1−Leu−ThピーPro−Leu‥Lys’Tτp− Met−P「°’Leu−P「°−P・。’Hエ・−P・。−Gly’泣・−P・。’Gly・Ty・−Ue−dS・−Phe−S…Ty・−G1・−V・1−L・u−Tbr−？r。−beu−Lys−T・p− Met−Pro→Leu−？ro−Pro一且i6−？ro−GlyrHis−Pro−Gly−fyr一ユユe−AsnrPhe−Se；−Tyr−Glu−Va1−Leu−Thτ一Pro−Leu−Lys−Trp− Met−Pro−Leu−Pてo−Pro−Xaa●Pro−Gly−Hi8−Pro−Gly−Tyτ一11e−Asn−Phe−Ser−Tyr−Glu−−Val−1．eU−・Thr−Pro−Leu−Lys−・Trp− Met二P「°−L・・−St。−P・。−His−P・。−Gly−Ht・−P・。−Gly−−Tyr−11e弔P−Phe−S・・−Ty・−G1・−V・1−Leu−Thr−P・。−L・u−Ly8−Xaa一 BOVlne Comp●8 P工9−G Human−1 1imnan’J Pig 26 ． 30 35 40 45 50 Tyr−Gln←Ser−Met−11e−Arg−Hi8−Pro−Tyr−Pro−Ser−Tyr−Gly−Tyr−Gln−Pro．一）fet←Gly−Gly−Trp−Leu−His−His−Gln−11e− Tyr−Gln’S・・一｝tet−11e−A’9−Hs−P・。−TyT−S・・−P・・−Tyr−Gly−ty・−Glu−P・。−M・t−Gly−Gly−TrP−L・u−T・p−Cln−91n−11・− Tyr−Gln−・Asn−Met−11e−Arg−His−Pro−Tyr−・Xaa−Xaa−Tyr−Gly−Tyr−Glu’Pro− Tyr−Gln−Seエー11e−Xaa−Pro−Pro−Tアr−・… Tyτ一G1臼一Ser−11e←Met−… ◆ Tyr−Glu−Asp→fet−11e−Xaa−Hi8−Prg−Ty；−Mlr−Ser−Tyr−Gly−Thr−Glu−Pro−Met−Gly−Gly−Xaa−Leu−His−His−Glu一工1e一 欧》vine Comp−8 Pig 51 55 60 65 70 75 11e−？ro−Val−Val−Ser G；n−Gln−Thr−Pro−Gln−Asp−His−Ala−Leu−Gln−Pro−Pro−His−His一工1e−Pro−Met：−Va1−Pro−Ala− 11e−Pro−Va1−・．．． 11e−Pピo−Va1−Va1−．．．． Bovlne 76． 80 85 90 95 100 Gln’Gln−P・。−Va1−V・1−P・。−G1ぬ一Gla−P・。−M・t−）f・g−P・。−V・1−Pエ。−Gly−Gln一磁s−Gln−P・。−Asn−L・・−P・。rL・u−P・。−af・一 Bovtne 101 105 110 115 120 125 Gln●Thr−Pro−Phe−Gln−Pro−Gln−Ser’Ile；Gln⇒Pro−Gln−Pro−H ts−Gln−Pro−Leu−Gln−Pro−His−Gln−Pro−・Leu−61n’？ro一 Bovine 126 130 135 140 145 150 Met−Gln−Pro−Leu−Gln−Pエo−Leu−Gla−Pro−−Lgu−Glp−Pro−Leu−His−Pro−Pro−GlローPro−11e−Val−Gln−Pro−11e−Pro−Phe一 Bovine 151 155 160 165 170 Pro−Pro−1￡u−P：o−Pオ〇−Gln−P士o「1途u−Pro−Pエo−Met−1途u−Pro−Asn−Leu−Pro−Leu−Gln−Ala−Trp 図3： Bovine Comp−8 Pig−G Human I Human J Pig 各種動物アメロゲニンの一次構 ：ウシ， ：ウシ， ：フタ， ：ヒト， ：ヒト， サ ：フタ， 造 アメロゲニンー次構造， の比較 53残基のアミノ末端部分構造， 41残基のアミノ酸配列 33残基のアミノ酸配列 30残基のアミノ酸配列 54残基のアミノ末端部分構造， 分子量19，350，Ser（16）はリン酸化23｝ 分子量27，00022） 分子量5，00022） 分子量5，00022） 分子量5，00022） 分子量26，100i6｝ アミノ末端より27残基は動物間で均一性がある．
松本歯学 14（2）1988 ことが報告27）されたが，さらに一次構造の結果を
取り入れた報告が提出された．すなわち，
Renugopalakrishnan28）らは円偏光二色性（CD）と フーリェ変換赤外分光分析法（FT−IR）を応用 し，すでに述べたStrawichらの方法2°｝で調製し た精製ウシアメロゲニンについて分析した．CD スペクトルの解析はpH 7．2と1．6で測定し，負の 極大（208nm），正の極大（196 nm）における分子 楕円率θ（deg・cm2・dmol−1）をChangら29）の提 出した数式に準じてコンピューター処理し，二次 構造を求めた．結果はpH7．2ではα一ヘリックス 16％，β一シート30％，β一ターン21％，ランダム 33％であるのに対し，pH1．6では正の極大は得ら れず，負の極大（203nm）のみが測定され，θ（deg・ cm2・dmolri）値より，α一ヘリックス0％，β 一シート58％，β一ターン3．5％，ランダム38．5％ であった．Ca2＋の反応液への添加を同様に測定し た結果，4μMでは二次構造に変化は起っていな いが，8，16μMの添加で変化が生じ，16μMの Ca2＋が存在するとα一ヘリックス6．5％，β一ター ン8．5％，ランダム24％と低下するのに対し，β 一シートが61％と増加した． FT−IR測定はアメロゲニン水溶液， pH1．8と 2．25（KCI−HCI緩衝液）4．8（酢酸緩衝液）と 5．86（ピペリジン緩衝液），8．17（NH4HCO3緩衝 液）と9．23（トリス緩衝液）で，それぞれ，アミ ド1振動，アミドII振動，アミドIII振動の変動が測 定された．pH5．86におけるアミド1振動は1667 cm−1と1632 cm−1に，アミドII振動は1580 cm−1， 1551 cm−i，1524 cm−tに，アミドmの振動は1281 CM−1と1250 cm−1にそれぞれ吸収帯を示した．こ のようにして得られた測定値をそれぞれ二次構造 の反復β一ターン，β一シート構造，β一ターン構 造に帰属させ，さらに一次構造を考慮し，定性的 な試案として，ウシアメロゲニンの二次構造を提 出した．（図4）さらに同じ研究グループがラマン 散乱分析による二次構造の分析について報告3°〉し ている．しかし，・エナメリソに関してまだ報告は ない． 4．アメロゲニンとエナメリンの抗体産生と抗原 決定基 溶解度，アミノ酸組成，分子量など化学的性質 の相違によりアメロゲニンとエナメリソは性質の 異なるタソパク質であることは理解できるが，同 145 じエナメル芽細胞が二種のタンパク質を生合成す るのか，一種のタンパク質が生合成され，細胞か ら分泌された後の修飾によって，性質に相違が現 われるのか疑問である．この点を解決する方法の 一つとして，極めて特異性の高い抗原一抗体反応 を利用する免疫化学的な方法がある． エナメルタンパク質のポリクロナール抗体作成 は各種動物で1971年頃から進められてきたが，モ ノクロナール抗体の作成はChristnerら31）により はじめて報告された．3−6ケ月のウシ胎児のエ ナメルタンパク質を採取し，keyhole limpet haemocyaninと結合させた後， Balb／c（♀）6週 マウスに免疫し，血清中の抗体産生をELISA法 で検索すると共に，膵臓細胞をMyeloma cell line Sp 2／0−Ag14と5：1の割合で混合，50％ポリエ チレングリコール中で細胞融合させた．細胞は 92一ウエルの組織培養プレートで培養し，クロー ンの抗体産生をELISAで検出した結果，エナメ ルタンパク質に対する二種のモノクロナル抗体の 産生が証明された．ウシ胎児臼歯切片をモノクロ ナル抗体で処理し，間接酵素抗体法によって染色 すると，エナメル基質層が強染され，その他，エ ナメル芽細胞に含有される穎粒が陽性を示す以 外，エナメル器中間層，星状綱には反応はまった く陰性であった．この抗体作成法を応用し，アメ ロゲニンとエナメリンにそれぞれ特異なモノクロ ナル抗体の作成に成功した32）．アメロゲニンを認 識するモノクロナール抗体は6種生成されたが拮 抗法にもとずくELISA検索で，この6種の抗体は 3種にグループ分けが可能であり，アメロゲニン の抗原決定基の相互関係のモデルを示した．また， アメロゲニンをSDSスラブ電気泳動後，イムノプ ロット法で染色すると，分子量16，000，24，000， 28，000，30，000の染色バンド以外ec4S，OOO，60，000 の位置に染色パンドが検出され，分子量の大きい アメロゲニンの存在が示唆された．一方，エナメ リンに対する抗体産生クローンは一種であっ た33）．産生抗体はエナメリンにのみ特異的に反応 し，組織化学的検索の結果もエナメル質にのみ特 異的な反応を示した．以上の結果はアメロゲニン とエナメリンは共通の抗原決定基を保有しないわ けで，それぞれ異なる性質のタンパク質であるこ とが示唆された． ヒトのエナメリン（分子量70，000）に対するポ146 原田：アメロゲニンとエナメリンの生化学 Pro ＼ Pro 5∼His ノly＼。、、／P「ぺ Met1∼Pro∼Leu∼Pro G】y ／ Try∼Ile pi°『Gl”” “’ TY「X Gly／Tyk・，，．，，。，，．．T，，一，，。一．H、！「〈＼G1＼／ Met−Gly ＼ Gly Leu His IleSO 一・ lle
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Met∼Leu Asn ／ LeUl65 ＼ Trp170∼Ala∼Gln Pro ＼／ Leu 図4：RenugopalakrishnanらVこよって提出されたアメロゲニンの推定二次構造29｝ Predicted secondary structure of dephosphorylated bovine amelogenin from the primary structure reported by Takagi et aL（1984）， using the Chou・Fasman algorithm．（＜＜＜），（［）， and（∼・∼）representβ・sheet，β’tum， and‘‘unordered”structures． Ser（P）occurs at position 16．Polyproline−type structures occuning in Pro・Pro segmants are shown boxed in boldface． Atrans−trans confomlation for pepitide bonds was tacitly assumed in the predicted secon・ dary structure．松本歯学 14（2）1988 リクロナール抗体をはじめて作成し，エナメルタ ンパク質の免疫化学的性質を検索した報告19）では アメロゲニンに相当する分子量28，000，24，000， 20，000のタソパク質とも弱いが交差反応性を示す ため，両者が共通抗原決定基を保持しているもの と推論している．また，マウスアメロゲニンの抗 体はヒトのアメロゲニソとは交差性を示すが，エ ナメリンとは交差性を持たないことをスラブゲル 電気泳動一Western・blot法で示した． 抗原決定基の問題はLauら34）の報告がある．す でにマウスアメロゲニンのcDNAのクローニン グとDNAの塩基配列を報告35）したが，アメロゲ ニン遺伝子のcDNAライブラリーをポリクロナ ル抗体，あるいは核酸プローブでスクリーニング した後，cDNAによって発現された抗原決定基に 特異的な検体のサブセットをポリクローン抗アメ ロゲニン抗体から，クロナールエピトープ選択法 で同定した．この結果アメロゲニンのC一末端から アミノ酸残基79をコードするクローン中に抗原決 定基を同定した． 5．アメロゲニンの定量法 抗ウシアメロゲニンーウサギ抗体とアルカリホ スファターゼを標識した抗ウサギIgGヒツジ抗 体を使用したELISA法で5 −500 ”gアメロゲニ ンの定量法を確立した36）． エナメルタンパク質の生合成と遺伝子解析 1．エナメルタンパク質の生合成と分泌 器官培養系，あるいはin vivOにおける動物実 験系で，放射性同位元素を使用し，アメロゲニン， エナメリンへの取り込み実験により，エナメルタ ンパク質の経時的な変動についての報告3ηがあ る．生後3日のゴールデンハムスターの臼歯歯胚 培養系で〔35S〕一メチオニンをトレーサーとして パルスーチェイス実験し，放射活性のとり込みを 光顕的にオートラジオグラフィーや，抽出後のタ ンパク質画分をSDS／尿素を含むボリアクリル アミドゲル電気泳動し，そのフルオログラフから タンパク質の動態を観察した結果，各15，60，90， 360分のパルス後30分チェースした時，アメロゲニ ンは60分で細胞外基質分画に存在しているのに対 し，エナメリンは殆んどエナメル芽細胞を含むエ ナメル器に存在した．6時間の場合アメロゲニン 分子は低分子化するが，エナメリン分画の比活性 147 はさらに高くなっている。 StrawichとGlimcher38）はラットを使用し， 〔3H〕一セリンと〔3H〕一プロリソのエナメル器 細胞と細胞外基質へのとり込みの経時的変化を NH4 HCO3可溶タンパク画分の電気泳動によって 検索した結果，分子量25，000のタンパク質が最初 に細胞外に分泌されることを報告した．Shimok− awaとSasaki39）も同様の特告を行なっている．ま たBronckersとW61tgene40）は・・ムスター臼歯歯 胚の培養系で，〔3H〕一チミジンによる細胞増殖， 〔3H〕一プロリンによる基質タンパク質の生合 成，45Caと32PO4による石灰化と弗素イオン（F｝） 濃度との関連性を細胞レベルにおいても検索し た．F一濃度が1．31 mM以上では細胞増殖，アメロ ゲニンの生合成は抑制されている．F一が低濃度で ある52μMで45Caや32PO4のとり込みは増加して おり，アメロゲニンの生合成はPの無添加の場合 と同様に行なわれているが，低濃度ではタソパク 質の分泌を妨害している可能性を示唆した． 2．cDNAのクローニングと塩基配列の決定 Sneadら41）は生後2日のマウス（Swiss−Web・ ster）のエナメル器からmRNAを抽出し，無細胞 系における＝．ナメリン（Mr：62，000）とアメロゲ ニン（Mr：28，000，26，000，22，000）の合成をゲ ル電気泳動（NaDod SO4／ポリアクリルアミド） 上，〔32S〕一メチオニンの放射活性に基づくフルオ ログラフィーとマウスアメロゲニンのポリクロ ナール抗体で同定した．そこで，ポリω＋−RNA を鋳型とし逆転写酵素によりcDNAを合成，プラ スミドベクターpBR322のPst Iサイトに挿入し た．転換体は〔32P〕cDNAプローブでスクリーニ ングした．アメロゲニンDNAの塩基配列陽性の コロニーは13％であった．プラスミドからハイブ リッド選択によって得たRNAは無細胞系で翻訳 し，さらにマウスアメロゲニンのポリクロナール 抗体で確認しpMa5／5クローンがアメロゲニン mRNAを選択していることを確認した．またこ のpMa5／5をニックトランスレーショソし， Sur・ them blot法によりマウスとヒトの染色体DNA 中にアメロゲニンDNAの存在を決定した．つい
で，pMa5／5のDNA塩基配列を決定するため1
本鎖DNAファージーM13vc cDNAを組み込み， 大腸菌に感染させ，大量の1本鎖DNAを調製し た．配列決定はSangerのジデオキシ法でおこ148 原田：アメロゲニンとエナメリンの生化学 なったgs）．決定されたアメロゲニンcDNAクロー ンrpMa5／5の塩基配列は図5に示した． 塩基配列は停止コドンを有し，3’末端側は完全 であつたが，5’末端側に81塩基が欠如しているこ とが，アミノ末端アミノ酸配列の分析から明らか にされているため，完全なマウスアメロゲニンの 構成アミノ酸は180残基で，分子量は23，532Daと 算出された． Shimokawaら42）は18ケ月の子牛（雄）の未萌出 切歯の精製アメロゲニンとエナメル芽細胞層の組 織から抽出したRNAを用い，分子量が約27，000 のアメロゲニンのアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を決定した．発現ベクターとし てλgt11を使用し，3，500個の組換えλgt 11 ファージーからアメロゲニンを合成しているプ
ラークを20種得た．このうち2種のクローン
λAm16とλAm11のcDNAをEcoRIで切断し
M13mp19に， PstlあるいはHind HIで処理して M13mp18の適当なクP一ニング部位に組み込ん だ．JM101細胞をこれらで形質転換し，1本鎖 DNAを17 bpのプライマーとアニーリングし， Sangerらのジデナキシ法によりアメロゲニンの CTG CAG GGG GGG GGG GGG GGC CAG AGC ATG ATA AGG CAG CCG TAT GLN SER MET ILE ARG GLN PRO TYR CCT TCC TAT GGT TAC GAA CCC ATG GGT GGA TGG CTG CAC CAC CAA PRO SER TYR GLY TYR GLU PRO MET GLY GLY TRP LEU H工S HIS GLN ATC ATC CCT GTG CTG TCT CAA CAG CAT CCC CCG AGT CAC ACC CTT IIE工LE PRO VAL LEV SER GLN GLN HIS PRO PRO SER HIS THR LEU CAG CCT CAT CAC CAC CTT CCC GTG GTG CCA GCT CAA CAG CCC GTG GLN PRO HIS HIS H工5 LEU PRO VAL VAL PRO ALA GLN GLN PRO VAL GCC GCC CAG CAA CCA ATG ATG CCA GTT CCT GGC CAC CAC TCC ATG ALA PRO GLN GLN PRO MET MET PRO VAL PRO GLY HIS HIS SER MET ACT CCA ACC CAA CAC CAT CAG CCA AAC ATC CCT CCA TCC GCC CAG THR PRO THR GI．N HIS HlS GLN PRO ASN ILE PRO PRO SER ALA GLN CAG CCC TTC CAG CAG CCC TTC CAG CCC CAG GCC ATT CCA CCC CAG GLN PRO PHE GLN GLN PRO PHE GLN PRO GLN ALA 工LE PRO PRO GLN TCT CAT CAG CCC ATG CAG CCC CAG TCA CCT CTG CAT CCC ATG CAG SER HIS GLN PRO MET GLN PRO GLN SER PRO LEU HIS PRO MET GLN CCC CTG GCA CCA CAG CCA CCT CTG CCT CCA CTG TTC TCC ATG CAG PRO LEU ALA PRO GLN PRO PRO LEU PRO PRO LEU PHE SER MET GI．N CCC CTG TCC CCC ATT CTT CCT GAG CTG CCT CTG GAA GCT TGG CCA PRO LEU SER PRO ILE LEU PRO GLU LEU PRO LEU GLU ALA TRP PRO GCG ACA GAC AAG ACC AAG CGG GAA GAA GTG GAT TAA ALA THR ASP LYS THR LYS ARG GLU GLU VAL ASP stop AAAATTCAGAAAATGAGAGAACCGAAGTGGATACTTTGGTTGTTTTTAGGAATAACTCAA CACAATGATTTGTGCCTA（］AATCACTTAGTAAATTCTGTAACTAAAAATAAGTATCATTA GCAGATAATAAAATGTTTCAAAAATCAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCTGCA （adenylati。n signa1）（P。1y−d（A）tai1） 図5：Sneadらにより決定されたマウスアメロゲニンcDNA（clone pMa5−5）のヌクレオチド配列と 154残基のアミノ酸解列41）：5’末端側をコードしている81塩基が欠けているため26残基のアミノ 酸が記録されていない．松本歯学 アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を決 定した． 最も長いλArn16クローンは700 bpで，アミノ 末端から32番目までのアミノ酸をコードする塩基 が欠如している以外は停止コドンまで完全な配列 であった．しかしすでに報告23）されているアミノ 酸配列（170残基）と比較し8残基，クラスターと して139−163残基について矛盾点，C一末端側に 12残基の付加があった．また，λAm16と・・イプリ 14（2） 1988 149 ダイズするエナメル芽細胞のmRNAは少なくと も4種のアメロゲニンをコードしていることがタ ンパク合成系のゲル電気泳動とアメロゲニンの抗 体染色によって同定された．アメロゲニンが不均 一性を示す理由としてmRNAのフ’ロセツシング が相違する可能性を示した．さらに下川43）は同様 な方法により216個のアミノ酸からなる分子量 24，500のウシアメロゲニンをコードするcDNA の塩配列を決定し（図6），生合成，分泌，結晶形 CGGGAAACTCACTGAAACGTGTGTTCAAAGGGCT −19 −10 −1 ATG CCG AAA TGG GGA CCT TGG ATT TTG TTT GCC TGC CTC CTG GGA GCA GCC TTC TCT Met Pro Lya Trp Gly Pro Trp Ile Leu Phe Ala Cys Leu Leu Gly Ala Ala Phe Ser 。，e CCT CTA CCA CCT ，A， CCT GG、 CAC CCT 、b十 ，A， ATC．AA， TTC AGC ，A， 。A・ GTG ・18 M・tP・・L・・P・・P・・H’・P・・Gly H’・P・・Gly Tyピ11e・Asn Phe xe「Ty「．Glu Va1 Leu 。きb CCT CTG AAG TGG ，A， ，A、 A、、 ATG A，A Aき1、AC CCG TAC CCT TCC TAT GGT TAC G銀 ［rhr Pro Leu Lys Trp Tyr Gln Ser Met 工1e Arg His Pro Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Glu 、6とATG GGT GGA TGG cTG cAc cAc c品ATc温ccc GTG GTG Tcc cAG，A、 A，c ccc c98 P・。M・t Gly Gly．T・p L・・HiS肚・G1・エ1・11・P・。 V・1 V・1 S・・Gln G1・Th・P・°Gln ぷ，AC GCC CTG、AG CCT CA， CAC，A， ATC ，乙’C ATG GTG CCA GCT ，A、 ，A、 CCC G・G G88 ASn Hi8 Ala Leu Gln Pro His His His 工1e Pro Met Val Pro Ala Gln Gln Pro Val Va1 81 91 100 CCC CAG CAA CCA ATG ATG CCA GTT CCT GGC CAA CAC TCC ATG ACT CCA ACC CAA CAC CAC Pro Gln Gln Pro Met Met Pro Val Pro Gly Gln His Ser Met Thr Pro Thr Gln His His 101 111 120 CAG CCA AAC CTC CCT CTG CCC GCC CAG CAG CCC TTC CAG CCC CAG TCC ATC CAG CCG CAG GIn Pro ASn Leu Pro Leu Pro Ala Gln Gln Pro Phe Gln Pro Gln Ser 工1e Gln Pro Gln 131 140121 CCT CAC CAG CCC CTG CAG CCT CAC CAG CCC CTG CAG CCC CTG CAG CCC ATG CAG CCC TTG Pro His Gln Pro Leu Gln Pro His Gln Pro Leu Gln Pro Leu Gln Pro Met Gln Pro Leu 151 160141 CAG CCC CTG CAG CCC CTG CAG CCC CAG CCA CCT GTG CAC CCC ATC CAG CCC TTG CCG CCA Gln Pro Leu Gln Pro Leu Gln Pピo Gln Pro Pro Val His Pro Ile Gln Pro Leu Pro Pro 161 171 180 CAG CCA CCT CTG CCT CCG ATA TTC CCC ATG CAG CCT CTG CCC CCC ATG CTT CCT GAC CTG Gln Pro Pro Leu Pro Pro Ile Phe PrO Met Gln Pro Leu Pro PrO Met Leu Pro Asp Leu 6器CTG蹴GCT TGG CCA GCA A，A、A， M、搬熱G CGG GAG G熱GTG GA・TAA・AAGATCA Pro Leu Gln Ala Trp Pro Ala Thr Asp Lys Thr Lys Aオg Glu Glu Val Asp stop GAAAATGAGAAGAGACCTG工TACTTGGCAGTTGCTTTCAGAAAGACACAAGAACACAAAGATTTTTTCCTACCA C（込CCTTACTTAGTAAATTCTGTAACTAAAAATAAGCAAACAATAAAAATAAGCAAA（甑AACCGTTTAAAAATA CAAAAAAAAAAAAAAA 図6 ウシアメロゲニンcDNAの塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列43｝：番者は分泌された アメロゲニンのN末端を1とし，シグナルベプチドにはマイナス符号をつけて表した． ＊および＃印はそれぞれN−linked，0−linked glycosylationの可能性のある場所を示した．また， ＃印のセリソはリソ酸化されている可能性もある．オーバーラインで示したAATAAAの配列は ポリAシグナルである．
150 原田： 成への役割りなどについて意見を述べ，アメロゲ ニン研究の将来への展望を行なった． アメロゲニンとエナメリソの生化学 エナメル質の石灰化とエナメルタンパク質の作用 エナメルタンパク質がエナメル質結晶の核形成 や，成長と如何にかかわりあっているかは興味深 い問題である．エナメル結晶の形成にアメロゲニ ンとエナメリンという2種類のタンパク質が存在 しなければならない必然性が説明されなければな らない． ブタアメPゲニンのヒドロキシアパタイトへの 吸着の状態と結晶核成長への影響が研究された結 果44），エナメル芽細胞から分泌されたアメロゲニ ン（25K）と高分子組成（60−90 K）はヒドロキ シアパタイトへの強い親和性を示し，超飽和溶液 （Ca2＋）5（OH−）（PO，）3＝7．45×101°で結晶核の成 長を阻害していることがわかった．ところが，部 分分解された20Kのアメロゲニンはヒドロキシ アパタイトへの吸着性は低下し，結果として成長 阻害効果もなかった．吸着のpHは6．0とZ4であ ・．6．6x tin貫 0 50 ｝OO 200 400りm eNAME」 OEPTH °“rh・ath”・・ticeabl・and in・1・d・d in m・a・ur・m・ntS・f・ry・t・llites・up・t・a・thi・㎞・ss・f 19・r・20・1。ttice・pl。nes． This“・h・ath”iS n・1。・g・…tice・bl・in・th・m・ture・en・m・1・ry・t・llit・presenting・32・1・ttice・pl・nes． t，・thi，㎞，ss； ω，Width． 図7：ヒト幼若エナメル質における結晶の成長：写真と型，サイズの変化の模式図‘n ①トームス突起よりおよそ25μmの位置の結晶（平均サイズ）31A（厚さ）×290A（幅） ②トームス突起よりおよそ200μmの位置の結晶（平均サイズ）105A（厚さ）×580A（幅） ③萌出歯の完成したエナメル質の結晶（平均サイズ）261A（厚さ）×683A（幅）
松本歯学 14（2）1988 りpH7．8あるいは10．8ではおこらなかった．分泌 されたアメロゲニン（25K）によりエナメル質形 成が調節されていることを示唆した．一方，アメ ロゲニンとエナメリンを使用し，核形成実験と結 晶成長実験についての報告がある45−46｝．核の形 成，すなわち非晶性リン酸カルシウム（ACP）の 形成に対して約3時間は安定な準安定濃度の溶液 （総カルシウム1．3mM，総リン酸1．OmM）にア メロゲニン（分子量27，000）を0．6μM存在させる と溶液は約5時間安定となり，対照にくらべ非晶 性リン酸カルシウムの生成を遅延する．エナメリ ンが0．6μM存在する場合の結果は，アメロゲニ ンが2．5μM存在する場合に類似しており，ACP の生成を約4倍強く阻害する．結晶の成長につい てはアメロゲニン（分子量27，000）がμM濃度存 在すると対照にくらべ，結晶成長が抑制されてい る．エナメリンはさらに抑制効果が強かった． ヒト胎児歯胚の幼若エナメル質をトームスの突 起からそれぞれ25，250，500μmの部位における 結晶成長を電子顕微鏡で観察した研究47）では，結 晶形成初期の針状が六方晶プリズムに成長する過 程（図7）で，単位面積（μm2）当りの結晶数は1240 から558に減少する．結晶成長につれ格子面数は増 加する．さらに結晶の両側にそれぞれ3．3Aの厚 さの“鞘”を観察しているが，結晶中の成長が停 止した段階では’鞘”は確認できなくなる．この 点に関し，DaculsiとKerebelは結晶表面で低分 子化し分散した人工産物のタンパク質に基づく可 能性を述べている．この像がアメロゲニンに基づ くと説明可能ならぽ結晶形成を調節し，結晶完成 後にアメロゲニンは消失する実験結果と一致する と考えられる． 一方エナメリンは機械的な衝突や結晶の配列の 乱れなどをより少なくする緩衝剤あるいは接着剤 として，最少必要量が結晶間に残存したと考える． おわりに エナメル質を形成する分泌機能をもつたエナメ ル芽細胞は，内エナメル上皮細胞から分化する． アメロゲニンとエナメリンという特異的なタンパ ク質はこの細胞が生合成し，エナメル基質の形成 のために分泌される．幼若エナメル質には20％も のタンパク質が存在するが，石灰化が終了した萌 出歯では1％以下のタンパク質が残存するに過ぎ 151 ない．エナメルタンパク質はこの過程で結晶の成 長を調整しているのであろう． アメロゲニンはアミノ酸が170残基，あるいは 180残基配列した分子量約20，000で，プロリン（約 30％），グルタミン，ロイシン，ヒスチジン含量が 高い．エナメリンは分子量がアメロゲニンより高 く，アミノ酸組成も相違し，免疫交差反応性から もアメロゲニンと異なるタンパク質と考えられ る．プロリン含量の高いタンパク質の例として， コラーゲンがあげられるが，コラーゲンが特異的 な三重ヘリックス構造であるのに対し，アメロゲ ニンはプロリソ残基によるβ一シート，β一ターン 構造を約50％含む，特異的な二次構造を示すタン パク質である． 唾液中の高プロリン含有タンパク質などと共に ホルモンやペプチド中におけるプロリン残基の存 在意義は興味深く，エナメルタンパク質もこの範 ちゅうにはいる．筆者48）はプロリンを認識し，ペプ チドやタンパク質を加水分解する酵素に関心を持 ち研究を行なっている． 原稿の整理は武井さんにお願いした．感謝の意を表しま す． 文 献 1）Deakins， M．（1942）Changes in the ash， water， and organic content of pig enamel during ca1・ cification． J． Dent． Res．21：429−435． 2）Piez， K． A．（1960）The nature of the protein matrix of human enamel． J． Dent． Res．39：712． 3）Piez， K． A．（1961）Amino acid composition of some calcified protein． Science，134：841−842． 4）Glimcher， M． J．， Mechanic， G．， Bonar， L． C． and Daniel， E． J．（1961）The amino acid composition of the organic matrix of decalcified fetal bovine dental enamel． J． BioL Chem．236：3210 −3213． 5）Eastoe， J． E．（1963）The amino acid composition of proteins from the oral tissue−II The matrix proteins in dentine and enamel from developing human deciduous teeth． Arch． Oral Biol．8：633 −652． 6）Eastoe， J． E．（1965）The chemical composition of bone and teeth． Advan． Fluorine Res． Dent． Caries Prevent．3：5−17． 7）Eggert， F． M．， Allen， G． A． and Burgess， R． C． （1973）Purification and partial characterization of proteins from developing bovine dental enamel． Biochem． J．131：471−484．
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