性格 関 す 研究 ト肝細胞 痛 精 製

ヒト肝 細胞痛^か ら^の y ⁻G T P の精製と そ ^の性格^に関す^る研究

一 腎 y⁻G T P との比較 ^一

金沢 大学 医 学部 内科 学 第一−^一講 座 く主任^こ服 部 信教 授I

登 谷 大 修

く昭和6 2年⁴ 月^{1 1}日受 付1

肝細 胞 癌 患 者血清に特 異 的に出現す る y⁻gluta myltr a n spep tida s e is o e n zym e く^{n o v e}l _y⁻G T Pl の 性 格を解明 す る ^一端と し て， 各 種 分 画法を 用^いて^ヒト肝 細 胞 癌組 織よ りy⁻G T P を精製し， その物理化 学 的， 免 疫学 的な性 格を同 様な方法^で精製し た 正常 腎y⁻G T P と 比較 検 討し た^． 基 質^に対す る K m 値， 至適

pH，各 種金 属イ オ^ンや E D T A によ る影 乳 各 種ア ミノ酸^のア クセプ タ^ー と し^ての反応， 耐熱 性な ど の物理 化 学的 性格^において両者^に明ら か な差異は み ら れ な かった が， 電 気 泳 動度^， 等 電点， C O nA およ び^ニ ュ ^ー

ラ ミ^ニダ^ー ゼに対す る 反応 性^には明ら か な相 違が み ら れ た． 家兎^に免疫し^て作 製し た抗血清を用^いた検討

では， 両 者は免 疫 学 的^には区別さ れ なか った．以 上 よ り肝細 胞 痛 患 者^に特 異なn o v el_y⁻G T P は主^に糖 鎖の

プロセ_ッ シ ングの適^いを反 映し た広 義の意 味でのis o e n zym e で あ る と推 察さ れ る．

K ey ^{w o r}ds y⁻G luta m yl tra n sp^ep tida s e， hep^ato c ellular c a r cin o m a く^{H C C}う^， is o e n zy ^{m e}，C a rboh_ydr ate m oietie s

y^，G luta myl tr a n spep tida s e く_y⁻G T Pl は， y⁻ gluta myl _pep tide を水 解す る と同 時^に， その y−

gluta myl基と他^のア ミノ酸や^ペプ チ ド と^の転 移反応 を解媒す る膜 結 合 酸 素^{であ る．} y⁻G T P のis o e n zym e について は¹96 5 年の Kokot ら^りの報 告以来 種々 の電 気泳動 法を 用^いて多く^の研 究が な さ れ て き た が， 臨床 的意義の あ る成 果は認め ら れて いな かった．

一 方， 本

酵素は各種^の実験 的な研 究よ り痛 胎 児 性 蛋 白と し ての

性格を有す る事が 示唆さ れ ており^2ト51渾 武ら^{6 ト引}はこ の様な点^に注 目し， pOlya c ryla mide gr adie nt gelslab を用いた電 気 泳動 法^によ り肝 細胞 癌 患 者 血 清^に特異的

に出現す るy⁻G T P is o e n zym e く^{n o v e}l _y−^{G T Pl を見} 出し， その臨 床 的 有^用性を 明 らか にし た． 著 者は，

n o v eト_y⁻G T P の性 格を解明 す るq^{一端と して肝 細 胞 癌}

組織よ り y−^{G T P を精 製し， その物理化 学 的およ び免} 疫学的な性 格を，正常 腎y^．G T P と 比較して検 討し た．

材 料及 び方法

血清中^に n o v el y⁻G T P を認め た患者の剖 検 肝 癌組

織お よ び肝 癌以外の患 者^の剖検 腎を 用^いた^{． い}ずれ も 死亡 後6時 間以 内^{に −}20⁰C に凍 結 保 存し，6 ケ月以内

に実 験^に供し た．

I ． y⁻G T P 活性^の測定

Orlo w sk i ら^{1 01}の方 法に従^って _Y⁻G T P 活 性^の測 定 を行な^った． す な わ ち， 基 質 緩 衝 液と し てy⁻L⁻ gluta myl⁻a⁻n aph_{t y}la mide45m g， m etO r O S e T C⁻5 1．5

m g，glycyl⁻glycin eO^．01 M ，M gC 120^．0 0 3 3 M を溶 解し た 0^，0 3 M Tris⁻H Cl 緩衝 液3^ml を 用^い，試料5 0_pl を 加え， 3 7⁰C にて 3 0 分イ ^ンキュ ベ ^ー ションし， 0．1 N H C l l ml に て反応を停止 し た^． さ らに， 10 分 間放 置 後， 日 立製分光 光度 計 く2 0 0⁻2 0 型う^{に て}5 5 0n m に おけ る 吸光 度を測 定し， y⁻G T P 活性を算 出し た．

II^． y⁻G T P ^の精 製

表¹ ， 2 に示 す ご と く肝癌 組 織よ りの y ⁻G T P 抽 出 は Orlo w sk i ら^{1 0J}の方 法^{を 一}部 変 更して行なった． ま ず凍 結 肝 癌 く又 は腎う 組織を 2 容の0^．0 8 M M gC 12 中

にて細切後， 3分間， ブレ ンダ ^ー にて処理 し た． これ に 1N⁻N aO H を加え，pH を10 に調 整し た後，3 7^OC に

A b b^re viatio n s こCo n⁻A，C O n C a n a V alin A_三E D T A_，eth_yle n e di^{a m}in e t^etra a c etic a cidi H C C ，

hep^ato c ellula r c a r ci_{n o m ai} P B S， ph o sphate buffe r s olutio ni P E G ，p^Ol_y eth_yle n e gl ^{yc ol}ニ y ⁻ G T P， y⁻gluta m yl tr a n s p^ep tida s e．

5 5 0 登

Tablel^． Pu rific atio n of T ⁻G T P fr o m H C C

Total T otal Spe cific Pr Otein a cti vit y ^{a c}tivit y

く^m gI く^{u nits}I く^{u nits}lm gl Ho m og^{e n a}te

De o xycholate e xtr a ct

A m m o niu m s ulfate fr a ctio n atio n

Br o m el ain tr e atm e nt U ltr o gel

D E A E Cellulo s e

1 5 6 9．3 0．0 1 1 1 4 6 3，1 0．1 6 7 5 6 9．6 l．3 6 2 5 3 2．6 1．7 9 9 41 臥9 1 3．9 6 2 2 3．4 1 6．5 5

Table2． Pu rific atio n of T ⁻G T P fr o m kidn ey

T^otal Total S_pe cific pr otein a cti vit y ^{a c}tivi_{t y}

く^m gl くu nitsl く^{u n}itsノ^mgl Ho m oge n ate

De o xy^cholate e xtr a ct

A m m o niu m s ulfate fr a ctio n atio n

Br o mel ain tr e atm e nt U ltr o gel

D E A E Cellulo s e

8 5 0 3^．2 0^．2 4 2 4 8 5 5^．4 0^．4 5 0 7 0 0^．8 1^，5 5 6 7 8 5^．8 1．9 4 0 6 3 7^．9 1 6^．3 3 9 4．0 3 0．3

て 2 時間 放 置し た^{． こ}れ を 1 8，0 0 0 rp^m ， 4⁰C にて 30 分 間 遠 沈 し た後， 沈 漆を 1^．5％の de o xycholate

mI F C O 製， Detr oit_， M ichiga n， U^．S^．A^．1 と 5 ％ Trito nX くW ako 製， 大 阪lを含む 0．1 M Tris⁻H Cl援 衝 液 くpH 8^．の 中^にて 4 8時 間 可溶 化し た^． 続^いて， 溶 液を 15，0 0 0^rp^m で3 0分 間遠 沈し 上清を透 析 膜を 用 い蒸 留水 中^にて充 分脱 塩し た後， pOlyethyle n eglyc ol くP E G，2 0，00 0ン を加え て濃縮し た． 脱 塩 濃 縮し た試 料 を 0⁰C に冷却し，同じく ⁻2 0⁰C に冷 却し た等 容^のアセ トンを徐々に滴 下 混合し た後， 1 2，0 0 0rpm 3 0分 遠 沈 し て沈澱を得た^{． こ の}沈澱 を 0^．1 M Tris⁻H Cl 緩衝 液 くpE 8^．0コ^に溶 解 後−^{2 00C にていった ん凍 結し た後，室} 温^にて融 解し，0，04 M のgl utathio n eくP⁻L製， Ne w

Y o rk_，U^．S．A ．1 を加え， さ らに5 6⁰C に て1 0 分 間 熱 処 理 し，直ちにO^OC に冷 却し た^． 次に同 液を18，0 0 0rpm

にて 3 0分 間遠 沈し た後， その上清を⁴0％⁻9 0％^の硫 安 ^にて塩 析し， 沈澱 を 0^．1 M Tris⁻H Cl 緩 衝 液 くpH 8^．01^に溶解し， 蒸 留水にて前述のご と く脱 塩， 濃 縮し た． 試料に 1 0m M の 2 ⁻m e r C ap t^{O e}tha n ol お よ び 試 料の 蛋 白1 5 m g に 対し て 1 m g の br o m elain

くN A K A R A I製， 京都l を加え て 3 7⁰C^l時 間イ^ンキ^ュ

ベ ^ー ショ ンの後， U ltr o g^el A C A⁻3 4 くL K B 製，

Br o m m a，S w ede nH2 6^X8 2 0m ml にて 0^．1 M Tris⁻

H ClくpH 8^．1， 0^．5 M NaCll を 用^いて ゲル濾過を行 な^った． 各 分 画の _y^，G T P 活 性を測 定 後，有 活 性 分 画を

2 0 3 0

F_{r a c}tio n n u mbe r 4 0

F ig^．1． D E A E−^{Sephade x c olu m n chr o m atogr aphy}

Ofthe a ctiv e fr a ctio n sfr o m Urtr og^el A C A 3 4．

T he flo w r ate w a s 40 mllhr a nd 6 ml fr a ctio n s W e r e C Olle cted．

回 収し， 同 様 ^に脱塩 濃 縮 後， D E A E⁻S ephade x

くP ha r m a cia 製， U_{p p}s ala，Sw ede nlく25 ^x4 0 0 m ml ^に て 0^．01M Tris⁻H Cl くpH 8^．Ol を緩 衝液と し， ブ ラ ジ

ュ ントミキ サ ^ー にて N aCl 濃 度を連 続 的^に0 よ り^0．5 M ま で変 化さ せ な が ら イ オ^ン交 換ク ^{ロ マ} ト グ ラ フ ィ ^ー を行な^った． 溶 出さ れ た分 画^の y⁻G T P 活性を 測 定し有 情 性 分 画を 回収 後， 脱 塩 濃縮し^て部 分精製 材 料と し た く図1う．

III． ゲ^ル電 気 泳 動

ゲル電 気 泳 動は既 報の方 法にて行な^っ た^71． す な わ

ち， P h^{a r m a c}ia 社 製 電 気 泳 動 装 置5 0 01100 を 用^い，

pol_ya c ryla mide g^{r a}d ie nt ge1 4ノ3 0くP ha r m a cia 紛 を支持体と し て 1 8時 間泳動し た． 泳動 後ゲ^ルを N サ L⁻gluta myト^a−^{n apht yla mide くW ako 製1， glycyト}

glycin e くW ako 艶， M gC 12を混 和し た反応 液 中^にて 2時間 反応さ せ た後fa st ga rn etG B C くS igm a 乳 ^St．

Lo uis，M is s o uri， U．S，A．1 ^{に て}染 色し た．

肌 等電点電気泳動

等電点 電 気泳 動は1 10 ml カ ラム くL K B 81 001 を 用

い， 50％ 京精 液及 び 4 0％a m pholin e くpH 3．5^へ101^に

て行な^っ た^． 1，2 0 0 V_，4 8時 間通 電 後， 得ら れ た各 分画 液 く4^．4 mり^{に つ い}て， pH メ ^ータ ^ー によ る_pH 測 定及 びy⁻G T P の活性 測 定を行なった．

V ． C^{o n} A ア フ ィニティ ^ー クロ マ ト グ ラフ ィ ^ー Co n A s epha r o s e くP ha r m a cia 製l く2 6^X4 0 0 m ml を用^い， 0^．0 5 M Tris⁻H Cl くpH 7^．51 ^に0^．5 M N aC l，

1 m M M nC12，1 m M CaC l2 を溶解し た ものを援 衝液 と し た^． ま た溶 出 液には 0^．2 M a ⁻m ethyl⁻D⁻m a n n O⁻ p yr a n o si de くP⁻L 製l を 用^いた．

V工． ニ ュ ^ー ラミニダ^ー ゼ処理

1 0m M N aCl，1 0 m M M gC1² を含む 10 0 m M 酢酸 綬衝 液 くpH 5^，51 ^{にニ ュ ー} ラミ^ニ ダ^ー ゼ くB6ehring^{e r} M a n nheim 製， W e st_，Ge r m a ny1 1 m gJ^lml を溶 解^し，

等容の試 料を加え 3 7⁰C 1 6 時 間イ^ンキ^{エペ ー} ト し た^． 用^． 免 疫 学的 実験法

肝癌 組 織^およ び腎組 織^から抽 出し た y^．G T P の イ オ ン交換ク^{ロ マ}ト グ ラフ ィ ^ー の段 階まで部 分 精製し た も のを， 抗^ヒト全 血 清を結 合させ た C N Br⁻a Ctiv ated

F ig^．2− E Ie ctr opho r etic pat te r n ofthe pu rified _y⁻ G T P fr a ctio n u sing4⁻3 0polya c ryla mi de g^{r a}die nt gelslab．

T he a m o u nt of _pu rified fr a ctio n ap plied to the gelw a s2 5J^Ll．E le ctr opho r e sis w a s p^{e r}fo r m ed ata C O n St_{a n}t v oltage of 2 0 0v fo r 18hr in T ris−^{bo ric}

a ci d，pH 8．35．

くAl y−^{G T P fr o m H C C afte r D E A E Sephade x}

C hr o matog^{r a}phy^．

くBl y⁻G T P fr o m k idn ey^．

くCISe r u m of H C C^．

S epha r o s e 4 B によ るn egativ e affini_{t y} chr o m ato⁻ g^{r a}ph_y くP ha r ma cia 製 圧2 6^x3 0 m ml を行^い， 爽雑 蛋 白を除 去し た． 各 試料0．2 m g く蛋 副 を 0^．0 5 M リ^ン 酸 緩 衝 液 くP B SH pH 8^．01 1 ml に溶 解し， 等 容の Fr e u nd^，s adj^{u v a nt} く王A T R O N 製， 東京う を加え， ウ サギに2週 間毎^{4 回}皮 下^に注 射し た． 注 射終了 よ り 1 0 日目^に採血 し， 得ら れ た 血清よ り 5 0 ⁻3 3％の硫 安分 画

に て， lgG を分 画 し， 抗 血 清と して 用 ^い た．

Ou chte rlo ny do uble im m u n odiffu sio n te st は各抗 血 清20 月l を使用 し， 各 抗 原5_〆1 にて1 ％aga r 上^にて 行なった^． 次に， 各抗 原5 0 0声1 に抗 腎y^．G T P 血清を，

0 ，1 0， 50， 1 00， 2 0 0_ノ^上1添 加し，3 7⁰C lO 分 間イ^ンキ^ュ

ベ ^ー ションし た後^に各々 の y⁻G T P 活 性を測 定し た．

さ ら^{に 1}6時 間4 ⁰C ^にて放 置し た後，1 0，0 00 xg にて1 0 分間遠 沈し 上清の y^．G T P を測定す る^ことによ り肝 癌

y⁻G T P， Co n A 吸着 分 画， Co n A 非吸着 分画お よ び 腎y⁻G T P に対す る抗 腎y⁻G T P 血 清の惰 性 阻 害率を 検 討し た^．

用． 蛋白定量 は F^olin⁻Lo w ry 法 を 用^いた^1り

成 績

工^． _y⁻G T P の精製

表1_， 2 に示 す ご と く イ オン交 換ク^{ロ マ} ト グ ラ フ ィ ^ー終了後， 肝 癌組 織か ら は 1 6^．6^xl O³ mUノm g，腎 組 織か ら は 3 0^．3^Xl O³ m Ul ^mg の _y⁻G T P 活 性が得ら れ た． こ の段 階で各々をpolya c ryla mide gr adie nt g^．el 電気 泳動す る と， 図2 に示 す様^に肝 癌 組織y⁻G T P は ポ^スト ア^ルブ ミン領 域^の， 血清Y⁻G T P zym ogr a m 上 で 工^およ び 王^，と呼ぶ^{6 州} 部 位に ^一致して， や や巾広く 泳動さ れ た0

一 方，腎 組織y⁻G T P は そ れ よ り陰極 寄り

1．0 0．8 Ka v O．6

0．4 0．2

M _ole c ula r w eig h^t

F ig^．3^． Dete rmi n atio n of m ole c ula r w eigh ^{t o}f _y⁻ G T P^．

Sta nda rds く^aldola s e， albu min， ribo n u cle a s e A，

Chym otry p^sin og^{e n} A， O V al bu min， C atala s e， a nd thyr oglobulinJ， pu rif ied _y⁻G T P， a nd B lu e

De xtr a n w e r e chr o rn atOgr aPhed o n a l．6^X7 0c m C Olu mn of U ltr ogel A C A−^{34． T heflo w r ate w a s}

m aintain ed at 15 mllhr．