博士（医学）鹿内浩樹 学位論文題名

     博士（医学）鹿内浩樹 学位論文題名

GABA 合 成酵 素含 有 5‑HT 作動性神経の      生 理 学 的 特 性 に 関 す る 研 究

学位論文内容の要旨

【 目 的 と 背 景 】  化 学 シ ナ プ ス で は 、 神 経 細 胞 は シ ナ プ ス 前 ニ ュ ー ロ ン か ら 後 ニ ュ ー ロ ン に 神 経 伝 達 物 質 を 放 出 し 、 情 報 を 伝 達 す る 。 こ れ を 担 う 神 経 伝 達 物 質 は 、 グ ル タ ミ ン 酸 や ッ ‐ ア ミ ノ 酪 酸(GABA)な ど の ア ミ ノ 酸 、 ア セ チ ル コ リ ン や ド ー パ ミ ン な ど の モ ノ ア ミ ン が 典 型 的 で あ る 。 こ れ ら の 神 経 伝 達 物 質 が ニ ュ ー ロ ペ プ チ ド や 成 長 因 子 な ど の 神 経 調 節 因 子 と 共 放 出 さ れ る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る が 、 ア ミ ノ 酸 や モ ノ ア ミ ン 同 士 のclassicalな 神 経 伝 達 物 質 の 共 放 出 も 少 な か ら ず 報 告 さ れ て い る 。 こ れ は シ ナ プ ス 前 ニ ュ ー ロ ン が 複 数 の 神 経 伝 達 物 質 に よ っ て 後 ニ ュ ー ロ ン の 活 動 を 制 御 す る と 考 え ら れ る 興 味 深 い 現 象 で あ る 。 セ ロ ト ニ ン(5‑hydroxytriptamine: 5‑HT)は 、 臨 床 的 所 見 お よ び 動 物 実 験 の 結 果 か ら 、 精 神 機 能 の 調 節 に 深 く 関 わ っ て い る と 考 え ら れ る 神 経 伝 達 物 質 で あ る 。 中 枢 神 経 系 に お け る5‑HT作 動 性 神 経 は 、 脳 幹 の 正 中 部 に 位 置 す る 縫 線 核 群 を 起 始 核 と し て 存 在 す る 。 中 で も 背 側 縫 線 核 (dorsal raphe nucleus: DRN)お よ び 正 中 縫 線 核 の5‑HT作 動 性 神 経 は 、 扁 桃 体 や 側 坐 核 、 大 脳 皮 質 や 海 馬 に そ れ ぞ れ 投 射 し 、 情 動 調 節 機 能 に 関 与 し て い る 。DRNに は5‑HTを 単 独 発 現 す る5‑HTニ ュ ー ロ ン とGABAの 合 成 酵 素 で あ るglutamic acid decarboxylase (GAD)を 共 発 現 す る5‑HT/GADニ ュ ー ロ ン が 存 在 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 こ れ は5‑HT/GADニ ユ ー ロ ン がGABAと5‑HTを 共 放 出 す る 可 能 性 を 示 唆 す る も の で あ る が 、 詳 細 は 全 く 不 明 で あ る 。 ま た5‑HTと 同 様 に 、GABAも 情 動 調 節 機 能 を 担 う 神 経 伝 達 物 質 で あ る こ と か ら 、 5‑HT/GADニ ュ ー ロ ン は 情 動 に 特 化 し た 生 理 学 的 機 能 を 有 す る こ と が 想 定 さ れ る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 こ の5‑HT/GADニ ュ ー ロ ン の 機 能 的 役 割 の 追 究 を 目 的 と し て 、 電 気 生 理 学 的 検 討 、 形 態 学 的 検 討 お よ び 情 動 ス 卜 レ ス 応 答 に 関 わ る 行 動 薬 理 学 的 検 討 を 行 っ た 。 本 研 究 は 第1章 「GABA合 成 酵 素 含 有5‑HT作 動 性 神 経 の 電 気 生 理 学 的 お よ び 形 態 学 的 特 徴 の 検 討 」 お よ び 第2章 「GABA合 成 酵 素 含 有5‑HT作 動 性 神 経 の ス ト レ ス 応 答 性 に 焦 点 を 当 て た 行 動 薬 理 学 的 お よ び 組 織 化 学 的 検 討 」 で 構 成 さ れ る 。

【 材 料 と 方 法 】 ＠ 電 気 生 理 学 的 解 析 ： 生 後3‑4週 齢 の 雄 性Wistar/ST ratの 脳 か ら 縫 線 核 を 含 む 厚 さ300 ymの 冠 状 断 急 性 ス ラ イ ス を 作 製 し 、 背 側 縫 線 核 神 経 細 胞 か らwhole‑cell patch clamp記 録 を 行 っ た 。 電 気 記 録 後 、 ガ ラ ス 管 電 極 よ り 回 収 し たtotal RNAを 用 い て 単 一 細 胞 RT‑PCR法 を 行 い 、5‑HT合 成 酵 素 で あ るtryptophan hydroxylase2 (TPH2) mRNAお よ び 67kbp‑GAD (GAD67) mRNAの 発 現 パ タ ー ン か ら 記 録 ニ ュ ー ロ ン を 分 類 し た 。 ◎ 形 態 学 的 解 析 ： 多 色 螢 光in situ hybridization法 ま た は 免 疫 蛍 光 法 に よ り 、TPH2、GAD67、 小 胞 体GABA ト ラ ン ス ポ ー タ ー(VIAAT)、5‑HTト ラ ン ス ポ ー タ ー(HTT)のmRNAお よ び タ ン パ ク 質 の 局 在 解 析 を 行 っ た 。 ◎ 行 動 薬 理 学 的 解 析 ：  open field (OF)ス ト レ ス ま た はcontextual fear conditioning (CFC)ス ト レ ス を 負 荷 し た 後 、 ラ ッ ト を4％paraformaldehydeで 灌 流 固 定 し 、 厚 さ30 pmの 凍 結 切 片 を 作 製 し た 。 神 経 細 胞 活 性時 の 最 初 期 遺伝 子c− ノ ぬの タ ン パ ク 質 （c‐Fos） をABC酵 素 抗 体 法 に よ り 検 出 し 、DRNを 背 側 部 （DRD） 、 腹 側 部 （DRD） 、lateralwing部

（DRL） に 細 分 化 し た 各 領 域 に お け るc‐Fos発 現 数 を 計 測 し た 。 こ のc‐Fos発 現 の 情 動 特 異 性

―253 ‑

を 検 証 す る た め 、 ス ト レ ス 負 荷 前 にbenzodiazepine系 抗 不 安 薬 で あ るdiazepamを 全 身 投 与 し 、 各 領 域 のc‑Fos発 現 数 の 変 動 を 計 測 し た 。 次 に 情 動 ス ト レ ス 特 異 的c‑Fos発 現 の ニ ュ ー ロ ン 選 択 性 を 解 析 す る た め に 、c‑Fos抗 体 、TPH2抗 体 お よ びGABAニ ュ ー ロ ン の マ ー カ ー で あ るparvalbumin (PV)抗 体 を 用 い た3重 免 疫 螢 光 染 色 を 行 い 、 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 に よ る 免 疫 螢 光 顕 微 鏡 解 析 を 行 っ た 。

【 結 果 と 考 察 】 第1章 ： 単 一 細 胞RT‑PCR法 に よ り 、whole‑cell patch clamp記 録 ニ ュ ー ロ ン

（n 82） は 、TPH2 mRNA陽 性 で あ る5‑HTニ ュ ー ロ ン(52.4％ ，n 43)、TPH2/GAD67 mRNA 両 陽 性 で あ る5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン(12.2％ ，n= 10)、GAD67 mRNA陽 性 で あ るGAD67 ニ ュ ー ロ ン(4.9％ ，n゜4） お よ び い ず れ も 陰 性 で あ る そ の 他 の ニ ュ ー ロ ン(30.5％ ，n 25） に 分 類 さ れ た 。5 HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン は 、5‑HTニ ュ ー ロ ン お よ びGAD67ニ ュ ー ロ ン と 比 較 し て 、 低 い 発 火 頻 度 お よ び 低 い 膜 抵 抗 値 と い う 電 気 生 理 学 的 特 徴 を 示 し た 。 発 火 頻 度 はA タ イ プK+電 流(IA)に よ っ て 調 節 さ れ る 。 こ のIAは 電 位 依 存 性K+チ ャ ネ ル の サ ブ タ イ プ で あ るKv4フ ァ ミ リ ー の 関 与 が 知 ら れ る こ と か ら 、5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン に お け るKv4発 現 様 式 の 違 い が 示 唆 さ れ る 。 さ ら に 、 入 力 抵 抗 値 は 膜 受 容 体 密 度 や 膜 表 面 積 に 依 存 す る こ と か ら 、 他 の ニ ュ ー ロ ン と 比 較 し て5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン の サ イ ズ が 大 き い 可 能 性 が 示 唆 さ れ る 。 形 態 学 的 特 性 解 析 で は 、 特 にDRLに5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン の 局 在 が 検 出 さ れ た 。 こ の 5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン に はVIAATのmRNA韜 よ び タ ン パ ク 質 が 検 出 さ れ ず 、 DRNの5‑HT作 動 性 神 経 投 射 先 の 神 経 終 末 に お い て もHTTとVIAATの 共 発 現 は 検 出 さ れ な か っ た 。 こ れ は 、5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン か ら のGABAの 遊 離 の 可 能 性 を 否 定 す る も の で あ り 、5‑HTとGABAの2っ の 神 経 伝 達 物 質 がco‑releaseさ れ る 可 能 性 は 低 い と い う こ と を 示 し た 。 過 去 の 報 告 か ら 、5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン 内 のGABAは 神 経 伝 達 物 質 と し て 存 在 す る の で は な く 、 神 経 保 護 作 用 や 神 経 栄 養 因 子 と し て の 機 能 を 持 つ こ と が 考 え ら れ た 。 第2 章 ： OFス ト レ ス 負 荷 に よ り 、DRL、DRD、DRVの い ず れ の 領 域 に お い て もc‑Fosの 発 現 が 増 大 し 、 特 にDRLで はDRDお よ びDRVと 比 較 し て 有 意 な 発 現 数 増 大 が 見 ら れ た 。CFCス ト レ ス 負 荷 で は 、DRD，DRVDRLす べ て の 領 域 に お い てc‑Fos発 現 数 が 増 大 し た も の の 、 領 域 間 で の 有 意 差 は 無 か っ た 。 こ れ ら の ス ト レ ス 負 荷 に よ るDRLに お け るc‑Fos発 現 増 大 は 、 抗 不 安 薬diazepamの 投 与 に よ り 有 意 に 抑 制 さ れ た こ と か ら 、 こ のc‑Fos発 現 は 不 安 情 動 特 異 的 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、OFス ト レ ス 負 荷 に よ り 誘 発 さ れ たc‑Fosは 、5‑HTニ ュ ー ロ ン よ り も5‑HT/PVニ ュ ー ロ ン に 選 択 的 に 発 現 し て お り 、CFCス ト レ ス に よ り 誘 発 さ れ たc‑Fosは そ の 逆 で あ っ た 。 こ れ は5‑HTニ ュ ー ロ ン よ り も5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン はOF ス ト レ ス の よ う な 軽 度 な ス ト レ ス に 対 し て 選 択 的 に 反 応 す る こ と を 示 す も の で あ り 、 ス ト レ ス の 強 度 や 種 類 に 応 じ てDRL内 の 存 在 す る 神 経 細 胞 は 異 な っ た 反 応 を 示 す こ と が 考 え ら れ た 。

【 結 論 】GABA合 成 酵 素GAD67含 有5‑HT作 動 性 神 経 は 、 ラ ッ トDRL領 域 に 局 所 的 に 存 在 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ の 神 経 細 胞 は 共 存 す るGABAを 遊 離 せ ず 、5‑HT作 動 性 神 経 やGABA作 動 性 神 経 と も 異 な っ た 電 気 生 理 学 的 特 徴 を 持 つ 。 ま たmildな ス ト レ ス に 対 し て 反 応 し 、 生 体 の ス ト レ ス 応 答 反 応 に 寄 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 一 部 の ス ト レ ス に 対 し て 特 異 的 に 反 応 性 を 示 す こ の 神 経 の 生 理 学 的 機 能 や 形 態 学 的 特 徴 を 追 求 し て い く こ と は 、 情 動 関 連 精 神 疾 患 の 病 態 解 明 の 糸 口 と な る こ と が 期 待 さ れ る 。

―254−

学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

GABA 合 成酵素含 有 5‑HT 作動 性神経の      生 理 学 的 特 性 に 関 す る 研 究

  近 年 、1つ の 神 経 細 胞 内 に 複 数 の 神 経 伝 達 物 質 が 存 在 す る 報 告 が な さ れ て い る 。 この 複 数 の 神 経 伝 達 物 質 に よ る シ ナ プ ス 後 ニ ュ ー ロ ン の 活 動 制 御 機構 に関 して は、 そ の真 偽も 含 め て 不 明 な 点 も 多 い 。 本 研 究 はGABA合 成 酵 素 含 有5‑HT作 動 性 神 経 の 生 理 学 的 特 性 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て 、 電 気 生 理 学 的 、 分 子 生 物 学 的、 形態 学的 、行 動 薬理 学的 手 法 の すぺ てを 駆使 し、 当 該神 経細 胞の 特 性を 多角 的に 評価 し た。

  本 研 究 の 第1章 で は 、 免 疫 組 織 化 学 染 色 法 お よ び 血situ hybridization法 を 用 い た共 焦 点 レ ー ザ ー 頭 微 鏡 解 析 を 行 い 、 GABA合 成 酵 素 GAD67含 有5‑HT作 動 性 神 経 (5‑HTIGAD67ニ ュ ー ロ ン ） が 、 ラ ッ ト 背 側 縫 線 核lateral wings (DRL)領 域 に 局 所 的 に 存 在 し て い る こ と を 明 ら か に し た 。 ま た こ の 神 経 細 胞 に は 、GABAを シ ナ プ ス 間 隙 へ 遊 離 す る 際 に 必 要 な 小 胞 膜 卜 ラ ン ス ポ ー タ ーvesicular inhibitory amino acid transporter (VIAAT)が 検 出 さ れ な か っ た 。 こ の 結 果 は 、 細 胞 内 に 共 存 す る で あ ろ う5‑HTとGABAの 2つの 神経 伝 達物 質が 共放 出さ れ る可 能性 を否 定す る もの であ った 。 電気生理 学的検討では、

whole‑cell patch clamp法 に 単 一 細 胞RlxPCR法 を 組 み 合 わ せ る こ と で 、 ニ ュ ー ロ ン 膜 特 性 解 析 に 加 え て 、 記 録 ニ ュ ー ロ ン の 分 子 生 物 学 的 同 定 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン は5‑HTニ ュ ー ロ ン やGAD67ニ ュ ー ロ ン と 比 較 し て 、 発 火 頻 度 が 低 く 、 入 力 抵 抗 が 有 意 に 小 さ ぃ と い う 細 胞 膜 特 性 が 明 ら かに され た。 これ ら の結 果は 、 各 ニ ュ ー ロ ン 間 で の イ オ ン チ ャ ネ ル の 発 現 数 の 差 や 、 細 胞 サイ ズの 違い 、細 胞 表面 積の 差 を 示 唆 す る も の で あ っ た 。 第2章 で は 、5‑HT/GAD67ニ ュ ー ロ ン の も つ 生 体 内 情 動 制 御 機 能 に 焦 点 を 当 て 、 情 動 ス ト レ ス 負 荷 時 の 神 経 細 胞 の 活 性 化 を、 最初 期遺 伝子 転 写因 子の ー っ で あ るc‑Fosタ ン パ ク の 免 疫 染 色 を 行 う こ と に よ り 検 討し た。Open field (OF)ス トレ ス 負 荷 に よ り 、DRL領 域 に お い てc‑Fos発現 数の 増大 が 認め られ た。 同様 に 、contextual fear conditioning (CFC)ス ト レ ス 負 荷 に よ っ て もDRL領 域 に お い てc‑Fos発 現 数 の 増 大 が 認 め

−255ー

之

弘

樹

彦

温

充

真

雅

谷 岡

中 邉

神 吉

田 渡

授 授

授 授

教 教

教 教

査 査

査 査

主 副

副 副

ら れ た 。 こ れ ら の ス ト レ ス 負荷 によ り誘 発 され たc‑Fos発現 数の 増大 は 、抗 不安 薬diazepam (0.5 mg/kg，i．p．）の 全身投与により有意に抑制 された。この結果から、スト レス負荷により 誘 発 さ れ たDRLに お け るc‑Fosの 情 動 特 異 性 が 示 さ れ た 。 次 に ス ト レ ス 負 荷 に よ り 誘 発 さ れ たc‑Fos陽 性 細 胞 の 性 質 同 定 の た め に 、5‑HT合 成 酵 素 で あ るtryptophan hydroxylase、 GABAの マ ー カ ー で あ るparvalbumin (PV)、 そ し てc‑Fosの 計3っ の 抗 体 を 使 用 し た 螢 光 3重 免 疫 染 色 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、PV陽 性5‑HT作 動 性 神 経(5‑HTIGAD67ニ ュ ー ロ ン ） は 、 CFCス ト レ ス よ り もOFス ト レ ス に 対 し て 優 先 的 に 反 応 す る こ と が 示 さ れ た 。 逆 に 、PV陰 性5‑HT作 動 性 神 経(5‑HTニ ュ ー ロ ン ） はOFス ト レ ス よ り もCFCス ト レ ス に 対 し て 優 先 的 に 反 応 す る こ と が 示 さ れ 、 各 ニ ュ ー ロ ン の ス ト レス 応答 性に は特 異 性が 存在 する 可 能性 が示された。

  最 終 審 査 で は 申 請 者 の 発 表 に 対 し 、 副 査 の 渡 邊 雅 彦 教 授 か ら 、OFス ト レ ス とCFCス トレ ス の 質 的 な 違 い や 、DRL領 域 に 存 在 す る5‑HT作 動 性 神 経 の 投 射 領 域 に つ い て の 質問 が なさ れ 、RTPCR法 に お け るpdmerの 設 計 に 関 し て の 助 言 がな され た。 副査 の 田中 真樹 教授 か ら、

5．HT作 動 性 神 経 の 情 動 調 節 メ カ ニ ズ ム 、DRL領 域 へ 神 経 投 射 を 行 う 脳 領 域 、GAD67ニ ュ ー ロ ン の 発 火 特 性 に 関 す る 質問 がな され た 。副 査の 吉岡 充 弘教 授か ら、5‐HT/GAD67ニ ュー ロ ン 内 に 存 在 す る で あ ろ うGABAの 生 理 学 的 機 能 や 、5‐HT神 経 系 の 発 達 の 観 点 か ら の GABAの 役 割 に つ い て 質 問 が な さ れ た 。 さ ら に 主 査 の 神 谷 温 之 教 授 か ら 、 活 動 電 位 波 形 の 詳細 な解 析結 果 や、 入力抵抗に関する過去 の文献との比較検討、negative．current注入中の電 位 変 化 に 関 す る 電 気 生 理 学 的 な 質 問 が な さ れ た 。 申請 者は すべ ての 質 問に 対し て、 自 らの 実 験 結 果 と 過 去 の 文 献 を 引 用 し 、 概 ね 適 切 に 回 答 し た 。 特 に 、DRL領 域 へ の 入 力神 経 投射 に 関 し て は 、 大 脳 皮 質 や 手 綱 核 か ら の 神 経 投 射 を 代表 的な 例と して 挙 げ、 これ らの 脳 領域 がDRLに 存 在 す る 神 経 の 活 動 を 調 節 す る 可 能 性 を 説 明 し た 。 ま た 、5‐HT／GAD67ニ ュ ーロ ン 内 に 存 在 す る で あ ろ うGABAの 生 理 学 的 な 機 能 に 関 し て は 、 細 胞 膜GABAtr孤sponerの 逆 回 転 や 、GABAshuntを 介 し た 神 経 保 護 作 用 な ど を 挙 げ 、GABAの も つ 多 様 な 生 理 学 的 役 割を説明した。

  本 学 位 論 文 は 、GABA合 成 酵 素 含 有5．HT作 動 性 神 経 の 生 理 学 的 特 性 の 了 端 を 明 ら か に し、 その 成果 は 情動 に関 連し た 精神 疾患 の病 態解 明 の糸 口と なる こと が ．期 待さ れる 。 審査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程に おけ る研 鑽や 取 得単 位な ども 併 せ申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

―256 ‑