博士論文審査報告書
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(2) 脊 椎 動 物 の 多 く は 、遺 伝 的 に 性 が 決 ま る 。そ の 後 、性 分 化 関 連 遺 伝 子 群 が 働 き 、 未分化生殖腺は精巣または卵巣へと分化する。この性分化に、生殖腺で生産され る性ステロイドホルモンが重要と考えられている。生殖腺の性分化に関する研究 は、これまで哺乳類・鳥類・魚類で活発に行われていた。両生類の研究は遺伝的 情報が乏しくかなり遅れていたが、当研究室の研究によって先行研究に追いつい た。有性生殖を営む動物が性を決め、雌雄いずれかに生殖腺を分化させることは 種 を 存 続 さ せ る た め に 必 要 不 可 欠 で あ る 。 本 研 究 は 両 生 類 ツ チ ガ エ ル ( Ra na. r ugos a ) を 用 い 、生 殖 腺 の 分 化 に 関 わ る 2 つ の 遺 伝 子 に つ い て 解 析 す る こ と を 目 的 とした。 細 胞 遺 伝 学 的 な ア プ ロ ー チ か ら 、 カ ジ カ ガ エ ル ( Bue r ge ri a b uer ge r i ) で は G O T- 1 ( G l u t am a t e o x a lo a c et a t e t r a ns am i n as e 1) 酵 素 が 性 と 連 鎖 し 、 性 染 色 体 に そ の 遺 伝 子 が あ る と 報 告 さ れ て い る 。 そ こ で 我 々 は 、 ツ チ ガ エ ル 雄 (ZZ)ゲ ノ ム D N A ラ イ ブ ラ リ ー を 作 製 し 、 GO T - 1 遺 伝 子 を 指 標 と し て ゲ ノ ム ウ ォ ー キ ン グ を 行 い 、性 決 定 遺 伝 子 を 探 索 し た 。本 研 究 で は G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 配 列 の 単 離 及 び 、 そ の 解 析 を 行 っ た 。他 の 脊 椎 動 物 で は 、 GO T- 1 遺 伝 子 の 近 接 領 域 に ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 遺 伝 子 CY P1 7 が 存 在 し て い る こ と が 知 ら れ て い る た め 、 こ の 遺 伝 子 の 構 造解析も行った。 第 1 章では、先行研究を基に、精巣分化機構の研究における本研究の位 置づけ を示し、目的と意義について述べる。また、本研究の実験動物ツチガエルについ て、その特徴・発生段階分期法、雌雄判定法について説明する。 第 2 章 で は 、 G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 配 列 の 単 離 、 解 析 結 果 に つ い て 述 べ る 。 ま ず 、 ツ チ ガ エ ル GO T- 1 c D N A の 塩 基 配 列 1 , 4 0 4 b p 、ア ミ ノ 酸 4 1 3 残 基 を 決 定 し た 。こ の 配 列 を 基 に GO T- 1 遺 伝 子 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 作 製 し 、ツ チ ガ エ ル ゲ ノ ム D N A ラ イ ブ ラ リ ー か ら コ ロ ニ ー P C R 法 に よ る 段 階 的 ス ク リ ー ニ ン グ を 行 い 、 GO T- 1 遺 伝 子 を 含 む 約 4 0 k bp の ゲ ノ ム D N A ク ロ ー ン ( C l o ne A) を 得 た 。 塩 基 配 列 を 決 定 し た 結 果 、C l o n e A は GO T- 1 遺 伝 子 全 長 ( エ ク ソ ン 1 ～ エ ク ソ ン 9 ) を 含 ん で い る こ と が 分 か っ た 。次 に GO T- 1 遺 伝 子 隣 接 領 域 の 塩 基 配 列 を 決 定 す る た め 、C l o n e A の 3 ' 側 の 塩 基 配 列 を 基 に プ ラ イ マ ー を 設 計 し 、 同 じ 手 法 で GO T- 1 遺 伝 子 の エ ク ソ ン 8 と 9 を 含 む 約 4 0 k bp の ゲ ノ ム D N A ク ロ ー ン ( C l o n e B) を 得 て 、塩 基 配 列 を 決 定 し た 。C l o n e A 及 び B の ク ロ ー ニ ン グ に よ っ て 、G O T-1 遺 伝 子 近 傍 配 列 約 7 0 k b p を 単 離 し た 。次 に 、 F I S H 法 に よ り G OT - 1 遺 伝 子 の 遺 伝 子 座 を 決 め た 。 GO T -1 遺 伝 子 は 第 9 染 色 体 ( 常 染 色 体 ) 上 に 存 在 す る こ と か ら 、 カ ジ カ ガ エ ル G O T- 1 遺 伝 子 と は 局 在 が 異 な る こ と が 判 明 し た 。 し か し 、 C l o n e B の F I SH 解 析 で は 、 G O T- 1 遺 伝 子 座 と 異 な る 場 所 に シ グ ナ ル が 確 認 さ れ た 。シ グ ナ ル 領 域 を 明 確 に す る た め 、Clone Bを 3 kbp～ 9 k bp の 9 つ に 断 片 化 し F I S H 解 析 を 行 っ た 結 果 、2 つ の D N A 断 片 に お い て 異 な る シ グ ナ ル が 見 ら れ た 。 さ ら に 詳 細 な 解 析 の 結 果 、 こ れ ら 2つ の DNA断 片 に は 53回 の 繰 り 返 し 配 列 ( 4 1 b p 、 F r a g A) と 2 9 回 の 繰 り 返 し 配 列 ( 3 1 b p 、 F r a g B) が あ る こ と 1.
(3) が 分 か っ た 。 こ れ ら 反 復 配 列 の FISH解 析 に よ り 、 Frag Aで は シ グ ナ ル は 全 て の 常 染 色 体 末 端 、 Frag Bの シ グ ナ ル は 全 て の 常 染 色 体 と Z性 染 色 体 末 端 、 及 び W性 染 色 体 の 長 腕 動 原 体 付 近 と 末 端 に 見 ら れ た 。F r a g B の F I S H 解 析 に よ る Z 及 び W 性 染 色 体 の シ グ ナ ル の 違 い は Frag Bの 繰 り 返 し 配 列 に 依 る 。従 っ て 、こ の 繰 り 返 し 配列はツチガエル性染色体の逆位の位置を特定する有効なマーカーとなり得るこ とを示している。 第 3 章 で は 、CY P1 7 遺 伝 子 の 解 析 結 果 に つ い て 述 べ る 。数 種 の 動 物 で は GO T- 1 遺 伝 子 近 傍 に CY P1 7 遺 伝 子 が 存 在 す る 。雄 性 ホ ル モ ン の ア ン ド ロ ゲ ン 合 成 に は 、 合 成 酵 素 C Y P 1 7 が 不 可 欠 な こ と か ら C Y P1 7 遺 伝 子 の 構 造 を 解 析 し た 。ツ チ ガ エ ル ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー か ら CY P1 7 遺 伝 子 を 含 む 2 つ の D N A 断 片 を 単 離 し た 結 果 、 ツ チ ガ エ ル に は CY P 1 7 機 能 遺 伝 子 と 偽 遺 伝 子 ( CY P1 7 及 び ps e ud o CY P1 7 ) が 存 在 し て い る こ と が 分 か っ た 。 塩 基 配 列 の 詳 細 な 解 析 か ら 、 CY P 1 7 は 他 種 の C Y P 1 7 と 相 同 な ア ミ ノ 酸 配 列 を コ ー ド し て い る が 、 p se ud o CY P1 7 は 多 く の 塩 基 の 挿 入 ・ 欠 失 が あ り ア ミ ノ 酸 配 列 は 短 く 異 な っ て い た 。 ま た 、 ゲ ノ ム DNA の 解 析 に よ り CY P1 7 は 複 数 の エ ク ソ ン で 構 成 さ れ て い る の に 対 し 、p se udo CY P1 7 は 単 一 の エ ク ソ ン で 構 成 さ れ て い た 。F I S H 法 に よ り 2 つ の 遺 伝 子 座 を 解 析 し た と こ ろ 、. CY P17 及 び p s e udo CY P17 は 、そ れ ぞ れ 第 9 及 び 第 4 染 色 体 ( 共 に 常 染 色 体 ) に 局 在 し て い た 。ツ チ ガ エ ル 成 体 各 組 織 で の 2 つ の 遺 伝 子 の 発 現 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、. ps e ud o CY P1 7 は 解 析 し た 全 組 織 で 非 常 に 弱 い 発 現 が 見 ら れ た 。CY P1 7 は 精 巣 で 強 く 発 現 し て い た 。 ま た 、 ツ チ ガ エ ル 発 生 過 程 の 生 殖 腺 で は ps e udo CY P1 7 は 発 現 に 雌 雄 差 が な い の に 対 し 、 CY P1 7 は 性 決 定 期 の 雄 生 殖 腺 に 強 く 発 現 し て い た 。 この遺伝子発現パターンの違いは、転写調節機構に依ると思われた。そこで、2 つの遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を決定し、その比較を行った。予想通 り、両者の間に全く相同性はなく、2 つの遺伝子の発現機構が異なることから. ps e ud o CY P1 7 遺 伝 子 は 無 機 能 遺 伝 子 で あ る と 判 断 す る に 至 っ た 。本 研 究 に よ り 、 両 生 類 で 初 め て CY P 1 7 偽 遺 伝 子 が 存 在 す る こ と を 見 出 し た 。ま た 、p se ud o CY P1 7 はツチガエル雄化に関与していないと考えられた。 第 4 章 で は 、 ツ チ ガ エ ル の 雄 化 に 重 要 な CY P1 7 遺 伝 子 の 転 写 調 節 領 域 の 解 析 に つ い て 述 べ る 。 本 研 究 で は 、 ツ チ ガ エ ル ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー か ら CY P1 7 遺 伝 子 を 単 離 し 、そ の 転 写 調 節 領 域 の 塩 基 配 列 ( 4, 0 9 7 b p ) を 決 定 し た 。次 に 生 殖 腺 分 化 に 関 わ る 既 報 の 転 写 因 子 に 注 目 し 、転 写 調 節 領 域 の 転 写 因 子 結 合 配 列 を 解 析 し た 。 そ の 結 果 、CY P1 7 転 写 調 節 領 域 に は ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 遺 伝 子 の 発 現 調 節 に 関 わ る S F - 1 結 合 配 列 が 1 箇 所 、G ATA 結 合 配 列 が 4 箇 所 、F o x L 2 結 合 配 列 が 6 箇 所 、 A R ( ア ン ド ロ ゲ ン 受 容 体 ) 結 合 配 列 が 2 箇 所 、 SO X 結 合 配 列 が 4 箇 所 あ る こ と が 予 想 さ れ た 。 こ れ ら の 因 子 に よ る CYP17 の 発 現 制 御 の 可 能 性 を 明 ら か に す る た め、ルシフェラーゼアッセイ法でプロモーター解析を行ったが、これらの転写因 子 に よ る CY P1 7 の 転 写 促 進 は 見 ら れ な か っ た 。 今 後 、 さ ら に CY P1 7 遺 伝 子 の 転 2.
(4) 写因子を探索する必要がある。 第 5 章 で は 本 研 究 の 総 括 に つ い て 述 べ る 。 G OT- 1 遺 伝 子 近 傍 配 列 ( F r a g B ) の F I SH 解 析 結 果 か ら 、 性 染 色 体 上 の シ グ ナ ル パ タ ー ン は 性 染 色 体 の 逆 位 の 場 所 を 特定する上で、非常に有効なマーカーを得たと言える。ツチガエル性染色体の逆 位 に つ い て は 、 こ れ ま で に 細 胞 遺 伝 学 及 び FISH 法 に よ る 分 子 レ ベ ル の 研 究 が 行 われていたが、逆位の場所の特定には至っていなかった。本研究は繰り返し配列 を 用 い る と そ の 場 所 が 特 定 で き る 可 能 性 を 示 し た 。 ま た 、 G OT- 1 遺 伝 子 近 傍 に 存 在 す る CY P1 7 遺 伝 子 の 解 析 に よ り 、ツ チ ガ エ ル に は CY P1 7 機 能 遺 伝 子 と 偽 遺 伝 子 が 存 在 す る こ と が 判 明 し た 。 研 究 結 果 か ら 、 p se ud o CY P1 7 は 単 一 の エ ク ソ ン で 構 成 さ れ て お り 、 第 9 染 色 体 上 の CY P1 7 遺 伝 子 の 転 写 産 物 の m R N A 、 或 い は m RN A か ら 逆 転 写 さ れ た cD N A が 、第 4 染 色 体 に 挿 入 さ れ て 生 じ た プ ロ セ ス 型 偽 遺 伝 子 で あ る と 推 測 さ れ た 。今 後 は 、ゲ ノ ム 上 の 繰 り 返 し 配 列 の 役 割 、ま た CY P1 7 遺伝子の発現制御の仕組みを明らかにする必要がある。. 以上のように、本論文では、両生類ツチガエル雄性決定機構の解明を目的とし て GO T- 1 及 び CY P 1 7 の 2 つ の 遺 伝 子 に 着 目 し 、 解 析 を 行 っ た 結 果 、 特 に 2 つ の 興 味 深 い 現 象 が 明 ら か と な っ た 。 G OT- 1 遺 伝 子 近 傍 配 列 ( F r a g B) の F I S H 解 析 結 果 か ら 、ゲ ノ ム の 繰 り 返 し 配 列 が 染 色 体 逆 位 の マ ー カ ー に な り 得 る こ と を 示 し た 。 この結果は、これまでの報告に加え分子レベルで実証することができ、より詳細 な染色体研究と性決定遺伝子の探索につながる重要な発見であると期待される。 ま た 、 GO T- 1 遺 伝 子 近 傍 に 存 在 す る C Y P1 7 遺 伝 子 の 解 析 に よ り 、 ツ チ ガ エ ル に は CY P1 7 機 能 遺 伝 子 と 偽 遺 伝 子 が 存 在 す る こ と が 明 ら か と な り 、 両 生 類 プ ロ セ ス 型 偽 遺 伝 子 の 存 在 を 初 め て 示 し た 。 よ っ て 、 本 論 文 は 博 士 (理 学 )の 学 位 論 文 と して価値のあるものと認める。. 2 0 11 年 2 月 主査. 早稲田大学教授. 理学博士. (早 稲 田 大 学 ). 中村. 正久. 早稲田大学教授. 理学博士. (名 古 屋 大 学 ). 大山. 隆. 早稲田大学教授. 理学博士. (早 稲 田 大 学 ). 筒井. 和義. 3.
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