I-CeuI fragment analysis of the Shigella species : evidence for large-scale chromosome rearrangement in S. dysenteriae and S. flexneri.

Title

I-CeuI fragment analysis of the Shigella species : evidence for

large-scale chromosome rearrangement in S. dysenteriae and S.

flexneri.( 内容の要旨(Summary) )

Author(s)

宮口, 振英

Report No.(Doctoral

Degree)

博士（医学）甲 第430号

Issue Date

1999-03-31

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/14700

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氏 名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 宮 口 振 英(滋賀県)

博

士(医学) 甲第 430 号 平成11年 3 月 31日 学位規則第4条第1項該当

J-Ceulfragment anaJysis of the Shjde〟a _{species:eVidence} for(arge -SCaIe chromosome rearrangementin S.dysenterjae and S.〟exnerj.

(主査)教授 江 崎 孝 行 (副査)教授 高 橋 優 三 教授 渡 連 邦 友 論 文 内 容 の 要 旨 上親密e肋属は且sderよdわcogよと16SrRNA配列は99%以上の類似度があり,現在の分類学の基準から考える と同一種に属すると予測されている｡しかし,今世紀の初め,赤痢菌が発見されて以来,その病原性から両者は 独立した菌種として信じられてきた｡ところが病原性の且co∼iの解析が進み,且sc鮎ridぬ属とょ訊なe〃α属の境 界が不鮮明な事が指摘され始めた｡5訊なe〃α属の菌種と且co∼iの類縁性を調べるため,トα㍑Ⅰによる制限酵素

地図を作製し,これらの菌種の進化関係の解析を試みた｡Ⅰ-auIは特にTn OPernSの23S rDNA sequencesを

消化する特性を持っており,rmOperOnSのコピー数を調べるに良い方法である｡この酵素を使用し5払なe肋属 の染色体上の遺伝子の転座を証明し,細菌の染色体上の遺伝子の再構築の解析にⅠ-CeuI酵素を使う解析が有効 な方法であることを報告した｡さらにこの研究成果として且co倶=凱鹿肋属の4菌種が分類学的に同一種で あると結論した. 材料と方法 供試株はS.boydiiATCC8700,S.flemeriATCC29903,S.sonneiATCC29930,及びS.dysenteriae ATCC1313の基準菌株を用いた,またE.coliATCC25922(strain B由来)とE.coliW3110(strain K-12 由来)を対照菌株とした｡供試菌株は適法で増菌して,その菌液をアがロースブロックを作り,そのブロック中 の菌を一晩かけて1ysozyme酵素で溶菌した｡さらにproteinaseKで処理して,制限酵素で切断できるまで, 蛋白を分解した｡染色体は23S _{rDNAを切断するI-〔おuI制限酵素で消化して,PFGEで解析した｡酵素で消化} して得た7つのフラグメントをそれぞれ時計廻り順にオペロンの名に沿ってフラグメント H,G,D,C,A,B, Eと命名した｡各フラグメント上の遺伝子の解析には,E.coliKA12の1inkage _{mapからそれぞれhgtP,fis,} rbsR,heTnG,trmA,PuTt)H及びTrSFの各遺伝子を選択した｡更にT･bsRを含むフラグメント(Dフラグメント と設定する)からc7P,tThA及びc軍Aを選び,これらの遺伝子をブロープとしてsouthern hybridizationで, 5軌豆g肋属菌種の遺伝子の位置を決定し,大腸菌と比較した｡ 結果及び考察 Shtgella属のgenome _{sizeはS.boydii,S.flexneT･i,SIsoTUlei及びS.4ysenteriaeそれぞれ4645,4792,} 4501,4415kbと決定した｡4菌種ともリポソームオペロンのコピー数は7個であった｡遺伝子の位置の解析結 果,5./ねェ眠riと5.みα花￡er加は大腸菌と異るところに遺伝子の転座が認められ,異なるト肋Ⅰ消化パター

-23-ンを生じでることがわかった,5.わ0ツdよよと且ぶ0几几eよでは且co∼iB株とともに且coJiK-12より選んだすべて の遺伝子が予測されたフラグメントにそれぞれハイプリダイズした｡ところが且/ge∬彫rよではDフラグメント

から選んだ,bsR,CTP及びcqA各遺伝子はTTSFフラグメントに転座し,trhAだけが残り,114kbサイズの小

さいなフラグメントになっていた｡一方,且dッぶe舶eriαeでは,同じくDフラグメントから選んたrむsRと"p Aはともに化SFフラグメントに移り,￡戒AとcJpが192kbのサイズのフラグメントになっていた0 これらの結果から,5.わ叩dよiと且50肌eiのフラグメントは且coJ通株に近く,5･/geェ花eriと且如摘erよαe は且c｡㍍とは異なったⅠ-G犯Ⅰの消化パターンを示していることが判った｡ 且錘∬几erよと且函e几ねriαeは且わ0ツdiiと5･SO花几eiとは異なり･遺伝子の組み替えを経験し･且coJほ株 から進化距離の遠い菌種であることが判った｡ 論文審査の結果の要旨 申請者宮口振英は飢豆e肋属の4菌種の染色体の制限酵素地図を初めて作成し大腸菌と比較した0その結果 大腸菌と助なe′払属は分類学的に同一菌種に分類されるべき菌株であることをこの方法で証明した0助鹿Z∼α属 の2つの菌種且ぶ0几Wi及び且占0ツdiiは大腸菌により近く,且仲meriおよび且函飢￡eriαは染色体の大き な組み替えが起こって大腸菌からは種の中ではより進化距離が離れていること証明した0この成果は志賀潔およ びコッホが今世紀の初めに赤痢菌を新菌種として発見して以来,一世紀に渡って独立した菌種として理解してき た病原微生物学に重要なインパクトを与えた0赤痢菌と大腸菌を同一種として再分類するための今後の分類学的 な提案のために重要な実験的証拠を積み重ねた申請者宮口振英の研究成果は病原微生物学に重要な足跡を残した と認める｡ [主論文公表誌] I-CbuIfragmentanalysISOftheShigellaspecies‥eVidenceforlarge-SCalechromosomerearrangement in S.め′SenteriaeandS･flexneri･ FEMS Microbiol.Lett.182:93∼98,2000.