学 位 論 文 題 名
博 士 （ 医 学 ） 神 山 俊 哉
肝癌細胞の浸潤・増殖と
urokinase type plasminogen activator
学位論文内容の要旨
I緒 言
癌 の 転 移 が 成 立 す る に は 、 い く っ か の 段 階 が あ る が 、 基 底 膜 、 細 胞 外 マ 卜 リ ッ ク ス の 破 壊 は ー つ の ス テ ッ プ と さ れ て い る 。 こ の 過 程 でurokinase type plasminogen activat,o r（uーPA)が 関 与 し て い る こ と が 注 目 さ れ て い る 。u‐PAはplasminogenをplasminに 変 換 し 、 W型 コ ラ ー ゲ ナ ー ゼ の 活 性 化 を 介 し て 基 底 膜 、 細 胞 外 マ 卜 リ ッ ク ス を 破 壊 す る と さ れ て い る 。 ま たu−PAのGド メ イ ン はEGFと 高 い ホ モ ロ ジ ー を 示 す た め そ れ 自 体 細 胞 増 殖 作 用 を 有 す る こ と も 報 告 さ れ て い る 。
肝 細 胞 癌 は 著 明 に 血 管 が 増 生 し 、 高 頻 度 に 血 管 に 浸 潤 す る 性 格 を も っ て い る 。 ま た 肝 細 胞 癌 患 者 の 血 中u PAが 高 値 を 示 す こ と が 知 ら れ て お り 、 肝 細 胞 癌 の 転 移 にu−PAの 関 与 が 推 測 さ れ る 。 そ こ で 著 者 はin vi troで 肝 癌 細 胞 を 用 い てu−PAの 産 生 能 と 浸 潤 、 増 殖 が い か な る 関 係 を 持 っ か 検 討 し た 。
n研 究 方 法
1． 肝 癌 細 胞 株 の 培 養
肝 癌 細 胞 株 と し て 北 大 医 学 部 第 一 外 科 で 樹 立 し たHC−4と 理 化 学 研 究 所 ジ ー ン バ ン ク か ら 購 入 し たHLE、HLFを 使 用 し た 。 培 養 液 に は10XFCS加RPhll 1640を 用 い 、37℃ 、5%C02で 培 養 し た 。
2． 培 養 上 清
各 肝 癌 細 胞 株 を フ ラ ス コ に 播 種 、 単 層 培 養 しconf luentに な っ た あ と 、PBSで3回 洗 浄 後 、 無 血 清 条 件 で48時 間 培 養 し た 。 培 養 上 清 を 遼 沈 し 測 定 試 料 と し た 。 同 時 に フ ラ ス コ 内 の 細 胞 を 卜 リ パ ン プ ル ー 染 色 し 、 生 細 胞 数 を 算 定 し た 。
3．u−PA、t―PA、PAI‐1、2の 測 定 l
u−PA、PAI−1、PAI−2はTint Elize Kit（Biopool社 製） を用 い て測 定， し た。tーPAはImmuri zet‐PA Kit(Biopool社 製 ） を 用 い た 。
4．Invasion assays
Transwell（Coster．6．6mm diameter，8Um pore size） を 使 用 し た 。 可 溶 性 細 胞 外 マ ト リ
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ッ ク ス(llatrigel） を 冷 却 し た 無 血 清 のRPl¥(11640に 希 釈 溶 解 し 、 蛋 白 濃 度 を30pg/100p1 に 調 整 し た 。 こ の 希 釈 溶 液100ロ1をTranswellの フ ィ ル タ ー に 被 覆 し 使 用 し た 。 Transwellの 上 槽 に2X105個/mlに 調 整 し た 細 胞 浮 遊 液 を100 111、 下 槽 に はfibronectin 20弘g/mlを 含 む10XFCS加RPlI11640を600u1を 加 え 、37℃ 、sxc02で 培 養 し た 。3日 問 培 養 後 、 上 下 の 両 槽 の 培 養 液 を1ITT溶 液 と 交 換 し 、3時 間 培 養 し た 。 フ ィ ル タ ー 上 面 の 非 浸 潤 性 細 胞 、 フ ィ ル タ ー 下 面 お よ ぴTranswell下 槽 内 に 落 下 し た 浸 潤 性 細 胞 をdimethylsulf oxideに 溶 解 し た 。 吸 光 度 はEasy Readerで 波 長540nmを 用 い 測 定 し た 。Invasion Index（I． I） は 、 浸 潤 性 細 胞 の 吸 光 度 を 浸 潤 性 細 胞 と 非 浸 潤 性 細 胞 の 吸 光 度 の 和 で 剖 り 、100を 掛 け た も の と し ％ で 表 し た 。
6． 検 討 項 目
1） 無 血 清 条 件 下 の 各 細 胞 株 の u‐ PA、 t― PA、 PAI‐ 1、 PAIー 2産 生 能 2） 細 胞 増 殖 に 伴 う 培 養 液 中 u― PA、 t‑PA、 PAI− 1、 PAI― 2濃 度 の 変 助 10XFCS加RPM11640に 浮 遊 さ せ 、1X105個/mlに 調 整 後1ウ エ ル に っ き 細 胞 浮 遊 液 各 Imlを 入 れ た 。1、 2、 3、 4、 5、 6日 後 に 生 細 胞 数 を 算 定 し 、 増 殖 曲 線 を 作 成 し た 。 培 養 上 清 を 測 定 試 料 と し た 。
3） 各 細 胞 株 のin vitroに お け る 浸 潤 能 4） 外 因 性u‐PAの 浸 潤 に 対 す る 影 書
Transwellの 上 槽 内 へ 酵 素 活 性 を 有 す るtwo chainu−PA（ ミ ド リ 十 字 ） をO．5pg/ml，1・ 0p g/ml，5．Opg/ml，10．0pg/ml添 加 し 、I．Iを 測 定 し た 。
5） 外 因 性u−PAの 細 胞 増 殖 に 対 す る 影 響
各 穴 にlxi05個/mlの10%FBS加RPIII1640の 細 胞 浮 遊 液 をImlず つ 入 れ 、24時 間 培 養 後two chainu−PAを5．0pg/ml含 む1XFCS加RPII116 40と 含 ま な い も の に 交 換 し 、1、2、3、 4、5日 後 に 生 細 胞 数 を 算 定 し た 。
測 定 値 は 平 均 値 士S．D． で 表 し 、 多 群 間 の 有 意 差 検 定 に は ー 元 配 置 分 散 分 析 とSheffeの 多 重 比 較 を 用 い 、p<0．05を 有 意 と し た 。
m結 果
l.u‐PA濃 度 はHLE，HLF，HC−4で 、 そ れ ぞ れ603．0土7，9ng/ml/106個 、356．7士10．Ing/ml/
06個 、Ong/ml/106個 で あ っ た 。t‐PAは1．90士O．78ng/ml/106個、2．03土O．38ng/ml/106個 Ong/ml/106個 で あ っ た 。PAI‐1は そ れ ぞ れ2733.0土72.3ng/ml/106個 、13 78.3土26. 4ng/ml 1
/106個 、24.7士8．Ing/ml/106個 で あ り 、PAI−2は50．6土2．5ng/ml/106個 、10．6土0．6ng/ml /106個 、Ong/ml/106個 で あ っ た 。u―PA、t−PA、PAI―1、PAI−2の い ず れ も ー 元 分 散 分 析 で 有 意 差 を 露 め た 。 （ P<O． 0001， P=O． 0043， P<O． 0001， P<O． 0001） 2． い ず れ の 増 殖 サ イ ク ル で もHLE、HLF、HC−4の 順 に 有 意 に 細 胞 あ た り のu‐PA、PAI−1産 生 能 は 高 値 を 示 し た 。
3． HLE. HLF、HC―4のI．Iは30.1土9.5%、18.8土0.9%、11.O士2.5%で あ り 、 一 元 分 散 分 析 で 有 意 差 を 認 め た （p=0．015） 。Mat rigelへ の 浸 潤 能 はu−PA、PAI−1産 生 能 に 相 関 し た 。 4．HLEのI．Iはtwo chainu−PAの 添 加 で 変 化 し な か っ た 。HLF，HC―4のI．Iは 添 加 濃 度 が0． 5斗g/mlか ら 上 昇 し 、 一 元 分 散 分 析 で 有 意 差 が あ っ た （p〈O．0001，P＝0．0253） 5．HLEは3日 後 の み 添 加 群 が 有 意 に 多 か っ た(P<O．05)。HLFは1日 後 か ら 有 意 に 増 殖 が
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抑 制 さ れ 、HC―4は3日 後 か ら 増 殖 が 抑 制 さ れ 始 め 、4日 以 降 有 意 に 抑 制 さ れ た 。
W考 察
uーPAはplasmin、W型 コ ラ ー ゲ ナ ー ゼ を 介 す る ほ か に 、 癌 細 胞 表 面 に 露 出 し たu−PA自 身 がproteaseと し て 細 胞 外 マ 卜 リ ッ ク ス の 破 壊 に 関 わ っ て い る と 考 え ら れ て い る 。 肝 細 胞 癌 で の 検 討 で はu―PA高 産 生 性 のHLEが も っ と も 高 いhlatrigel浸 潤 能 を 示 し た が 、 低 産 生 性 のHCー4の 浸 潤 能 は 低 か っ た 。HLFのu‐PA産 生 能 はHLE、HC−4の 中 間 で あ り 、 浸 潤 能 も 中 間 で あ っ た 。u―PA低 産 生 性 のHC―4を 用 い たInvas ion ass ayでTwo chainu−PAを添 加 し た と こ ろ 、 低 濃 度 で もXatrigel浸 潤 能 は 上 昇 し た 。u−PA高 産 生 性 のHLEはu‐PA添 加 に よ り 浸 潤 能 は わ ず か に 上 昇 し た の に 比 し 、HLFは 低 濃 度 か ら 浸 潤 能 が 明 ら か に 上 昇 し た 。 こ れ はHLEは す で に 自 身 の 産 生 す るu‐PAに よ っ て 高 い 浸 潤 能 を 持 っ て い る た め と 考 え ら れ た 。 こ れ ら の 結 果 か らin vitroで はu−PA産 生 能 は 肝 癌 細 胞 の 浸 潤 能 と 密 接 な 関 係 が あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。
u‐PAの 細 胞 増 殖 効 果 はEGFの 約28％ に す ぎ な ぃ こ と か ら 、 今 回 の 実 験 で は 明 か な 増 殖 効 果 を 示 さ な か っ た も の と 考 え ら れ た 。u−PA産 生 が 低 いHC―4、HLFがu‐PAの 添 加 に よ り 増 殖 が 抑 制 さ れ た 。 そ の 原 因 と し て 、 こ れ ら の 細 胞 で は そ の 阻 害 物 質 で あ るPAI−1、PAI−2 の 産 生 能 が 同 様 に 低 く 、 過 剰 なu‑PAのproteolysisに よ っ て 増 殖 が 抑 制 さ れ た 可 能 性 も あ り 今 後 さ ら に 検 討 す る 必 要 が あ る 。
V結 語
肝 癌 細 胞 に つ い てin vitroに お け るu−PA産 生 能 と 、 浸 潤 能 を 検 討 し 以 下 の こ と が 判 明 し た 。
1． 細 胞 あ た り の u― PA産 生 能 は HLE、 HLF、 HC‐ 4の 順 に 高 値 で あ っ た 。 2．In vitro浸 潤 能 はHLE、HLF、HC‐4の 順 に 高 く 、 浸 潤 能 はu‐PA産 生 能 の 準 に 一 致 し て お りu−PAが 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
3． two chain u‑PA添 加 に よ り u− PA低 産 生 性 細 胞 株 の 増 殖 は 抑 制 さ れ た 。
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学位論文審査の要旨 主査 教授
副査 教授 副査 教授
内野 純 一 葛巻 暹 上出 利 光
学 位 論 文 題 名 ． 肝癌細胞の浸潤・増殖と
urokinase type plasmlnogenaCtiVator
urokinaSetypeplaSminogenaCtiVator （u 一 PA ）はplaSminogen をpl asmln に変換し、 W 型コラーゲナーゼの活性化を介して基底膜、細胞 外マトリ ックスを破壊 するとされている。 またu ← PA の G ドメイン は EGF と高いホモロジーを示すためそれ自体細胞増殖作用を有するこ とも報告されている。一方、肝細胞癌患者の血中 u −PA が高値を示す ことが知られており、肝細胞癌の転移にu − PA の関与が推測される。
本研究で は invitr0 で 肝癌細胞を用いてu − PA の産生能と浸潤、増 殖がいかなる関係を持っか検討した。
研究方法
1 ）肝癌細胞株の培養
肝 癌細胞株として北大第一外科で樹立した HC ― 4 と理化学研究所ジ ー ンバンクから購入した HLE 、 HLF を使用した。培養液には 10%FCS 加 R PMI1640 を用い、 37 ℃、5%C02 で培養した。
2 ）培養上清
各 細胞株をフラスコに播種、単層培養しconfluent になったあと、
PBS で 3 回 洗浄 後、 無 血清 条 件で 48 時 間培 養した。培養 上清を遠沈 し 測 定 試 料 と し た 。 同 時 に フ ラ ス コ 内 の 生 細胞 数を 算 定し た 。 3 ）u ーPA 、t ー PA 、PAI −1 、2 の測定
u ーPA 、PAI ―1 、 PAI −2 はTint Elize Kit(Biopool 社製）を用いて測定 し た 。 t ― PA は Immurizet 一 PA Kit （ Biopool 社製 ） を用 ｀ヽ た 。
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5 ） Invasion assays
Transwell （ Coster ， 6 ． 6mm diameter ，8 ル mpore size ）を使用した。
可 溶 性 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス (Matrigel ） を 冷 却し た 無血 清 のRPMI1640 に 希 釈 溶 解 し 、 蛋 白 濃 度 を 30 ル g/100pl に 調 整 し た 。 こ の 希 釈 溶 液 100 ル 1 を Transwell の フ ィ ル タ ー に 被 覆 し 使 用 し た 。 Transwell の 上 槽 upper compa や tment に 2X105 個 /ml に 調整 し た 細胞 浮 遊 液 を 100pl 、 下 槽 に は fibronectin 20 ル g/ml を 含 む 10%FCS 加 RPM 11640 を 600 ル 1 を 加 え 、 37 ℃ 、 5%C02 で 培 養 し た 。 3 日 間 培 養 後 、 上 下 の 両 槽 の 培 養 液 を MTT 溶 液 と 交 換 し 、 3 時 間 培 養 し た 。 フ ィ ル タ 一 上 面 の 非 浸 潤 性 細 胞 、 フ ィ ル タ 一 下 面 お よ びTranswell 下 槽内 に 落下 し た 浸 潤 性 細 胞 を dimethylsulfoxide に 溶 解 した 。 吸光 度 はEasy Rea der で 波長 540nm を用い測 定した。 Invasion Index （ I ． I ） は、浸潤性 細 胞 の 吸 光 度 を 浸 潤 性 細 胞 と 非 浸 潤 性 細 胞 の 吸光 度 の和 で 割 り、 100 を 掛けたも のとし％で 表した。
検討項目
1 ） 各 細 胞 株 の u ― PA 、 t 一 PA 、 PAI − 1 、 PAI − 2 産 生 能 2 ） 細 胞増 殖 に 伴う 培 養液 中 u − PA 、 t ― PA 、 PAI ―1 、PAI − 2 濃度の 変動 10%FCS 加 RPMI1640 に 浮 遊 さ せ 、 ixi05 個 /ml に 調 整 後 1 ウ エ ル にっ き 細胞 浮 遊液 各 Iml を 入れ た 。1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 日後 に生細胞数 を 算 定 し 、 増 殖 曲 線 を 作 成 し た 。 培 養 上 清 を 測 定 試 料 と し た 。 3 ）各 細胞株のin vitro にお ける浸潤能
4 ）外 因性u ― PA の浸潤に対 する影響
Transwell の上 槽 内 へ酵 素 活性 を 有す る two chainu ― PA を 0 ． 5 ル g/m 1 ， 1 ． 0 ル g/ml ， 5 ． 0 ル g/ml ， 10 ． 0 ル g/ml 添 加 し、 I ． I を 測 定し た 。 5 ）外 因性u ー PA の細胞増殖 に対する影 響
各 穴 に ixi05 個/ml の10%FBS 加RPMI1640 の 細胞 浮 遊液をIml ずつ入れ、
24 時 間 培 養 後 two chainu − PA を 5 ． 0 ル g/ml 含 む 1%FCS 加 RPMI1640 と含 ま な ぃ も の に 交 換 し 、 1 、 2 、 3 、 4 、 5 日 後 に 生 細胞 数 を算 定 した 。 ．
研究結果
1 ） u ーPA 濃度はHLE ，HLF ， HC ―4 で、それぞれ 603 ．0 土 7 ，9ng/ml/106 個、
356 ． 7 土10 ． Ing/m 1/106 個、Ong/ml/106 個であった。t ―PA は1 ．90 土0 ．7
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8ng/ml/106 個 、 2 ． 03 土0 ． 38ng/ml/106 個 、 Ong/ml/106 個であった 。 PA I − 1 はそれぞれ2733 ． O 土72 ． 3ng/ml/106 個、1378 ．3 土26 ． 4ng/ml/106 個、
24.7 土 8 ． Ing/ml/106 個であり、PAI −2 は 50 ．6 土 2 ．5ng/ml/106 個、10 ． 6 土 O ． 6ng/ml/106 個、Ong/ml/106 個であ った。u −PA 、 t ―PA 、 PAI ―1 、PA I ― 2 のいずれも一元分散分析で有意差を認めた。(P<O ．0001 ， P=O ．0043 ， P く Ol 0001 ，P く0 ．0001 ）
2 ） い ず れ の 増 殖 期 で も HLE 、 HLF 、HC − 4 の 順 に有 意 に細 胞 あた り のu
― PA 、PAI −1 産生能は高値を示した。
3 ） HLE 、 HLF 、HC 一 4 のI ． I は30 ．1 土9 ．5% 、18 ．8 土O ． 9% 、11 ．0 土2 ．5% で あ り 、一 元 分散 分 析で 有 意差 を 認め た （p=0 ．015 ） 。 Matrigel への 浸 潤能はu −PA 、PAI ―1 産生能に相関した。
4 ） HLE のI ． I は two chainu − PA の添 加 で変 化 しな か った 。 HLF ， HC − 4 の I ．I は 添加 濃 度が O ． 5 ル g/ml から 上 昇し 、 一元 分 散 分析 で 有意 差 が あった（ p<0 ．0001 ，P − O ．0253 ）
5 ） HLE は3 日 後の み 添 加群 が 有意 に 多か っ た（ P<O ． 05 ） 。 HLF 、HC ― 4 は増殖が有意に抑制された。
以上 よ り、 浸 潤能 は HLE 、 HLF 、HC ― 4 の 順 に高 く 、u ― PA 産 生 能に 相 関 し てお り 、u − PA の 添加 に より 浸 潤 能が 上 昇し た こと か らu − PA が 肝 癌 細 胞 の 浸 潤 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆さ れ 、さ ら に u ― PA 産 生 能が 低 い 細 胞 株 は u − PA 添 加 に よ り 増 殖 が抑 制 さ れる こ とが 示 唆さ れ た。
審査 にあたり、 葛巻教授よ りinhibitor である PAI ー1 ， PAI ―2 と浸潤能 と の 関係 に つい て 、上 出 教授 よ り各 細 胞株 の u − PA receptor の 発現 状 況 に ついて 、などの質 疑があった が申請者は 概ね妥当な 回答を行っ た。
本 研 究 で は 、 u ― PA は 肝 癌 細 胞 株 でも 産 生さ れ 、肝 癌 細胞 の 浸潤 能 に 関 与し て いる こ と、 u 一 PA 低産 生 性 細胞 株 の増 殖 はu ― PA に より 抑 制 さ れ る こ と を 示 唆 し た 点 で 意 義 が あ り 、 博 士 （ 医 学 ） の 授 与 に 値 す るものと考える。
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