博士（医学）町田正晴 学位論文題名
日本における肥大型心筋症の遺伝学的異質性 学位論文内容の要旨
｜．背景および目的
肥 大型心筋症 (HCM) は原因不明の心肥大を特徴とし，それに伴う心血行動態的，電 気生理学的異常を生じる心疾患である．しかし無症状に経過し突然死の剖検で初めて 診断されることも多く，心突然死の重要な疾患のーっとしても知られている．よって 本疾患を早期発見し突然死のhigh risk 群を検出しようとする試みがなされてきた．一 方HCM 患者の約半数例は家族歴を有し，常染色体優性遺伝の形式を取る．これらの症 例は 家族性 HCM(FHCM) と定義されるが，他の家系より予後の悪い家系が存在し，この 違い は遺 伝学 的な 差異 によ るも のと考えられてきた．近年 FHCM の遺伝学的原因のー っと して 心筋 p ミ オシン 重鎖 （p ‑MHc) 遺 伝子 内のmissense mutation が報告され，
Caucasian のHCM を対象とした調査で，FHCM 患者の約30.40% に同遺伝子内のnussense mutation が関与していると報告されている．またmissense mutation の種類により予後が 異なるとの報告もあり，新たな予後規定因子を決定できる可能性も示されている．し かし他の遺伝子との連鎖の報告も多く，本疾患の遺伝学的多様性が示唆されている．
本邦 HCM 患者 を対 象とし た調 査で は当 科と 九州 大学 のグ ルー プより 18 番染色体上の DNA マーカー PAI ，B との連鎖が報告されているが，本疾患が遺伝学的多様性を持 つ疾患であり，また調査した家系の規模が比較的小規模のものであることから，連鎖 解析のみでは原因遺伝子の同定は困難である．また連鎖解析で有意な連鎖が出ないこ とは必ずしも原因遺伝子が存在しないことを意味しない．よって本研究では本邦では 大 規 模 な 調査が 殆ど なさ れて いな い心 筋p ‑MHc 遺伝 子の 異常 の有 無を調 査す るこ とを目的とし，以下の方法でp ‑MHC 遺伝子を調査した．また加えて最近疾患との連鎖 が報告された2 種類のDNA マーカーに対し連鎖解析を施行した．
II ．対象と方法゛
北海 道大 学循 環器内科でフオローされ，家族歴濃厚な FHCM16 家系の内患者37 名、
境界型10 名，正常者45 名，孤発例と思われる28 名を対象とした，パラフイン包埋組織よ り DNA を 抽出 した 1 例 を除い ては ，末 梢血 有核 細胞よりDNA を抽出た.primer は心筋p
―MHC 遺伝子のexon3 から25( 計23exon) ，各exon を挾むように設計し，5 末端を32P でラベ
ルした，回収したゲノムDNA をtemplateDNA としPCR を行い，反応終了後の溶液 15 メ1 に
60メl denaturing solution(含95 %formamide)を加え，加熱変性後，5ワ。非変性ポリアクリル ア ミド ゲル （5ワ 。の グリ セロ ール を含 む） で，0.5XのTBEbufferを使用し牟5時 間，40Wで 電 気 泳 動 し 多 型 を 検 出 し た ． 疾 患 に 一 致 し て 多 型 の 認 め ら れ た 対 象 のexonはPCR産 物 からPCR primerをsequencing primerとし，cycle sequencing法で塩基配列を決定した．
missense mutationの 認 め ら れ たexonに 対 し て は 正 常 お よ び 変 異 塩 基 配 列 に 特 異 的 な oligonucleotide probeを 合 成 し ， 変 異 の 認 め ら れ た 家 系 構 成 員PCR産 物 に 対 しdot blothybddiz甜onを 行 っ た ． ま た 更 に ，FHCM患 者 とQ連 鎖 が 示 さ れ て い る1番 ふ1番染 色 体 上 のDNAマ ー カ ーF13B，D11S916（AMF185yal） を 既 報 の 条 件 で 増 幅 し ，5％変 性ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 で 多 型 を 検 出 し た ． 検 出 さ れ た 多 型 を コ ン ピ ュー ター プ ロ ダ ラ ムLIPEDに よ りmseasepene曲nce90ワ。 ，prevalenceO．o002で10d値を 算出 した ． 各 多 型 の 頻 度 は ， 非 疾 患 者 で あ る 配 偶 者24名 よ り 算 出 し た ． ま た 本 症 は 年 齢依 存性 の 発 症 様 式 を 示 す の で16才 以 上 の 症 例 を 対 象 と し ， 病 歴 不 明 な 第 一 世 代 に つ いて は常 染 色 体 優 性 遺 伝 形 式 を 示 す こ と よ り ， い ず れ か 一 方 を 発 症 者 と し て 計 算 し た ．
川‐結果および考察
PCR‑SSCP法 に よ る 解 析 の 結 果 ，exon19，20，24に の み 疾 患 に 一 致 し て 塩 基 配 列の 多 型を 認め(exon20の 多型 は家 系XIに，exon19，24の 多型 は家 系VHに同 時 に， またexon24の 多型 は一 孤発 例に も認 めた ），exon24の 孤 発例 に認 めら れた多型 はhon10−姐enc，その他 の 多 型 はhe缸 か 皿eHcで あ る と 考 え ら れ た ． 心 筋p‐MHC遺 伝 子 は 計40exonよ り な る 遺 伝 子 で あ る が ， 現 在 ま で 報 告 さ れ たrnissenSemutabonの ほ と ん ど は 心 筋p‐MHC蛋白 の 機 能 上 重 要 な 部 位 を コ ー ド し て い るexon025内 に 認 め ら れ て お り ， ま た こ れ 以 外 の exonに お け る 異 常 がHCMの 発 症 に 関 与 し て い る 決 定 的 な 証 拠 は な い ． し た が っ て exon3〜 ・25を 解 析 し た こ と に よ り ，HCMの 原 因 と な る 心 筋p‐MHC遺 伝 子 の 異 常 をほ ぽ 確実に検出できたと考える．
こ れ ら の 多 型 に 対 す る 直 接塩 基配 列法 によ る解 析で ，一 家系 （家 系XI） にの みexon20内 にrnissensemutぬon（codon741：ayGGG→rgAく給 ）が認められ，dotblothybddizaIionによる 解 析 で こ のmutぬonが 患 者 に 特 異 的 で あ りmomo‐aueHcに 生 じ て い る こ と が 確 認 さ れ た ．exon20は 心 筋p‐MHC蛋 白 の ア ク チ ンbindingsi他を コー ドし て おり ，ま た変 異に よ ルア ミノ 酸の 電化 がneutralからbaSicに 変 化し てお り， 蛋白分子 の構造上，機能上大きな 変 化 を も た ら し た と 考 え ら れ る ． ま た 家 系XIは 後 述 す る よ う にPALB，F13B，D11S916 と のlod値 が 殆 どO以 下 で あ り ， 本mut虹onがFHCMの 原 因 と 考 え ら れ た ． ま た 家 系XIの 患 者 は 治 療 を 有 す る 不 整 脈 を 有 し て お り ， 既 死 亡 の た め 調 査 で き な か っ た2名 の 患 者 は 流 出 路 狭 窄 の た め 心 筋 切 除 術 を 施 行 さ れ て お り ， ア ミ ノ 酸 電 化 の 変 化 が 予 後 に影 響 するという報告と一致した．
一 方eX0n19，eX0n24内 の 多 型 はSynOりmouSmutぬOn（codon715：Ty´TAC→ n TAT，codon989：IleAn、→n。ATC）であった，このnlut弧onは丘加esinなども生じさせず現 時 点 で はFHCMの 原 因 と は 考 え に く い が ， 一 般 的 な 多 型 と し て は 他 の 対 象 に 認 め ら れ なか ったこ と，家系内の多型の遺伝としては，全く関係のない一孤 発例にも認められるこ，
とから，なんらかの機序でHCM 発症に関与している可能性は否定できないと考える．
以 上の結 果よ り本 邦FHCM の 原因 とし て心 筋p‑MHC 遺 伝子 のmissense mutation が 関 与していることが判明したが，その頻度はCaucasian と比較して明らかに低いものであっ た．またCaucasian のFHCM で連鎖の認められたマーカーを使用しての連鎖解析でも．ロ
=0.001 におけるlod 値が‑2.0 以下となり完全に連鎖の否定できる家系をF13B で3 家系，
AM F185yal で4 家系認め，またその他lod 値が低値な家系の存在も考えあわせると，一 部lo （値が高値な家系も存在したが，本邦においてこれらの部位近傍に原因遺伝子を 持つFHCM の割合は低いと考えられた．
しか しこ のよ うな 遺伝 学的異質性にも関わらず疾患として明らかな差を認めないこ とは 興味 深い こと であ る．心肥大は病理学的検討より心筋p ―MHC 蛋白の異常によっ て生じた二次的なものであるとする報告がある．この報告から考えると他の蛋白の異 常によっても同様の病態を示す可能性がある．また本研究の対象家系にも同一家系内 で心肥大の形式が異なるものがあり，心肥大には遺伝学的要因のほかに他の物理的，
環境的要因が影響していることが考えられる．ただ一般的に他の要因の影響が少ない と思われる若年発症例の予後が悪いことから考えると，予後には原因となる変異蛋白 の 種 類 で は な く ， 蛋 白 の 機 能 異 常 の 程 度 が 関 与 し て い る も の と 考 え ら れ た ．
IV ．結語
1)FHCM16 家系を対象とした調査で，心筋p‑MHC 遺伝子内のmissense mutation を有し た家系が1 家系存在し，本邦においても心筋p ‑rvn‑Ic 遺伝子のmissense mutation を原因 とす る家 系が存在することが証明され，本邦におけるHCM が遺伝学的に同一の疾患 でないことが示された．
2)‑L 筋p‑MHc 遺伝子内のmissense mutation を有した家系はCaucasian のHCM を対象と した調査と比較するとその数は明らかに低く，主たる原因遺伝子がCaucasian HCM と は異なることが示唆された，
3 ）連鎖解析上F13B ，D11S916 との有意な連鎖は認められず，また完全に連鎖の否定でき
る 家系 も存 在し たことから，これらの近傍に原因遺伝子を持つFHCM の割合は低いも
のと考えられた．
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
日本における肥大型心筋症の遺伝学的異質性
I． 背 景お よ び 目 的
肥 大 型 心筋 症(HCM)は 原 因 不 明の 心 肥 大 を特 徴 と し ，そ れ に伴う 心血行 動態的 ，電気 生理学 的異 常を 生 じ る 心疾 患 で あ る． し か し 無症 状 に 経 過し 突 然 死 の剖 検 で 初 めて 診 断 さ れる こと も多く ， 心 突 然 死 の 重 要 な 疾 患 の ー っ と し て も 知 ら れ てい る ． よ って 本 疾 患 を早 期 発 見 し突 然 死 のhigh risk群 を検 出 し よ うと す る 試 みが な さ れ てき た ． 一 方HCM患 者の約 半数例 は家族 歴を有 し，常 染色 体 優 性 遺 伝 の 形 式 を 取る ， こ れ らの 症 例 は 家族 性HCM(FHCM)と 定 義 さ れる が ， 他 の家 系 よ り 予後 の悪 い 家 系 が存 在 し ， この 違 い は 遺伝 学 的 な 差異 に よ る もの と 考 え られ て き た ．近 年FHCMの遺伝 学 的 原 因 の ー っ と し て 心 筋 ミ オ シ ンp重鎖 （p ‑MHC)遺 伝 子内 のmisense mutationが報 告 さ れ ， Caucasian HCMを 対 象 と した 調 査 で，FHCM患者の 約30400/0に 同遺伝 子内のmIssense mutationが 認 めら れ る と 報告 さ れ ， またnussense mutationの 種 類に よ り 予後が 違うと の報告も あり漸 たな予 後 規定 因 子 を 決定 で き る 可能 性 も 示 され て い る ．し か し 他 の遺 伝 子 座 との 連 鎖 の 報告 も多 く，本 疾 患 の 遺 伝 学 的 多 様 性 が 示 唆 さ れ て い る ． 本 邦HCM患 者 を 対 象 と し た調 査 で は 当科 と 九 州 大学 の グ ル ー プ よ り18番 染 色 体 上 のDNAマ ー カ ー PALB と の 連 鎖 が 報 告 され て い る が， 本 疾 患 が遺 伝学 的 多 様 性を 持 つ 疾 患で あ り ， また 調 査 し た家 系 の 規 模が 比 較 的 小規 模 の も ので ある ことか ら
，連 鎖 解 析 のみ で は 原 因遺 伝 子 の 同定 は 困 難 であ る ． ま た連 鎖 解 析 で有 意 な 連 鎖が 出な いこと は 必ず し も 原 因遺 伝 子 が 存在 し な い こと を 意 味 しな い ． よ って 本 研 究 では 本 邦 で は大 規模 な調査 が 殆 ど な さ れ て い な い 心 筋p ‑MHC遺 伝 子 の 異 常 の 有無 を 調 査 する こ と を 目的 と し ， 以下 の 方 法 で 心 筋p ‑MHC遺 伝 子 を 調 査 し た ． ま た 加 え て 最 近 疾患 と の 連 鎖が 報 告 さ れた2種類 のDNAマ ーカ ー に対 し 連 鎖 解析 を 施 行 した ．
III対象と方法
北 海 道 大 学 循 環 器 内 科 で フオ ロ ー さ れ， 家 族 歴 濃厚 なFHCM16家系 の 内 患 者37名 ， 境界 型10名，
正 常者45名 ，孤 発 例 と 思わ れ る28名 を 対 象と し た ． バラ フ イ ン 包埋 組 織よりDNAを抽 出した1例を 除 いて は ， 末 梢血 有 核 細 胞よ りDNAを 抽出 た ， 現 在ま でmlssense mutationは全て 心筋ロ‑MHC蛋白 のheadか らhead‑rod junction部をコ ードするexon内に 認めら れてい る．よっ て本研 究ではheadから head‑rod junction部 をコー ドして いるexon3‑25を各々PCR法にて 増幅し ，加熱 変性後 ，5ワ。 非変性 PAGE(5%の グリ セ ロ ー ルを 含 む ） で電 気 泳 動 し，一 本鎖高 次構造 多型(SSCP)を検出し た．疾 患に一 致 し て 認 め ら れ た 多 型 はPCR産 物 か ら 直 接cycle sequence法 で 塩 基 配 列 を 決 定 し た.mlssense mutationの 認 めら れ たexonに 対 して は 正 常 およ び変異 塩基配 列に特 異的なoligo probeを合 成し，
missense mutationの認められた家系構成員に対しdot blot hybridization analysisを行った，また更に，
顕
暹
秀
慶
畠
巻
田
北
葛
安
授
授
授
教
教
敦
査
査
査
主
副
副
FHCM患者との連鎖が報告されたDNAマーカーF13B(lq)，D11S916(llp‑q)を既報の条件で増幅し，
5%変 性PAGE電 気泳 動 で 多型 を検出し た．検 出された 多型と疾 患との 連鎖をコ ンピュ ーター プログラムLIPEDによりdisease penetrance 90%，disease prevalence 0.0002でlod値を算出した．
III.結果お 察
PCR‑SSCP法による解析の結果，exon19，20，24にのみ，疾患に一致して塩基配列の多型が認めら れた(exon20の多型は家系XIに，exon19，24の多型は家系VIIに同時に，またexon24の多型は一孤発例 に).PCR‑SSCP法上はexon24の孤発例に認められた多型はhomo‑allelic，その他の多型はhetero‑allelic であると考えられた‥これらの多型に対する直接塩基配列決定法による解析で，一家系（家系XI) にのみexon20内にmissensemuぬtion（codon741：GlyGGG→ArgAGG）が認められ，dotblothybndization による解析でこのmutanonが患者に特異的であり， hetero゜mlelicに生じていることが確認された．
exon20は心筋p‐MHC蛋白のアクチンbindingsiteをコードしており，また変異によルァミノ酸の電 化がneuロmからbasicに変化しており，HCMの発症に関与したと考えられた，ー方exon19，exoだ4内 の多型はsynonymousmutadon（codon715：TyrTAC→TyrTAT，codon989：IleATT→IleATC）であった．こ のmu仏虹onは丘amesiftなども生じさせず現時点ではFHCMの原因とは考えにくいが，ー般的な多型 としては他の対象に認められなかったこと，家系内の多型の遺伝としては，全く関係のないー孤 発例にも 認めら れること から， なんらか の機序でHCM発 症に関与 している可能性は否定できな いと考えた．またCaucaSianFHCMで連鎖の認められたマーカーを使用しての連鎖解析でも，ロ＝O． 001におけるlod値が‐2．O以下となり完全に連鎖の否定できる家系をF13Bで3家系，D11S916で4家 系認め，またその他lod値が低値な家系の存在も考えあわせると，本邦においてこれらの部位近傍 に原因遺伝子を持つFHCMの割合は低いと考えられた．
以上の結 果より 日本人HCM患者の一部が，心筋ロ・MHC遺伝子内のmissensemuぬnonを有するこ とが判明したが，その存在率はCaucasianHCMと比較すると16家系中1家系と明らかに低く，また連 鎖解析上 もF13B，D11S916との 連鎖傾向 はみとめられず，日本人HCMとCaucasianHCMとは主たる 原因遺伝子が異なることが示唆された．
口頭発表の審査会におぃて葛巻教授よりmissensemuぬdonの結果生じる変異蛋白質の機能上，構 造上の解析について，今回調査を行わなかったexon26 40およびintron内の変異の可能性の有無に ついて， 他の心 筋収縮蛋白異常とHCM発症との関与の可能性について質問がなされた，また安田 教授より孤発例の遺伝学的意味，遺伝子診断への応用の可能性について質問がなされたが，これ らに対し申請者は概ね妥当な回答を行った．その後，行われた葛巻，安田両審査教授との試問にお いても，概ね妥当な回答がなされた．
本研究で は日本 人肥大型 心筋症 患者を対 象に詳細 な遺伝 学的検討 を行い，日本人HCMの原因の ーっとして，心筋p−MHC遺伝子のmlssensemuぬnonを同定した．また同時に日本人HCMにおいて，
同遺伝子 のmlssensemuぬnonの存 在率が低 いことを示し，加えて連鎖連鎖の結果よりCaucaSian HCMと主 たる遺 伝学的原因が異なる可能性を示したものであり，有意義な研究と考えられ，学位 授与に値する．
