導電性中 空 糸膜を 用 いた病原性微 生物

導電性中 空 糸膜を 用 いた病原性微 生物

からの遺伝子抽 出に関す る研究

2001

年

^月

北海 道工業大 学大学院

菅原 俊継

目次

第

章 序論 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

第

章 病原性細菌・ウイルスによる感染症の診断法 ・・・・・・・・・・・・

感染症診断の流れ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

感染症の代表的な診断法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

2.2.1

培養法

2.2.2

鏡検法

2.2.3

抗原および抗体測定法

2.2.4 PCR

法（遺伝子診断法）

第

章 遺伝子診断法における従来の核酸抽出法 ・・・・・・・・・・・・・・

核酸 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

3.1.1 DNA

の構造と機能

3.1.2 RNA

の構造と機能

3.1.3

ウイルスの核酸

3.2

従来の核酸抽出法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

3.2.1

化学的抽出法

3.2.2

磁性粒子を用いた抽出法

3.3

導電性中空糸膜を用いた電流通電による殺菌・細胞内物質の抽出 ・・

3.3.1

導電性中空糸膜を用いた電流通電による殺菌

3.3.2

導電性中空糸膜を用いた電流通電による細胞内物質の抽出

第

章 導電性中空糸膜の電流通電による殺菌法を応用した大腸菌

遺伝子の抽出 ・

細菌 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4.1.1

細菌の構造と機能

4.1.2

供試細菌

4.2

細菌操作の基礎 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4.2.1

細菌操作に使われる器具や培養基の滅菌および殺菌法

目 次

4.3

導電性中空糸膜の概要 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4.3.1

金属の被覆方法

4.3.2

膜構造

4.3.3

モジュール化

4.4

実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4.4.1

導電性中空糸膜を用いた遺伝子の抽出法

4.4.2 PCR

（ポリメラーゼ連鎖反応）法

4.4.3

ゲル電気泳動法

4.5

実験結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4.5.1

大腸菌

単独試料からの遺伝子抽出

4.5.2 SDS

（ドデシル硫酸ナトリウム）を利用した遺伝子抽出

4.5.3

抽出サンプルの純度

4.5.4

他細菌が混合された試料からの遺伝子抽出

4.5.5

糞便試料からの遺伝子抽出

4.6

検討 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4.6.1

電流通電による殺菌法を応用した遺伝子抽出の機構

4.6.2 SDS

の効果

4.6.3

従来の化学的抽出法との比較

第

章 電界効果を利用した導電性中空糸膜による大腸菌

の遺伝子抽出 ・・

実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

5.1.1

電界効果を利用した遺伝子の抽出法

5.1.2

遺伝子の濃縮法

5.2

実験結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

5.2.1

電界効果を利用した単独試料からの遺伝子抽出

5.2.2

電界効果を利用した糞便試料からの遺伝子抽出

5.2.3

抽出後の遺伝子濃縮の効果

5.3

検討 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

5.3.1

電界効果を利用した遺伝子抽出法の機構

5.3.2

抽出後の遺伝子濃縮の有効性

5.3.3

従来法との比較

第

章 電界効果を利用した遺伝子抽出法のウイルスへの適用 ・・・・・・・・

ウイルス ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

6.1.1

ウイルスの構造と機能

6.1.2

ウイルスの培養と定量法

6.2

実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

6.2.1

電界効果を利用したウイルス遺伝子の抽出と濃縮法

6.2.2

導電性中空糸膜のウイルスに対する濃縮効果の測定法

6.3

実験結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

6.3.1

電気的および物理的抽出法の有効性

6.3.2

電界強度と印加時間の最適条件

6.3.3

導電性中空糸膜のウイルスの濃縮効果を利用した遺伝子抽出

6.3.4

抽出後の遺伝子濃縮の効果

6.4

検討 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

6.4.1

遺伝子の抽出条件に関する検討

6.4.2

ウイルス濃縮を含めた従来の化学的抽出法との比較

第

章 結論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

研究業績・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

第 1 章

序論

有 史 以 来 人 類 は ， 地 球 を 生 命 活 動 の 場 と す る 微 生 物 と 深 く 関 っ て き た ． 現 在 の バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー ま た は 生 物 工 学 と 呼 ば れ る 技 術 は ， ま さ に 微 生 物 の 様 々 な 働 き を 利 用 し ， 化 学 工 業 ， 農 林 水 産 業 ， 医 薬 品 工 業 な ど 多 く の 産 業 分 野 で 活 用 さ れ て い る こ と は 衆 知 の 事 実 で あ る

．そ の 一 方 で ，人 類 に 対 し て 病 原 性 を 示 す 微 生 物 も 存 在 し ， そ れ ら に 感 染 す る こ と で 我 々 は ， 様 々 な 疾 病 に 脅 か さ れ て き た ． こ の よ う な 微 生 物 の 中 に は 生 命 に 関 わ る 重 大 な 感 染 症 を 引 き 起 こ す も の も 数 多 く 存 在 し ， そ の よ う な 病 原 性 微 生 物 と は 古 く か ら 争 い 続 け て き た

．

近 年 ，微 生 物 学 ，免 疫 学 ，分 子 生 物 学 ，遺 伝 子 工 学 な ど の 発 展 に 伴 っ て ， こ の よ う な 病 原 性 微 生 物 の 感 染 症 に 対 す る 診 断 技 術 や 治 療 法 が 格 段 に 向 上 し た こ と で ， 適 切 な 診 断 や 治 療 が 行 わ れ る よ う に な り ， 感 染 症 の 驚 異 は 大 幅 に 減 少 し た ．

従 来 の 診 断 法 は ， 微 生 物 学 的 な 培 養 検 査 に よ っ て 行 な う の が 主 流 で あ っ た ． こ の 培 養 に よ る 診 断 法 は ， 多 種 類 の 培 地 や 異 な っ た 培 養 法 が 必 要 で ， 確 定 診 断 を 行 う た め に は 長 時 間 を 要 す る 欠 点 が あ っ た ． ま た ウ イ ル ス は 自 己 増 殖 機 能 を 持 た な い た め ， 培 地 上 で は 増 殖 で き ず ， 生 き た 特 定 の 細 胞 に 感 染 し ，そ の 機 能 を 利 用 し て 増 殖 す る ．し た が っ て ，ウ イ ル ス 疾 患 の 場 合 ， 感 染 可 能 な 細 胞 の 培 養 も 必 要 で あ っ た ． さ ら に ， ウ イ ル ス の 種 類 に よ っ て は ， 増 殖 効 率 の 高 い 細 胞 が 見 出 さ れ て い な い も の も あ り ， そ の よ う な ウ イ ル ス で は ， 培 養 に よ る 診 断 法 が 未 だ に 確 立 さ れ て い な い の が 現 状 で あ る ． こ の よ う に ，培 養 法 は 多 く の 労 力 と ，少 な く と も

日 以 上 の 検 査 時 間 を 要 し て い た

． 特 に 診 断 に 長 時 間 を 要 す る 欠 点 は ， 病 原 性 微 生 物 に 体 内 で の 増 殖 時 間 を 与 え る こ と に な り ， ひ い て は 症 状 の 悪 化 を 招 い て い た ． 例 え ば ， 大 腸 菌

の よ う に 極 め て 毒 性 の 高 い 毒 素 を 産 生 す る 病 原 性 微 生 物 の 場 合 に は ，診 断 の 遅 れ が 患 者 を 死 に 致 ら せ る 危 険 性 も 指 摘 さ れ て い た ．

こ の よ う な 背 景 か ら 最 近 で は ， 迅 速 か つ 簡 便 な 抗 原 お よ び 抗 体 を 利 用 し

た 免 疫 学 的 手 法 や ， 病 原 性 微 生 物 の 遺 伝 子 を 直 接 検 出 す る 遺 伝 子 工 学 的 手

法 が 頻 繁 に 用 い ら れ る よ う に な っ た

．前 者 は ，微 生 物 す な わ ち 抗 原 と ，

第1章 序 論

こ れ に 対 応 し て 体 内 で 産 生 さ れ る 抗 体 と の 非 常 に 鋭 敏 な 反 応 （ 抗 原 抗 体 反 応 ）を 利 用 し た 方 法 で ，多 く の 微 生 物 感 染 症 に 対 し て 有 効 で あ る ．し か し ， 本 法 は 病 原 性 微 生 物 を 検 体 か ら 直 接 検 出 す る の で は な く ， 感 染 の 結 果 体 内 に 生 じ た 変 化 を 捕 ら え る も の で あ り ，感 染 後 ，診 断 が 可 能 に な る ま で に

ヶ 月 以 上 か か る よ う な 感 染 症 で は ，そ の 間 ，誤 っ た 診 断 が 下 さ れ る こ と も あ っ た

． こ れ に 対 し て 後 者 の 遺 伝 子 診 断 法 は ， 検 体 中 の 病 原 性 微 生 物 か ら 直 接 遺 伝 子 を 検 出 す る た め ，原 理 的 に そ の よ う な 誤 診 を 防 ぐ こ と が で き ， 臨 床 学 的 価 値 の 高 い 診 断 法 と さ れ て い る

．

一 般 に 遺 伝 子 診 断 は ，

）病 原 性 微 生 物 か ら の 遺 伝 子 抽 出 ，

）遺 伝 子 の 増 幅 ，

）ゲ ル 電 気 泳 動 ・ 染 色 ，

）判 定 の 順 序 で 行 わ れ る ．遺 伝 子 診 断 法 が 今 日 の よ う に 普 及 し て き た の は ，

） に 挙 げ た 遺 伝 子 増 幅 技 術 が 急 速 に 進 歩 し ，自 動 化 さ れ て き た こ と に あ る

．し か し ，遺 伝 子 診 断 に お い て 必 要 不 可 欠 な

） の 遺 伝 子 抽 出 の 自 動 化 は ， そ れ ら の

工 程 の 中 で 最 も 遅 れ て い る

． 現 在 ， 主 に 用 い ら れ て い る 遺 伝 子 抽 出 法 は 化 学 的 手 法 で あ る が ， そ の 操 作 は 繁 雑 で あ り ， 熟 練 を 要 す こ と か ら 自 動 化 が 非 常 に 難 し い ． ま た 化 学 物 質 の 中 に は 有 機 溶 媒 が 含 ま れ て い る も の も あ り ， 取 り 扱 い に も 十 分 に 注 意 を 払 わ な け れ ば な ら な い

．

こ れ ま で に 北 海 道 工 業 大 学 大 学 院 応 用 電 子 工 学 専 攻 生 体 電 子 ・ シ ス テ ム 工 学 部 門 （ 以 後 ， 当 研 究 室 と 呼 ぶ ） で は ， ポ リ プ ロ ピ レ ン 性 多 孔 質 中 空 糸 膜 に 金 属 を 被 覆 し た 導 電 性 中 空 糸 膜 に 通 電 す る こ と で ， 膜 に 捕 捉 さ れ た 細 菌 が 殺 菌 さ れ る こ と を 見 出 し て い る ． ま た そ の 際 ， 核 酸 な ど の 細 胞 内 物 質 の 漏 出 が 確 認 さ れ ， 殺 菌 機 構 は 通 電 に よ る 細 胞 膜 破 壊 で あ る こ と が 示 さ れ て い る

． そ こ で ， こ の よ う な 電 流 通 電 に よ る 殺 菌 の 機 構 と 細 胞 内 物 質 の 漏 出 現 象 の 両 者 を 考 慮 し て ， 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 電 流 通 電 に よ る 殺 菌 法 が 遺 伝 子 抽 出 の 新 し い 方 法 に な り 得 る も の と 考 え た ．

本 論 文 で は ， 第 一 の 研 究 目 的 と し て 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 電 流 通 電 に

よ る 殺 菌 法 に 基 づ い て ， 全 く 新 し い 遺 伝 子 抽 出 の 可 能 性 を 具 体 的 に は じ め

て 検 討 し て い る ． そ の 際 ， 我 が 国 で も 毎 年 の よ う に 報 告 さ れ て い る 大 腸 菌

O157

に よ る 感 染 症（ 食 中 毒 ）は

，そ の 毒 性 の 強 さ か ら 迅 速 な 診 断 が 特 に 必 要 と さ れ て い る た め ， 大 腸 菌

を 供 試 細 菌 と し て 選 択 し た ． 最 終 的 な 目 的 は 患 者 の 糞 便 か ら 直 接 大 腸 菌

遺 伝 子 を 抽 出 す る こ と で あ る が ， 基 礎 的 知 見 を 得 る た め に ま ず 大 腸 菌

の み が 入 っ た 試 料 ， 次 い で こ れ に 夾 雑 細 菌 が 含 ま れ た 混 合 試 料 ， 最 後 に 実 際 の 糞 便 試 料 と い う よ う に 段 階 を 踏 ん で 検 討 し た ．最 初 の 大 腸 菌

の み の 試 料 を 用 い た 実 験 か ら ， 導 電 性 中 空 糸 膜 に 電 流 を 流 し ， 同 時 に 蒸 留 水 を 吸 引 す る こ と で ， 膜 に 捕 捉 さ れ た 大 腸 菌

の 遺 伝 子 が 簡 単 か つ 迅 速 に 蒸 留 水 中 に 抽 出 さ れ る こ と を は じ め て 確 認 し た ． さ ら に ， こ の 抽 出 法 の 検 出 感 度 の 向 上 を 目 指 し て ， 遺 伝 子 抽 出 の 際 に 界 面 活 性 剤 を 使 用 し た と こ ろ ， 従 来 の 化 学 的 抽 出 法 の 抽 出 限 界 に 近 づ け る こ と が で き た ． 続 い て 混 合 試 料 ， 糞 便 試 料 に つ い て 検 討 し た 結 果 ， そ れ ら の 試 料 中 に 大 腸 菌

が

個

以 上 含 ま れ て い な け れ ば 抽 出 さ れ ず ， 単 独 試 料 と 比 べ て 二 桁 の 感 度 低 下 が 認 め ら れ た ． こ の よ う に 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 電 流 通 電 に よ る 殺 菌 を 応 用 し た 遺 伝 子 抽 出 法 は ， 従 来 法 に 比 べ て 迅 速 性 ・ 簡 便 性 が と も に 極 め て 優 れ て い た ． そ の 反 面 ， 実 際 の 感 染 症 患 者 か ら 採 取 さ れ た 糞 便 中 の 大 腸 菌

含 有 量 や 実 用 化 さ れ て い る 診 断 法 の 感 度 が

個

程 度 で あ る こ と な ど を 考 慮 す る と ，

個

程 度 の 感 度 で は 大 腸 菌

の 検 出 が 難 し い も の と 予 想 さ れ た ．

そ こ で ， 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 遺 伝 子 抽 出 に お い て ， 負 の 電 荷 を 有 す

る 遺 伝 子 の 電 気 的 性 質 に 着 目 し ， さ ら な る 感 度 の 向 上 を 目 指 し た ． 具 体 的

に は ， こ れ ま で 殺 菌 基 材 と し て 用 い た 導 電 性 中 空 糸 膜 を ， 本 研 究 で は 以 下

の よ う に 遺 伝 子 抽 出 時 の 電 極 と し て 利 用 し た ． ま ず 導 電 性 中 空 糸 膜 に 捕 捉

さ れ た 大 腸 菌

を 化 学 的 に 溶 解 す る こ と で ， 遺 伝 子 を 被 っ て い る 細 胞

膜 を 破 壊 し た ． そ の 後 ， 導 電 性 中 空 糸 膜 を 陰 電 極 と し て 電 界 を 印 加 す る こ

と で ， 膜 の 中 か ら 負 電 荷 の 遺 伝 子 を 電 気 的 に 取 り 出 す こ と に し た ． こ の よ

う に ， 通 電 が 可 能 で あ る と い う 導 電 性 中 空 糸 膜 の 特 徴 を 積 極 的 に 活 用 し ，

新 た に 遺 伝 子 抽 出 用 の 電 極 と し て 使 用 し た 結 果 ， 電 流 通 電 に よ る 殺 菌 を 応

用 し た 遺 伝 子 抽 出 よ り も

倍 高 い 感 度（

個

）が 得 ら れ ，感 度 の 向

第1章 序 論

上 に 成 功 し た ．

前 述 の よ う に 大 腸 菌

に 感 染 し た 患 者 の 糞 便 に は ， 最 低

個

の 菌 数 が 含 ま れ て お り ， ま た 現 在 使 用 さ れ て い る 診 断 法 も こ の 程 度 の 感 度 で あ る こ と か ら ， 導 電 性 中 空 糸 膜 の 利 用 法 を 全 く 別 の 観 点 か ら 捕 ら え る こ と で ， 実 用 的 な 感 度 に は じ め て 上 げ る こ と が で き た ． 従 来 の 化 学 的 抽 出 法 と 比 較 す る と こ の 抽 出 法 は ， 使 用 す る 化 学 薬 品 や 工 程 が 少 な い た め 簡 便 性 に 優 れ ， そ れ に 伴 な っ て 抽 出 時 間 も 半 分 に 短 縮 で き た ． こ の 時 間 短 縮 は 体 内 の 細 菌 の 増 殖 ， す な わ ち 症 状 の 軽 減 に 寄 与 し ， 特 に 大 腸 菌

の よ う に 生 命 に 関 わ る 感 染 症 を 引 き 起 こ す 病 原 性 細 菌 に 対 し て 非 常 に 有 効 で あ り ， 治 療 効 果 の 改 善 に 大 き く 貢 献 す る も の と 考 え ら れ る ． ま た ， 膜 の 他 に 直 流 電 源 と 吸 引 ポ ン プ と い っ た 単 純 な 装 置 で 半 ば 自 動 的 に 遺 伝 子 抽 出 が 行 わ れ る こ と か ら ， 全 自 動 化 の 可 能 性 を も 有 し て い る ． し た が っ て ， 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 遺 伝 子 抽 出 法 は ， 極 め て 単 純 か つ 安 全 で ， 自 動 化 の 可 能 性 を 有 す る 全 く 新 し い 遺 伝 子 抽 出 法 と し て ， 将 来 普 及 す る こ と が 期 待 さ れ る ． 上 記 の 大 腸 菌

と は 別 に ， ヒ ト 免 疫 不 全 ウ イ ル ス （

） や 肝 炎 ウ イ ル ス は ，長 い 潜 伏 期 間（

年 程 度 ）を 経 て 徐 々 に 免 疫 力 の 破 壊 や 肝 硬 変 を 誘 発 し ， や が て 本 人 が 体 の 異 変 に 気 付 い た と き に は 肝 癌 や

（ 後 天 性 免 疫 不 全 症 候 群 ） を 発 症 し ， 死 に 至 ら し め る 非 常 に 恐 ろ し い ウ イ ル ス で

あ る

．ま た 発 症 す る ま で の 間 に ，性 行 為 に よ っ て 二 次 感 染 を 引 き 起

こ す こ と も 多 く ，そ の 広 が り も 凄 ま じ い

．こ れ ら の ウ イ ル ス は ，

輸 血 や 血 液 製 剤 に よ っ て 感 染 す る こ と が ほ と ん ど で あ る ．

や 肝 炎 ウ イ

ル ス は 血 中 に 存 在 す る こ と か ら ， 近 年 ， 献 血 さ れ た 血 液 の 汚 染 検 査 が 実 施

さ れ る よ う に な っ て き た ． そ の た め ， 輸 血 や 血 液 製 剤 に よ る 感 染 は 年 々 減

少 傾 向 に あ る ．し か し ，

を 用 い た 遺 伝 子 診 断 法 は ，検 査 に 使 わ れ る 検

体 （ 血 液 ） 量 が 数 十

程 度 と 非 常 に 少 な い た め ，

の 血 液 バ ッ グ を

検 査 の 対 象 と し た と き ， そ の 中 に は 最 低

個 程 度 の ウ イ ル ス が 含 ま れ て

い な け れ ば 検 出 さ れ な い こ と に な る ． こ の よ う に 従 来 の 遺 伝 子 診 断 は 扱 う

検 体 量 が 非 常 に 少 な い た め ， 感 染 初 期 な ど の ウ イ ル ス 量 が 少 な い 検 体 か ら

検 出 す る こ と は 極 め て 困 難 で あ り ，

個 以 下 の 数 し か 混 入 し て い な い 血 液 は ， 安 全 な 血 液 と し て 輸 血 や 血 液 製 剤 に 利 用 さ れ る こ と に な る ． こ の よ う な 状 況 を 考 慮 す る と ， 決 し て 安 全 な 輸 血 や 血 液 製 剤 の 投 与 が 現 在 行 わ れ て い る と は 言 え な い ． そ こ で ， 導 電 性 中 空 糸 膜 の 最 大 の 特 徴 で あ る 微 粒 子 に 対 す る 高 い 捕 捉 能 力 を 利 用 す る こ と で ， こ れ ま で 全 く 行 わ れ て い な か っ た 血 中 ウ イ ル ス の 完 全 な 除 去 が 原 理 的 に 可 能 で あ り ， 安 全 な 輸 血 や 血 液 製 剤 の 提 供 が 可 能 に な る の で は な い か と 考 え た ． さ ら に は ， 血 中 ウ イ ル ス を 全 て 導 電 性 中 空 糸 膜 に 捕 捉 す る 可 能 性 も 高 い た め ， 検 査 時 に 扱 わ れ る ウ イ ル ス 量 が 従 来 法 よ り 遥 か に 多 く ， 細 菌 と 同 様 な 抽 出 操 作 を 行 う こ と で ， 血 液 提 供 者 の ウ イ ル ス 感 染 の 有 無 を 高 感 度 で 捕 ら え る こ と が で き る も の と 期 待 し た ．こ の よ う に 病 原 性 細 菌 の 他 に ，完 全 な 防 御 策 が な い

や 肝 炎 ウ イ ル ス な ど の 病 原 性 ウ イ ル ス へ の 導 電 性 中 空 糸 膜 の 適 用 を 第 二 の 目 的 と し て ， 本 研 究 で は ， 比 較 的 危 険 性 の 低 い 単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス を 用 い て ， ウ イ ル ス に 対 す る 遺 伝 子 抽 出 の 有 効 性 を は じ め て 検 討 し た ． 検 討 の 結 果 ， ウ イ ル ス に 対 し て も 同 様 に 遺 伝 子 の 抽 出 が 確 認 さ れ ， 導 電 性 中 空 糸 膜 に よ る 方 法 は 細 菌 お よ び ウ イ ル ス の 両 者 に 適 用 可 能 で あ る 画 期 的 な 遺 伝 子 抽 出 法 で あ る こ と が 判 明 し た ． さ ら に 導 電 性 中 空 糸 膜 は ， 優 れ た 捕 捉 能 力 を 有 し て お り ，非 常 に 小 さ な ウ イ ル ス ま で も 膜 に 捕 捉 で き る こ と が 明 確 と な っ た ． こ れ ら の 知 見 か ら ，本 手 法 は ，こ れ ま で 無 防 備 で あ っ た

や 肝 炎 ウ イ ル ス に 対 し て 極 め て 有 効 な 防 御 法 で あ る と 同 時 に ， 導 電 性 中 空 糸 膜 を 遺 伝 子 抽 出 用 の 電 極 と し て 用 い る こ と で ， 従 来 の 抽 出 法 と 同 程 度 の 感 度 で 遺 伝 子 抽 出 が 可 能 で あ り ，ウ イ ル ス の 感 染 防 御 と 遺 伝 子 抽 出 の

つ の 機 能 を 兼 ね 備 え た 世 界 的 に も 例 が な い 斬 新 で 画 期 的 な ウ イ ル ス 感 染 防 御 法 ・ 遺 伝 子 抽 出 法 と 言 え る ． こ の よ う に 本 論 文 で 示 し た 手 法 に よ っ て ， 従 来 法 よ り も 遥 か に 安 全 な 血 液 の 提 供 が で き ，

や 肝 炎 ウ イ ル ス 感 染 症 の 世 界 的 根 絶 に 大 き く 貢 献 で き る も の と 確 信 す る ．

以 上 の よ う に ， こ れ ま で 殺 菌 ・ 濾 過 基 材 と し て 使 わ れ て き た 導 電 性 中 空

糸 膜 を 全 く 異 な っ た 視 点 か ら 用 い る こ と で ， 病 原 性 細 菌 や ウ イ ル ス の 遺 伝

第1章 序 論

子 抽 出 ・ 感 染 防 御 に つ い て 画 期 的 な 知 見 を 得 る こ と が で き た ． ま た ， こ の 抽 出 法 は ， 従 来 法 に 比 べ て 使 用 す る 化 学 薬 品 や 工 程 が 少 な い こ と か ら 簡 便 性 ・ 迅 速 性 に 優 れ て い た ． さ ら に ， 膜 の 他 に 直 流 電 源 と 吸 引 ポ ン プ と い っ た 単 純 な 装 置 で 半 ば 自 動 的 に 遺 伝 子 抽 出 が 行 わ れ る こ と か ら ， 全 自 動 化 の 可 能 性 を も 有 し て い る ． し た が っ て 本 手 法 は ， 今 後 ， 微 生 物 感 染 症 の 遺 伝 子 診 断 や 感 染 防 御 に 大 き く 寄 与 す る も の と 考 え ら れ る ．

本 論 文 は 全

章 で 構 成 さ れ て お り ， 次 章 以 降 で は 次 の よ う な 内 容 が 取 り

扱 わ れ て い る ．第

章 で は ，病 原 性 微 生 物 に よ る 感 染 症 の 一 般 的 な 診 断 法

に つ い て ま と め た ． 第

章 で は ， 特 に そ の 中 で も 遺 伝 子 診 断 法 に 着 目 し ，

本 研 究 で 検 討 し て い る 遺 伝 子 抽 出 が ， そ の 診 断 法 に お い て ど の よ う な 位 置

づ け で あ る の か を 明 ら か に し ， さ ら に 従 来 の 遺 伝 子 抽 出 法 と ， 本 研 究 の 基

礎 と な っ た 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 電 流 通 電 に よ る 殺 菌 ， お よ び 細 胞 内 物

質 の 抽 出 に つ い て 述 べ た ．第

章 は ，導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 電 流 通 電 に

よ る 殺 菌 に 基 づ く 遺 伝 子 抽 出 法 の 有 効 性 を ， 最 も 迅 速 な 診 断 が 必 要 と さ れ

る 病 原 性 微 生 物 の 一 つ で あ る 大 腸 菌

を 用 い て 検 討 し た ． 続 く 第

章

で は ， 導 電 性 中 空 糸 膜 の 利 用 法 を 電 極 と し て 使 用 す る と い う 全 く 別 の 角 度

か ら 捕 ら え る こ と で ， 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 遺 伝 子 抽 出 の 感 度 向 上 を 目

指 し た ．さ ら に 第

章 で は ，肝 炎 ウ イ ル ス や

の 画 期 的 な 防 御 法・検 出

法 を 提 案 す る た め ， 単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス を 用 い て ， ウ イ ル ス に 対 す る 有

効 性 を 検 討 し た ．最 後 の 第

章 で は ，得 ら れ た 知 見 を 整 理 し ，そ れ ら に 基

づ い て 本 研 究 の 結 論 を 述 べ る ．

第 2 章

病原性細菌・ウイルスによる感染症の診断法

我 々 の 身 の ま わ り に は 無 数 の 病 原 性 微 生 物 が 存 在 し ， ヒ ト に

限 ら ず 動 物 や 植 物 に 感 染 し ，様 々 な 病 気 を 引 き 起 こ す ．し か し ，

微 生 物 学 ， 免 疫 学 ， 分 子 生 物 学 ， 遺 伝 子 工 学 な ど の 発 展 に 伴 っ

て ， 病 原 性 微 生 物 の 検 査 技 術 も 向 上 し ， 適 切 な 診 断 ・ 処 置 が 行

わ れ る よ う に な っ て き た ．特 に ヒ ト の 生 命 に 関 わ る 病 原 性 微 生

物 の 検 査 技 術 の 向 上 は め ざ ま し く ，数 多 く の 方 法 が 見 出 さ れ て

き た ． ま た 多 方 面 に わ た っ て 開 発 が 進 め ら れ て き た こ と か ら ，

そ の 方 法 も 多 様 で あ る ．こ の 章 で は ，そ の よ う な 病 原 性 細 菌 や

ウ イ ル ス に よ る 感 染 症 に 着 目 し ，実 際 に 行 わ れ て い る 代 表 的 な

診 断 法 と そ の 特 徴 に つ い て 述 べ る ．

第2章 病原性細菌・ウイルスによる感染症の診断法

2.1

感染症診断の流れ

一 般 的 な 病 原 性 細 菌 ・ ウ イ ル ス に よ る 感 染 症 の 診 断 は 図

の よ う に 行 わ れ る

． 医 師 の 診 察 に よ る 症 状 把 握 と 炎 症 反 応 検 査 が 第

段 階 の 感 染 症 診 断 で あ り ， 感 染 症 か 否 か を 判 断 す る ． 感 染 症 と 判 断 し た 後 ， 全 身 性 か 局 所 性 か （ ど の 部 位 か ） を 特 定 す る た め に 第

段 階 の 検 査 が 行 わ れ る ． 主 に 血 液 学 的 検 査 ， 生 理 機 能 検 査 ，

線 ，

（

），

MRI

（

）， 超 音 波 と い っ た 画 像 診 断 ， お よ び 内 視 鏡 検 査 で あ る ． 経 験 豊 富 な 医 師 で あ れ ば ， こ の 段 階 で 臨 床 診 断 を 下 せ る が ， 確 定 の た め に 第

段 階 の 微 生 物 学 ， 免 疫 学 ， 分 子 生 物 学 ，病 理 学 的 検 査 が 行 わ れ る ． た だ し ， 定 型 的 疾 患 は 初 診 時 で 経 験 的 に 判 断 し や す い た め ，第

段 階 の 医 師 の 診 察 か ら 第

段 階 の 確 定 検 査 へ 進 む 場 合 も 少 な く な い ．

図

診 断 の 流 れ

感 染 の 判 断 感 染 部 位 の 特 定 確 定 検 査 治 療 と 処 置

問診，聴診，視診 全身性か局所性か X線，CT，MRI

感 染 症 検 査 微 生 物 学 免 疫 学 分 子 生 物 学

薬 剤 投 与 処 置 （ 切 除 ・ 排 膿 ） 治 癒 判 定 検 査

2.2

感染症の代表的な診断法

医 師 に よ り 感 染 症 と 診 断 さ れ た 場 合 ， 感 染 部 位 の 特 定 を 行 っ た 後 ， 様 々 な 方 法 に よ っ て 感 染 症 検 査 が 行 わ れ る ． ま ず ， 適 切 に 採 取 し た 検 体 を 肉 眼 お よ び 顕 微 鏡 で 観 察 し ， 確 定 検 査 を 行 う べ き か 否 か を 判 断 す る ． こ こ で 得 ら れ る 患 者 情 報 （ 症 状 ， 基 礎 疾 患 ， 治 療 歴 な ど ） は ， 検 査 を 進 め る う え で 最 も 大 切 と な る ．多 く の 場 合 ，確 定 検 査 が 必 要 で あ り ，培 養 法（ 分 離 培 養 ， 確 認 培 養 後 の 性 状 検 査 ）， 鏡 検 法 （ グ ラ ム 染 色 ， 抗 酸 染 色 法 ）， 免 疫 学 的 診 断 法 （ ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 法 ，

（

； 酵 素 結 合 免 疫 吸 着 測 定 ） 法 ， イ ム ノ ク ロ マ ト グ ラ フ 法 な ど に よ る 抗 原 お よ び 抗 体 測 定 法 な ど ），遺 伝 子 工 学 的 検 査（

（

； ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 ） 法 ） な ど の 様 々 な 方 法 に よ っ て 行 わ れ る ． ま た 検 体 の 種 類 に よ っ て は ， そ の 特 徴 か ら 特 定 感 染 症 ま た は 微 生 物 の 種 類 の 推 測 も 可 能 な こ と が あ る ． 例 え ば ， 明 ら か に 血 性 下 痢 便 な ら 腸 管 出 血 性 大 腸 菌（

：

）感 染 症 ，青 緑 色 膿 瘍 物 な ら 緑 膿 菌 （

） 感 染 症 が 疑 わ れ る ．

こ こ で は ， 病 原 性 細 菌 ・ ウ イ ル ス に よ る 感 染 症 検 査 の 代 表 的 な も の に つ い て 概 説 す る ．

2.2.1

培養法

病 原 性 微 生 物 に 侵 さ れ た 病 巣 部 あ る い は 糞 便 ， 尿 ， 血 液 ， 髄 液 ， 喀 痰 な ど の 検 体 ， さ ら に 食 中 毒 な ど で は そ の 原 因 食 品 と 思 わ れ る も の か ら 病 原 性 微 生 物 を 分 離 し ， 同 定 す る 微 生 物 学 的 検 査 （ 培 養 法 ） は 古 く か ら 行 わ れ て お り ， 最 も 基 本 と さ れ て き た ． し か し ， こ の 方 法 は 免 疫 学 的 ， 遺 伝 子 工 学 的 検 査 に 比 べ て 繁 雑 で ，迅 速 性 に 劣 る（ 少 な く と も

日 程 度 の 検 査 期 間 を 要 す ） こ と か ら 迅 速 な 診 断 が 要 求 さ れ る 急 性 感 染 症 に は 不 向 き な 検 査 法 と い え る ．

細 菌 お よ び ウ イ ル ス で そ の 手 法 が 多 少 異 な る た め ， 両 者 を 区 別 し て 以 下

に 述 べ る ．

第2章 病原性細菌・ウイルスによる感染症の診断法

（

） 細 菌 の 場 合

医 師 に よ っ て 感 染 症 が 病 原 性 細 菌 に よ る も の と 診 断 さ れ た と き ， ま ず 予 想 さ れ る 細 菌 の み を で き る 限 り 検 体 か ら 選 択 的 に 増 殖 さ せ る 選 択 培 地 を 用 い て ， そ の 細 菌 に 適 し た 環 境 で 増 菌 あ る い は 分 離 培 養 を 行 う ． こ れ に よ っ て 生 じ た コ ロ ニ ー （ 細 菌 群 ） の 中 か ら 疑 わ し い も の を 掻 き 取 っ て 純 培 養 す る ． こ の 場 合 も 目 的 に 応 じ て ， 液 体 培 地 や 固 形 培 地 を 用 い る ． 純 培 養 し た 細 菌 は 表

の 性 状 か ら 同 定 さ れ る ．

（

） ウ イ ル ス の 場 合

ウ イ ル ス は 自 己 増 殖 す る 機 能 を 有 し て い な い ． そ の た め ， 生 き た 細 胞 内 に 寄 生 し て ， 細 胞 の 代 謝 酵 素 や 材 料 ， さ ら に タ ン パ ク 質 合 成 の た め に 細 胞 の リ ボ ソ ー ム（

）を 利 用 し て 自 己 成 分 を 合 成 し 増 殖 す る ．よ っ て ，ウ イ ル ス の 増 殖 に は 生 き た 細 胞 が 必 要 で あ る ． こ の 生 き た 細 胞 と し て 何 を 用 い る か に よ り ， ウ イ ル ス 分 離 法 は 表

の よ う に

つ に 大 別 さ れ る ． た だ し ， 必 ず し も 全 て の 種 類 の ウ イ ル ス を 増 殖 で き る と は 限 ら ず ， 増 殖 効 率 の 高 い 分 離 材 料 が 見 出 さ れ て い な い も の も 中 に は あ り ， そ の よ う な ウ イ ル ス の 培 養 は 極 め て 難 し い ． ま た 増 殖 が 可 能 な ウ イ ル ス で あ っ て も 各 々 の 分 離 材 料 が

表

病 原 性 細 菌 の 性 状 検 査

性 状 検 査 内 容

コロニーの性状 大きさ，形，色，発育条件（O2呼吸か否か）

細菌の形態 大きさ，形，配列，鞭毛や芽胞および莢膜形成の有無など 生化学性状 栄養要求性，糖，アミノ酸の分解能，酵素産生能など 毒素産生性 動物や培養細胞に対する毒性など

化学的性状 細胞壁や脂質の構成成分など 免疫学的性状 細菌の抗原性など

遺伝学的性状 CG含有量*，DNAやRNAの相同性

*C：cytosine（シトシン），G：guanine（グアニン）

異 な る こ と か ら ， 多 く の 種 類 の 分 離 材 料 を 準 備 し な く て は な ら な い こ と も こ の 方 法 の 特 徴 で あ る ．

な お 分 離 さ れ た ウ イ ル ス は ， 感 染 後 の 培 養 細 胞 に 見 ら れ る 細 胞 変 性 効 果（

：

），抗 血 清 を 用 い た 中 和 試 験 ，電 子 顕 微 鏡 に よ る ウ イ ル ス 粒 子 の 観 察 ， 後 述 の 抗 原 お よ び 抗 体 測 定 ， あ る い は 接 種 さ れ た 動 物 の 症 状 ， 病 理 組 織 学 的 変 化 な ど に よ り 同 定 さ れ る ．

表

ウ イ ル ス の 分 離 法

分離材料 例

培養細胞 サル腎細胞によるエンテロウイルス，単純ヘルペスウイルスの分離 発育鶏卵 8～13日齢発育鶏卵羊膜腔でのインフルエンザウイルスの分離

感受性動物 乳のみマウス脳内接種による日本脳炎ウイルス，狂犬病ウイルスの分離

2.2.2

鏡検法

前 述 の よ う な 培 養 法 を 主 体 と し た 微 生 物 学 的 検 査 は ， 全 般 的 に 迅 速 性 ， 簡 便 性 に 問 題 を 有 し て い る も の の ， そ の 中 で 鏡 検 法 は 簡 単 そ し て 迅 速 に 行 え る こ と か ら ， 有 用 な 感 染 症 検 査 の 一 つ と し て 現 在 で も 多 用 さ れ て い る ． た だ し ， 鏡 検 法 は 光 学 顕 微 鏡 に よ っ て 行 わ れ る こ と か ら ， 確 認 で き る 微 生 物 の 大 き さ に 制 限 が あ り ， そ の 中 で も 直 径

～

で あ る ウ イ ル ス に は 適 用 さ れ ず ， そ れ よ り も 大 き い （

～

～

） 細 菌 に 対 し て 使 わ れ る ．

鏡 検 法 の 中 で も 特 に グ ラ ム 染 色 と 抗 酸 性 染 色 は ， 感 染 検 査 に お い て 価 値 の 高 い 鏡 検 法 と さ れ て お り ， ま た 免 疫 学 的 ， 遺 伝 子 工 学 的 検 査 に 比 べ コ ス ト が 低 く ， 適 応 性 が 高 い ．

（

） グ ラ ム 染 色

現 在 ，臨 床 検 査 で 使 用 さ れ て い る グ ラ ム 染 色 法 と し て は ，

変 法 ，

法

な ど が あ る ． 両 者 は ， 色

素 や 試 薬 に わ ず か な 違 い が あ る だ け で 同 様 に 実 施 さ れ る ． 塗 抹 ， 乾

第2章 病原性細菌・ウイルスによる感染症の診断法

燥 ， 固 定 し た 試 料 を ク リ ス タ ル ・ バ イ オ レ ッ ト で ま ず 全 て の 細 菌 を 染 色 す る ． 水 洗 後 ル ゴ ー ル 液 （ ヨ ウ 素 ・ ヨ ウ 化 カ リ ウ ム 水 溶 液 ） を か け 媒 染 し ， さ ら に ア ル コ ー ル で 脱 色 す る ． グ ラ ム 陽 性 と 呼 ば れ る 細 菌 群 は 脱 色 さ れ ず ， ク リ ス タ ル ・ バ イ オ レ ッ ト の 青 紫 に 染 ま っ た ま ま で あ る が ， グ ラ ム 陰 性 と 呼 ば れ る 細 菌 群 は 脱 色 さ れ て 無 色 に な る ． こ の ま ま で は グ ラ ム 陰 性 菌 を 顕 微 鏡 で 観 察 で き な い た め ， サ フ ラ ニ ン に よ っ て 赤 く 呈 色 す る ． 一 度 ク リ ス タ ル ・ バ イ オ レ ッ ト で 染 ま っ た グ ラ ム 陽 性 菌 は サ フ ラ ニ ン を 加 え て も 色 調 は 変 わ ら な い た め 青 紫 の ま ま と な る ．

こ の 方 法 は ，検 出 細 菌 が グ ラ ム 陽 性 か 陰 性 で あ る か の 判 定 を 行 い ， 次 に 形 態 の 特 徴 を 観 察 し て 同 定 す る こ と は で き る が ， そ れ 以 上 に 表

に 示 し た 緊 急 時 の 感 染 検 査 の 有 用 性 が 評 価 さ れ て い る ． す な わ ち ， グ ラ ム 染 色 は 細 菌 の 存 在 を 明 ら か に す る こ と が で き る ． そ の 一 方 で ，グ ラ ム 染 色 性 お よ び 形 態 特 徴 か ら 菌 種 の 推 定 が 行 わ れ る た め ， 形 態 や グ ラ ム 染 色 性 の 類 似 し た 緑 膿 菌 や 腸 内 細 菌 に 関 し て は 熟 練 技 師 で も 困 難 な こ と が 多 い ．

（

） 抗 酸 性 染 色 法

結 核 菌 に 代 表 さ れ る 抗 酸 菌 の 細 胞 壁 は 脂 質 に 富 み 水 溶 液 色 素 に 染 ま り に く い が ， 一 度 染 色 さ れ る と 酸 ， ア ル コ ー ル な ど の 脱 色 剤 で 脱 色 さ れ に く い こ と を 利 用 し た 染 色 法 で あ る ． 喀 痰 を ス ラ イ ド ガ ラ ス に 固 定 し た 後 ， 石 炭 酸 フ ク シ ン を 加 え 加 温 染 色 す る ． そ の 後 ， 塩 酸 ア ル コ ー ル で 脱 色 す る と 抗 酸 菌 以 外 の 細 菌 や 上 皮 細 胞 ， 炎 症 細 胞 は 脱 色 さ れ る た め ， メ チ レ ン ブ ル ー を 加 え て 青 く 染 め る ． 喀 痰 中 の 結 核 菌 は 赤 く ， そ の 他 の 細 胞 は 青 く 染 色 さ れ る こ と か ら 結 核 菌 が 検 出 さ れ や す く な る ．

結 核 菌 は 抗 酸 菌 の 中 で も 抗 酸 性 が 特 に 強 く ， 抗 酸 性 染 色 さ れ た 標

本 を 煮 沸 水 に 浸 す こ と で 脱 色 さ れ な い が ， 非 病 原 性 抗 酸 菌 は 脱 色 さ

れ る た め ， 同 定 が よ り 確 実 に 行 え る ． し か し ， こ の 方 法 は 抗 酸 菌 の

染 色 法 と し て 開 発 さ れ た た め ， 抗 酸 菌 以 外 の 検 出 は 難 し い ．

表

病 原 性 細 菌 感 染 症 の 診 断 に 対 す る グ ラ ム 染 色 の 適 用

2.2.3

抗原および抗体測定法

抗 原 と 抗 体 の 反 応 は 特 異 的 で あ り ， 反 応 産 物 で あ る 抗 原 抗 体 複 合 物 は 定 量 的 に 形 成 さ れ る ． 試 験 管 内 で 抗 原 抗 体 反 応 を 行 う こ と に よ っ て ， 微 量 の 抗 原 の 検 出 や 抗 原 性 に よ る 物 質 の 同 定 が 可 能 で あ り ， ま た 抗 体 の 存 在 を 定 性 的 に 知 る だ け で な く ， 血 清 中 の 特 定 の 抗 体 量 を ， 相 対 的 に （ 抗 体 価 と し て ） ま た 絶 対 的 な 量 と し て 測 定 す る こ と も 可 能 で あ る ． 現 在 ， 試 験 管 内 抗 原 抗 体 反 応 と し て ， 凝 集 反 応 法 や 標 識 抗 体 法 な ど が 用 い ら れ て い る ． 凝 集 反 応 は 抗 原 が 微 粒 子 状 で あ れ ば 簡 単 に 実 施 で き ， 肉 眼 で 判 定 で き る た め ， 細 菌 の 血 清 型 別 や 血 液 型 判 定 な ど に 使 わ れ て い る ． ま た 抗 体 や 抗 原 を 標 識 し ， そ の 標 識 化 合 物 の 定 量 に よ っ て 測 定 す る 標 識 抗 体 法 は ， 感 度 と 定 量 性 に 優 れ て い る こ と か ら ， 広 く 応 用 さ れ て い る ． た だ し ， 抗 体 が 形 成 さ れ る ま で に 数 ヶ 月 以 上 要 す も の も あ り ， そ の よ う な 検 査 に は 不 向 き で あ る ．

（

） ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 法

図

の よ う に ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 法 は ， ラ テ ッ ク ス 粒 子 に 付 与

し た 細 菌 ・ ウ イ ル ス 等 の 抗 体 を ， 検 体 中 の 細 菌 ・ ウ イ ル ス と 反 応 さ

せ ， 凝 集 塊 を 形 成 さ せ る ． 目 視 で 結 果 を 判 定 で き る た め ， 特 別 な 機

器 は 必 要 な い ． ま た ， 原 因 食 品 や 糞 便 か ら 直 接 検 査 で き る 場 合 も あ

る が ， 病 原 性 微 生 物 の 量 が 多 い 急 性 期 の 検 体 を 使 用 し な い と 検 出 は

第2章 病原性細菌・ウイルスによる感染症の診断法

困 難 で あ り ， 病 原 性 細 菌 の 検 査 で は ， 通 常 分 離 培 地 上 に 発 育 し た 疑 わ し い コ ロ ニ ー を 使 っ て 行 う こ と が 多 い ．

図

ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 法 の 原 理

（

）

法

ELISA

（

； 酵 素 結 合 免 疫 吸

着 測 定 ） 法 は 血 液 ， 糞 便 等 の 検 体 中 に 存 在 す る 病 原 性 微 生 物 の 抗 原

を 検 出 す る ．そ の 原 理 を 図

に 示 す ．抗 体 を 固 相（ マ イ ク ロ プ レ ー

ト ， ガ ラ ス ビ ー ズ ， 試 験 管 ） に 吸 着 さ せ た 後 ， 検 体 を 加 え る ． 検 体

中 に 病 原 性 微 生 物 の 抗 原 が あ れ ば ， 固 相 に 吸 着 し た 抗 体 に 捕 捉 さ れ

る ．こ の 病 原 性 微 生 物 の 抗 原 を 第

の 抗 体（ 検 出 抗 体 ）で 検 出 す る ．

こ の 場 合 ， 検 出 抗 体 を 酵 素 で 標 識 し て お く の が 一 般 的 で ， 検 出 抗 体

が 病 原 性 微 生 物 の 抗 原 と 反 応 し た か ど う か を 酵 素 反 応 に 変 換 し て 知

る こ と が で き る ． ま た ， 検 出 抗 体 を 未 標 識 と し ， こ の 抗 体 に 対 す る

抗 体 （ 抗 免 疫 グ ロ ブ リ ン 抗 体 ） を 標 識 し て ， 反 応 を 行 わ せ る サ ン ド

イ ッ チ 間 接 法 も 用 い ら れ て い る ．

図

法 の 原 理

（

） イ ム ノ ク ロ マ ト グ ラ フ 法

病 原 性 微 生 物 を 抗 原 と す る 場 合 ， こ の 方 法 は 原 因 食 品 や 糞 便 か ら 微 生 物 を 直 接 検 出 す る こ と が 可 能 で あ る ． 検 体 中 の 抗 原 ， 抗 体 の ど ち ら を 検 出 す る か に よ っ て 違 い が あ る が ， 両 者 は と も に 同 じ よ う な 原 理 で あ る ．図

は 病 原 性 微 生 物 を 抗 原 と し た と き の も の で あ る ． 濾 紙 で で き て い る 検 体 滴 下 部 （ 吸 収 パ ッ ド ） に は ， 金 な ど の 金 属 コ ロ イ ド や セ レ ン な ど の 非 金 属 コ ロ イ ド を 用 い た 着 色 粒 子 に 抗 体 を 結 合 さ せ た 標 識 物 が 乾 燥 付 着 さ れ て い る ． そ こ に 検 体 を 滴 下 す る と ， 抗 原 は 標 識 物 （ 抗 体 ） と 抗 原 抗 体 複 合 体 を 形 成 し て ， 毛 細 管 現 象 に よ っ て 濾 紙 上 を 上 部 に 向 か っ て 拡 散 す る ． そ の 結 果 ， 陽 性 判 定 領 域

（

ラ イ ン ）に 固 定 さ れ て い る 検 出 抗 体 と 結 合 し て 発 色 色 素 に よ り 陽 性 の ラ イ ン が 出 現 す る ．コ ン ト ロ ー ル 領 域（

ラ イ ン ）に は 抗 原 の 有 無 に か か わ ら ず ラ イ ン が 現 れ る ．

図

イ ム ノ ク ロ マ ト グ ラ フ 法 の 原 理

A. 2抗体サンドイッチ B. 2抗体サンドイッチ間接法

第2章 病原性細菌・ウイルスによる感染症の診断法

2.2.4 PCR

法（遺伝子診断法）

感 染 症 の 診 断 に 遺 伝 子 工 学 的 検 査 （ 遺 伝 子 診 断 法 ） が 用 い ら れ る よ う に な っ た 最 も 大 き な 要 因 は ， 試 験 管 内 で 遺 伝 子 の 複 製 ・ 増 幅 が 可 能 に な っ た こ と で あ る ． そ の 中 で 最 も 代 表 的 な も の が

（

； ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 ） 法 で あ る ．

PCR

法 は ，検 出 対 象 で あ る 遺 伝 子 の 指 定 さ れ た 領 域 を 複 製・増 幅 す る 技

術 で あ る ． 試 薬 （ 酵 素 と 遺 伝 子 断 片 か ら 構 成 さ れ る ） と 加 熱 冷 却 装 置 の 性

能 や 指 定 さ れ た 遺 伝 子 領 域 の 配 列 な ど の 条 件 に よ っ て 異 な る が ，

時 間 程

度 で お よ そ

万 か ら

万 倍 に 遺 伝 子 を 増 幅 す る こ と が で き る ．こ の

手 法 を 用 い る こ と に よ り ， こ れ ま で 検 出 で き な か っ た 非 常 に 微 量 な 細 菌 や

ウ イ ル ス を 迅 速 に 検 出 で き る よ う に な り ， 感 染 症 の 診 断 に 役 立 て ら れ る よ

う に な っ た ． 特 に ウ イ ル ス 感 染 症 の 場 合 ， 感 染 後 ， 抗 体 が 形 成 さ れ る ま で

に 長 期 間 要 す も の も あ り ， 抗 体 測 定 法 で は そ の 間 偽 陰 性 と 診 断 さ れ る こ と

が あ る が ，

法 は 遺 伝 子 を 直 接 検 出 す る た め 誤 診 が 極 め て 少 な い ．本 研

究 で も こ の

法 を 利 用 し て 細 菌 ，ウ イ ル ス を 検 出 し て お り ，原 理 は

項 で 詳 し く 述 べ る ．

第 3 章

遺伝子診断法における従来の核酸抽出法

現 在 ， 前 章 で 紹 介 し た 遺 伝 子 診 断 は ， 他 の 診 断 法 に 比 べ て 迅

速 で 確 実 な 方 法 で あ る こ と か ら 臨 床 学 的 価 値 の 高 い 診 断 法 の

一 つ と し て 多 用 さ れ る よ う に な っ て き た ．そ の 背 景 に は 遺 伝 子

増 幅 技 術 の 開 発 ， そ し て 自 動 化 が あ っ た ． 一 方 ， 遺 伝 子 診 断 に

と っ て 必 要 不 可 欠 な 細 菌 や ウ イ ル ス か ら の 遺 伝 子 の 抽 出 は 繁

雑 で あ り ，そ れ ゆ え に 自 動 化 も 進 ん で お ら ず ，未 だ 課 題 も 多 い ．

こ の よ う な こ と か ら 本 論 文 で は ，単 純 か つ 自 動 化 の 可 能 性 を 有

す る 全 く 新 し い 遺 伝 子 抽 出 法 に 関 す る 検 討 ，開 発 を 行 っ て い る ．

そ の 際 に ，遺 伝 子 で あ る 核 酸 の 構 造 や 機 能 ，ま た 従 来 の 核 酸 抽

出 法 を 知 っ て お く 必 要 が あ り ，こ の 章 で は そ れ ら に つ い て 述 べ

る ．さ ら に ，本 研 究 の 基 礎 と な っ た 導 電 性 中 空 糸 膜 を 用 い た 電

流 通 電 に よ る 殺 菌 ， 細 胞 内 物 質 の 抽 出 に つ い て も 述 べ る ．

第3章 遺伝子診断法における従来の核酸抽出法

3.1

核酸

人 間 を は じ め と す る 生 物 の 生 命 活 動 の ほ と ん ど は タ ン パ ク 質 が 担 っ て お り ， そ の 正 確 な 情 報 維 持 ， 生 合 成 は 核 酸 に よ っ て 行 わ れ る ． す な わ ち 核 酸 と は ， タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 情 報 を 維 持 し て い る も の で あ り ， タ ン パ ク 質 合 成 の 鋳 型 で も あ る ． こ の 核 酸 は ， 酸 性 の 高 分 子 物 質 で あ り ， ま た 生 理 的

で は 多 価 陰 イ オ ン で あ る ． 核 酸 に は ， デ オ キ シ リ ボ 核 酸

（

：

） と リ ボ 核 酸 （

：

） の

種 類 が あ り ，そ れ ぞ れ は ，以 下 に 述 べ る よ う な 構 造 お よ び 機 能 を 有 し て い る ．

3.1.1 DNA

の構造と機能

DNA

は ，細 胞 や 生 体 を 形 成 す る た め の 情 報 を 維 持 し て い る ．次 の 世 代 に ， こ の 情 報 は 正 確 に 複 製 ・ 伝 達 さ れ ， 種 の 遺 伝 の 継 続 性 が 維 持 さ れ る （ ウ イ ル ス は 種 類 に よ っ て

の 場 合 も あ る ）．特 に そ の 中 で も 生 理 的 機 能 を 持 つ 分 子（ タ ン パ ク 質 や

）を 合 成 す る の に 必 要 な 情 報 を 含 ん で い る 部 分 が 遺 伝 子 （

） で あ る ． 図

の よ う に

は ， ア デ ニ ン （

）， グ ア ニ ン （

）， チ ミ ン （

）， シ ト シ ン （

） と 呼 ば れ る 四 種 類 の 塩 基 ，

図

鎖 の 構 成 要 素

デ オ キ シ リ ボ ー ス と い う

炭 糖 ，お よ び リ ン 酸 に よ り 構 成 さ れ て い る ．塩 基 と 糖 が 結 合 し た も の を ヌ ク レ オ シ ド と い い ， そ れ に リ ン 酸 が 結 合 し た も の を ヌ ク レ オ チ ド と い う ． ヌ ク レ オ チ ド の リ ン 酸 と 糖 と が 交 互 に リ ン 酸 ジ エ ス テ ル 結 合 し た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド が

で あ る ．遺 伝 情 報 は

分 子 の 塩 基 の 並 ぶ 順 序 ，す な わ ち 塩 基 配 列 の 中 に コ ー ド さ れ て い る ．通 常

本 の 分 子 鎖 に 対 し て

，

と い う 組 み 合 わ せ に よ り 対 を 形 成 し ， 右 巻 き の 二 重 ら せ ん 構 造 を と る ．こ の ら せ ん 構 造 は 図

の よ う に 規 則 正 し く

ご と に

巻 き し ， 約

の 直 径 を も つ ． ま た 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド 間 の 距 離 は

で あ り ，

巻 き 当 た り

個 の ヌ ク レ オ チ ド が 存 在 す る ． 相 補 的 な

鎖 の 結 合 は ，

お よ び

が そ れ ぞ れ

，

個 の 水 素 結 合 を と る こ と に よ る ．

遺 伝 情 報 が 多 け れ ば ， そ れ だ け 情 報 を コ ー ド す る

は 大 き く な る ． 一 般 に 高 等 な 生 物 ほ ど 大 き な

を 有 す る ．

の 大 き さ は 塩 基 対（

：

）， あ る い は ダ ル ト ン （

） で 表 さ れ る ． 本 研 究 で 使 用 し た 単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス ，大 腸 菌 は そ れ ぞ れ 約

，

程 度 で あ る が ，我 々 人 間 は そ れ ら よ り も 遥 か に 大 き い 約

の

を

対 の 染 色 体 の 中 に 持 っ て い る

．

図

の 二 重 ら せ ん 構 造

第3章 遺伝子診断法における従来の核酸抽出法

3.1.2 RNA

の構 造と機能

も う 一 つ の 核 酸 で あ る

は ， 図

の よ う に 糖 が デ オ キ シ リ ボ ー ス で は な く リ ボ ー ス ，

種 類 の 塩 基 の う ち チ ミ ン（

）が ウ ラ シ ル（

）で あ る こ と 以 外 は

と 同 様 な 構 造 で あ る ．通 常

は

の よ う な

本 鎖 で は な く

本 鎖 と し て 存 在 す る ．

上 の 遺 伝 情 報 か ら ， 生 命 活 動 の 多 く を 担 う タ ン パ ク 質 が 正 確 に 合 成 さ れ る 際 ，

は 伝 令

（

：

）， 移 転

（

：

）， リ ボ ソ ー ム

（

：

）と い う 分 子 種 と し て 仲 介 す る ．

は

の 遺 伝 情 報 と し て タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 を コ ー ド し て い る 塩 基 配 列 を 運 ぶ ．

は ，

に コ ー ド さ れ た 情 報 を 読 み 取 り ，タ ン パ ク 質 合 成 に お い て 伸 長 中 の ア ミ ノ 酸 の 長 鎖 （ ポ リ ペ プ チ ド 鎖 ） に 所 定 の ア ミ ノ 酸 を 移 す ．

は タ ン パ ク 質 と 結 合 し て ， 複 雑 な タ ン パ ク 質 合 成 装 置 で あ る リ ボ ソ ー ム を 形 成 す る ．

図

鎖 の 構 成 要 素 と 構 造

3.1.3

ウイルスの核酸

ウ イ ル ス は 複 製 に 必 要 な 最 小 限 の 要 素 と し て 核 酸 を 有 し て い る が ，自 己

増 殖 で き ず 宿 主 細 胞 と 呼 ば れ る 細 胞 に 感 染 し ， そ の 機 能 を 利 用 し て 増 殖 す

る ． 細 胞 生 物 は 遺 伝 分 子 が 必 ず

本 鎖

で あ る が ， ウ イ ル ス の 持 つ 核

酸 は

に 限 ら ず

の 場 合 も あ る ．さ ら に そ の 核 酸 は ，

本 鎖 で あ っ

た り ，

本 鎖 で あ っ た り 多 様 で あ る ．

を 核 酸 と し て 持 つ ウ イ ル ス で は ，

が 直 接 複 製 さ れ る も の や

合 成 の 鋳 型 に な る も の が あ る ．

本 鎖

ウ イ ル ス の

は

と 同 じ 鎖 の プ ラ ス（ ＋ ）鎖 で あ る も の と ，

の 相 補 鎖 で あ る マ イ ナ ス （ － ） 鎖 で あ る も の が 存 在 す る ．

第3章 遺伝子診断法における従来の核酸抽出法

3.2

従来の核酸抽出法

遺 伝 子 診 断 法 は ， 臨 床 学 的 価 値 の 高 い 診 断 法 で 今 後 益 々 利 用 さ れ る 方 法 と 考 え ら れ て い る ． こ の 遺 伝 子 診 断 に 欠 か せ な い プ ロ セ ス で あ る

（

）法 は ，酵 素 反 応 な ど を 利 用 し て 遺 伝 子 断 片 を 増 幅 す る た め ， 反 応 環 境 に 検 体 由 来 の タ ン パ ク 質 や 脂 肪 等 が 高 濃 度 に 存 在 す る と 反 応 阻 害 を 引 き 起 こ す

．し た が っ て ，実 際 に

法 で 遺 伝 子 増 幅 を 行 う に は ， 多 く の 場 合 ， 最 初 に 検 体 か ら の 遺 伝 子 ， す な わ ち 核 酸 の 抽 出 ・ 精 製 が 必 要 と な る

． 従 来 用 い ら れ て い た 手 法 は ， 以 下 の よ う な 化 学 的 抽 出 法 が 主 流 で あ る が ， そ の 操 作 は 繁 雑 で あ り ， マ ニ ュ ア ル 操 作 が 多 く 自 動 化 が 進 ん で い な か っ た ． こ の よ う な こ と か ら 最 近 で は 多 く の 研 究 が 行 わ れ て お り ， 自 動 化 さ れ た も の も あ る ． こ こ で は ， 従 来 の 核 酸 抽 出 法 の 代 表 的 な も の と し て 化 学 的 抽 出 法 ， 磁 性 粒 子 を 用 い た 抽 出 法 の 原 理 ， 特 徴 を 述 べ る ．

3.2.1

化学的抽出法

病 原 性 細 菌 や ウ イ ル ス か ら 核 酸 を 抽 出 す る 際 ， 最 も 多 く 用 い ら れ て い る の が 化 学 的 抽 出 法 で あ り ，一 般 的 に 図

の よ う に 実 施 さ れ る ．ま ず

（

； ド デ シ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム ） な ど の 界 面 活 性 剤

を 添 加 す る ． 界 面 活 性 剤 は ， 脂 質 分 子 を 取 り 除 き 核 酸 を 覆 っ て い る 細 胞 膜

や ウ イ ル ス 被 膜 を 破 壊 す る こ と で 細 胞 や ウ イ ル ス 粒 子 を 溶 解 す る ． ま た 核

酸 は 塩 基 性 タ ン パ ク 質 と 非 常 に 強 く 結 合 し て お り ， 界 面 活 性 剤 は そ れ ら の

タ ン パ ク 質 を 変 性 し ， 核 酸 か ら 切 り 離 す 活 性 も 持 っ て い る ． こ れ に よ っ て

分 解 さ れ た タ ン パ ク 質 と 核 酸 を 分 離 す る た め に ， 次 に 水 飽 和 フ ェ ノ ー ル や

ク ロ ロ ホ ル ム な ど の 有 機 溶 媒 が 使 わ れ る ． 核 酸 抽 出 液 と 等 量 の 有 機 溶 媒 を

入 れ ， 撹 拌 し た 後 に 遠 心 分 離 を 行 う こ と で 水 溶 液 （ 上 層 ） と 有 機 溶 媒 （ 下

層 ）の

層 に 分 か れ る ．核 酸 は 水 溶 液 層 に 残 り ，変 性 し た タ ン パ ク 質 は 中

間 層 あ る い は 下 層 に 分 離 さ れ る ．こ の 水 溶 液 層 の み を 回 収 し ，

～

倍 量 の

エ タ ノ ー ル あ る い は イ ソ プ ロ パ ノ ー ル の よ う な ア ル コ ー ル と 混 ぜ る ． 核 酸

は こ れ ら の 有 機 溶 媒 に 溶 け な い た め ゲ ル 状 の 沈 殿 に な る ． こ れ を 遠 心 分 離 あ る い は ガ ラ ス 棒 で 回 収 す る ． そ の 後 ， 乾 燥 さ せ る こ と で ア ル コ ー ル を 除 去 し ， 適 当 な 緩 衝 液 に 溶 解 す る ．

化 学 的 抽 出 法 は 以 上 の 工 程 に し た が っ て 行 わ れ る が ， 多 く の 試 薬 ， 遠 心 分 離 工 程 が 必 要 で あ り ， 多 大 な 時 間 と 労 力 を 必 要 と す る ． ま た 試 薬 に は 有 機 溶 媒 も 使 わ れ て お り ， そ の 取 り 扱 い に 十 分 注 意 し な く て は な ら な い ．

図

核 酸 の 化 学 的 抽 出 法

第3章 遺伝子診断法における従来の核酸抽出法

3.2.2

磁性粒子を用いた抽出法

磁 性 粒 子 を 用 い た 抽 出 法 は ， 前 項 で 述 べ た 化 学 的 抽 出 法 と

法

を 応 用 し た も の で あ る ．

法 は ， シ リ カ 粒 子 の 入 っ た 高 濃 度 の 溶 解 液 中 （ 界 面 活 性 剤 お よ び グ ア ニ ジ ン イ ソ チ オ シ ア ネ ー ト な ど ） で 細 菌 や ウ イ ル ス の 被 膜 を 溶 解 す る と 同 時 に ， 核 酸 に 親 和 性 を 示 す シ リ カ 粒 子 に 核 酸 を 濃 縮 し ，

エ タ ノ ー ル 等 で 洗 浄 後 ， 低 塩 濃 度 溶 液 に 置 換 す る こ と で 核 酸 を シ リ カ 粒 子 か ら 離 脱 さ せ る 方 法 で あ る ． こ の よ う に ，

法 や 化 学 的 抽 出 法 は と も に 遠 心 操 作 が 必 要 で あ っ た り ， 有 機 溶 媒 を 取 り 扱 う 煩 わ し さ が あ っ た ． こ の よ う な 問 題 を 解 決 す る た め に 考 案 さ れ た の が 磁 性 粒 子 に よ る 核 酸 抽 出 法 で あ る ．

磁 性 粒 子 と は ，化 学 的 に 安 定 性 の 高 い 酸 化 鉄（

）と シ リ カ 化 合 物（ ア モ ル フ ァ ス シ リ カ ， ガ ラ ス 粉 末 ， ア ル キ ル シ リ カ ， ア ル ミ ナ な ど ） あ る い は ポ リ ス チ レ ン 等 の 高 分 子 ポ リ マ ー を 混 合 し て 球 状 に 成 形 し た も の で ， 大 き さ は

～

程 度 の も の が 市 販 さ れ て い る ． 酸 化 鉄 は 強 磁 性 体 で あ る た め 磁 場 内 で は 磁 化 さ れ て 磁 極 に 集 ま っ て く る 性 質 が あ り ， 一 方 で 磁 場 を 取 り 去 っ た と き の 残 存 磁 気 が 極 め て 低 い た め ， そ れ に よ っ て 相 互 に 凝 集 す る こ と が ほ と ん ど な く ， 振 盪 す る こ と で 容 易 に 再 懸 濁 で き る 特 徴 を 持 つ ． シ リ カ 化 合 物 や ポ リ ス チ レ ン は ， シ リ カ が 核 酸 に 対 す る 親 和 性 を 持 つ こ と を 利 用 し た り ， 表 面 に

基 な ど の 官 能 基 や ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン な ど を 付 け ， そ れ ら を 利 用 し て 目 的 と す る 核 酸 を 抽 出 す る 役 割 を 持 つ

． 処 理 工 程 と し て は ， は じ め に 化 学 的 抽 出 法 と 同 じ よ う に 界 面 活 性 剤 で 細 胞 や ウ イ ル ス 被 膜 を 溶 解 す る ．そ の 後 ，磁 性 粒 子 を 入 れ 撹 拌 し 核 酸 を 捕 捉 さ せ る ． 次 に 磁 石 に よ っ て そ の 磁 性 粒 子 を 回 収 し ， 数 回 洗 浄 を 行 い ， 適 当 な 緩 衝 液 に 溶 解 す る ． こ の よ う に ， 磁 性 粒 子 を 用 い た 抽 出 法 は ， 化 学 的 抽 出 法 の よ う な 有 機 溶 媒 の 取 り 扱 い や 遠 心 操 作 が 不 要 で あ る こ と が 特 徴 で あ る

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