平成 26 年度微生物リスク管理基礎調査事業（分離菌株の性状解析） 委託事業実施要領 １ 事業の趣旨（目的） 農林水産省では、食品の安全性を向上させることを目的として、リスク管理を実 施している。そのために、様々な有害微生物について、食中毒の症状の程度やその 患者数、海外における取組状況等の情報を収集・分析し、「農林水産省が優先的に リスク管理を行うべき有害微生物のリスト」及び「サーベイランス・モニタリング 中期計画」（平成 24 年度～28 年度）に基づき、調査を実施している。 本事業は、食品媒介有害微生物を原因とする食中毒のリスク管理措置を検討する ため、家畜の糞便等から分離されたカンピロバクター属菌株、サルモネラ属菌株、 リステリア・モノサイトジェネス菌株及び腸管出血性大腸菌Ｏ157 菌株の性状を解 析し、疫学情報の基礎資料とすることを目的とする。 ２ 事業の概要 （１）事業の内容 分与されたカンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、リステリア・モノサイト ジェネス菌株及び腸管出血性大腸菌Ｏ157 菌株の性状解析を行う。 （２）契約限度額 本事業の委託契約限度額は、平成 26 年度食品安全確保調査・試験事業委託費の うち微生物リスク管理基礎調査事業委託費の範囲内とする。 （３）実施期間 契約締結年月日から平成 27 年３月 20 日までとする。 ３ 受託先の選定方法 本事業は、別紙のとおり仕様書を定め、民間の分析機関に委託して実施する。委 託先の選定は一般競争入札による。なお、調査分析の信頼性を確保するため、以下 に掲げる項目を当該競争に参加する者に必要な資格とする。 （１）内部精度管理 食品の微生物学的な検査等の業務において、厚生労働省の「食品衛生検査施設 等における検査等の業務の管理の実施について」（平成９年４月１日付け衛食第 117 号）に準拠した精度管理を実施し、適正に運用されていること。 （２）外部精度管理 国際的に認知されている外部精度管理機関の食品微生物分析の技能試験（定量 試験が試験項目に含まれるもの）に過去２年以内に参加し、満足な結果（Z スコ
平成 26 年度微生物リスク管理基礎調査事業（分離菌株の性状解析） 委託事業仕様書 １ 事業の趣旨（目的） 本事業は、食品媒介有害微生物を原因とする食中毒のリスク管理措置を検討する ため、家畜の糞便等から分離されたカンピロバクター属菌株、サルモネラ属菌株、 リステリア・モノサイトジェネス菌株及び腸管出血性大腸菌Ｏ157 菌株の性状を解 析し、疫学情報の基礎資料とすることを目的とする。 ２ 事業実施期間 契約締結年月日から平成 27 年３月 20 日まで ３ 事業の概要 分与されたカンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、リステリア・モノサイトジ ェネス菌株及び腸管出血性大腸菌Ｏ157 の性状解析及び保管を行う。 ４ 検査対象及び検査項目 （１）カンピロバクター属菌 MLST 法による分類 177 株 フラジェリン遺伝子による型別 232 株 （２）サルモネラ属菌 血清型の同定 77 株 MLST 法による分類 25 株 （３）リステリア・モノサイトジェネス PCR 法による病原遺伝子の検出 118 株 MLST 法による分類 118 株 （４）腸管出血性大腸菌Ｏ157 ベロ毒素遺伝子の検出 129 株 腸管出血性大腸菌病原遺伝子の検出 129 株 IS-printing法による型別 129 株 ５ 検査方法 （１）カンピロバクター属菌 分与されたカンピロバクター属菌株のうち、177 株について PCR 法により以下 の７つの遺伝子＊の増幅を行い、それらの増幅遺伝子の塩基配列を決定する。
Multilocus Sequence Typing (MLST) のデータベース
（http://pubmlst.org/campy lobacter/）を参照し、７つの遺伝子の塩基配列の 組み合わせから菌株を分類する。
また、232 株については、フラジェリン遺伝子を使用した型別を行う。 ＊対象遺伝子
Aspatase (aspA), Glutamine synthetase (glnA), Citrate synthase (gltA),
Serine hydroxyl methyl transferase (glyA), Phospho glucomutase(pgm), Transketolase (tkt), ATP synthase alpha subunit (uncA)
（２）サルモネラ属菌
分与されたサルモネラ属菌株のうち、77 株についてＯ抗原及びＨ抗原、生化学 的試験により血清型を同定する。また、25 株については、PCR 法により以下の７ つの遺伝子の増幅を行い、それらの増幅遺伝子の塩基配列を決定する。
Multilocus Sequence Typing (MLST) のデータベース（http://mlst.warwick.ac. uk/mlst/dbs/Senterica）を参照し、７つの遺伝子の塩基配列の組み合わせから菌 株を分類する。
＊対象遺伝子
Chorismate synthase (aroC), DNA polymerase III beta subunit (dnaN), Uroporphyrinogen III cosynthase (hemD), Histidinol dehydrogenase (hisD), Phosphoribosylaminoimidazole carboxylas (purE), Alpha ketoglutarate dehydrogenase (sucA), Aspartokinase + Homoserine dehydrogenase (thrA)
（３）リステリア・モノサイトジェネス
分与されたリステリア・モノサイトジェネス菌株のうち、118 株について、PCR 法により、消費・安全政策課が指定する病原遺伝子（hlyA、inlA 等）の検出を行 う。また、PCR 法により以下の７つの遺伝子の増幅を行い、それらの増幅遺伝子 の塩基配列を決定する。Multilocus Sequence Typing (MLST) のデータベース （http://www.pasteur.fr/ recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html）を参照し、 ７つの遺伝子の塩基配列の組み合わせから菌株を分類する。
＊対象遺伝子
ABC transporter (acbZ), beta-glucosidase (bglA), catalase (cat), Succinyl diaminopimelate desuccinylase (dapE), D-amino acid aminotransferase (dat), L-lactate dehydrogenase (ldh), histidine kinase (lhkA)
分与された腸管出血性大腸菌Ｏ157 菌株のうち、129 株について国立感染症研 究所の「腸管出血性大腸菌（EHEC）検査・診断マニュアル」（平成 24 年６月改 訂）に掲載されている SSI の PCR プロトコール（Qiagen HotStart を使用）に 基づき、ベロ毒素遺伝子タイプ（VTX1、VTX2）の同定及びサブタイプ（vtx1a、 1c、1d、2a、2b、2c、2d、2e、2f 及び 2g）の検出を行う。また、PCR 法により、 消費・安全政策課が指定する病原遺伝子（eae、hlyA 等）の検出を行う。さら に、IS-printing system（TOYOBO）を用いて試験を実施し、菌株の遺伝子型タ イピングを行う。 ６ 試験記録等 （１）検査結果は、電子ファイル（Excel 等のスプレッドシート）に取りまとめ、消 費・安全政策課に提出すること。 （２）検査記録簿を作成し、消費･安全政策課から提出依頼があった場合にすぐに提出 できるようにしておくこと。 （３）試薬等の購入時に添付されている使用説明書等の添付文書については、各１部 を消費･安全政策課に提出すること。また、試薬容器等への貼付のみの場合にあっ ては、内容を転写する等して、記載内容を提出すること。 （４）市販キットを用いて検査する場合にあっては、その信頼性に関し、文献情報に より明らかにすること。 ７ 検査及び保管に際しての留意事項 （１）検査用として分与された菌株は、受領後速やかに培養し試験に供すること。ま た、培養継代数は最小限度（３代以内）に留めること。検査後に残った菌株は消 費・安全政策課の指示があるまで保管しておくこと。 （２）保管用として分与された菌株（凍結アンプル最大 2,000 本、凍結乾燥アンプル 最大 50 本）は、消費・安全政策課の指示に従い保管すること。 （３）事業終了後は、消費・安全政策課の指示に従い、菌株の移送又は廃棄を行うこ と。 ８ 結果の報告 本事業の受託者は、定期的に調査の進捗状況、その時点での調査結果の概要を消 費･安全政策課に報告すること。また、受託者は、検査結果を取りまとめ、報告書 （書面で１部、電子媒体で１部）を作成し、別途連絡する期日までに消費･安全政策 課に提出すること。 ９ その他
（１）本事業における人件費の算定等に当たっては、「委託事業における人件費の算 定等の適正化について」（平成 22 年９月 27 日付け 22 経第 961 号大臣官房経理課 長通知）によるものとする。
（２）仕様書に記載のない事項及び疑義が生じた事項については、消費・安全政策課 及び受託者が協議の上処理する。
