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環境汚物(重 金属 な ど)の生体膜 に対す る作用

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Academic year: 2022

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(1)環境汚物(重 金属 な ど)の生体膜 に対す る作用 第1報 各 種 重 金 属 イ オ ン の ミ ト コ ン ド リ ア 膜 に 対 す る 作 用, 特 にK+区. 画 性 につ いて. 岡山大学医学部公衆衛生学教室,(指 導:緒 方正 名教授) 長. 谷. 川. 亨. (昭和52年6月7日. 受稿). 2. 目. 重 金 属 イ オ ン の調 製. 的 使 用 し た 金 属 は 全 て 塩 化 物 を 用 い,試. 重 金 属 の 生 物 作 用 は そ の 種 類 に よ っ て 異 な り,例 え ばPbの. ポ ル フ ィ リ ン 代 謝 阻 害1),Hgの. 低 下 及 び,細. を解 明 す る に は,先. Hg2+,. Pd2+,. 3,. れ らの 重 金 属 の 作 用 機 作. Cu2+が. Brierly等. Choline‑Chloride,. buffer(pH7.4)中. は25℃. チ オ ン の と り込 み を 増 大 させ る 事 を報 告 して お り4), ま た 以 前 か ら重 金 属 に よ っ て 赤 血 球 内 のK+量. 遊 出 測定. 4,. 反 応 濠0.2M庶. 糖,. 3mM. オ ン は,生. 画性保持を. ア を 懸 濁 し(2〜3mg蛋. 低 下 させ る 作 用 を 有 し て い る が,こ. Tris‑HCl. 5mMリ. ン 酸buffer(pH7.4),. buffer(pH7.4)中. に ミ トコ ン ド リ. 白/ml),呼. Na‑glutamate,リ. の作 用 に関 す る. 応温度. あ る.. 酸 化 的 リン酸 化 反応. が減. 種重金属 イ. で あ るK+区. Tris‑ カ リウ ム. 経 時 的 に 測 定 し た.反. で 反 応 容 量 は3mlで. 少 す る事 が 知 られ て い る5).こ の 様 に,各 体 膜 機 能 の1つ. 10mM. に 遊 出 し て くるK+を. 電 極(BecKman社)で. カ. 応 液 に最 終. 希 釈 さ れ る よ う に 添 加 し た.. K+の. HCl. 薬特級 よ り. 濃 度 の もの を 作 り,反. 反 反 応 液0.15M. は,. ミ トコ ン ド リア 膜 の1価. 0.1mMの. 的 に100倍. ず 細 胞 に 対 す る 生 物 作 用 を, in. 解 明 す る事 が 必 要 で あ る, Zn2+,. 細胞膜機能. 胞 内 チ オ ー ル 含 有 酵 素 の 機 能 低 下2),Cd. の 腎 機 能 障 害3)で あ る,こ. vitroで. 1mM,. 吸 基 質10mM. ン酸 化 基 質0,3mM. ADP存. 在下. 各種 重 金 属 イ オ ンの 作 用 部 位 に 関 して は未 だ明確 に. の 溶 存 酸 素 濃 度 を ガ ル バ ニ ー 型 酸 素 電 極(給 水 化 学). は さ れ て い な い.し. を 用 い て 測 定 し,. か も こ のK+区. 画 性 の 低 下 は酸. Chance. 化 的 リ ン 酸 化 な ど の 他 の 生 体 膜 機 能 に 対 し如 何 な る. っ て 呼 吸 調 節 能(RCI),. 作 用 を 及 ぼ す か に つ い て も明 確 な る解 答 を 得 て い な. 温 度25℃,反. い の が 現 状 で あ る 、 そ こ で,著. 者 はK+区. 応 容 量2.5m1で. イ オ ン(Hg2+,. Cd2+,. Cu2+,. Zn2+)の. 種重 金属. 1,. 各 種 重 金 属 イ オ ン のK+遊 Brierlyら. 作 用 部 位 及 びK+. ア 膜 のK+に る の で,も. 材 料 及 び方 法. 0.25M庶. 0,25M庶. 糖,. 3mM. EDTAを 糖,. 3mM. 懸 濁 し た,(20‑50mg蛋. に 内 部K+は. Tris‑HCl. 用 い,遠. buffer(pH7.4),. は,重. 出作用. 金 属 イオ ン に よ り ミ トコ ン ド リ. 対 す る 透 過 性 が 増 大 す る と報 告 し て い し も ミ トコ ン ド リア 内 が 外 側 に 比 し てK+. buffer(pH7.4)中. やか. 外 側 に 遊 出 し て く る 事 が 予 想 さ れ,〔 図. 1〕 の 結 果 は 明 ら か に そ れ を示 して い る.即. 心 分 画 操 作 で 分 離 し,. Tris‑HCl. 行 な っ た.. の 濃 度 に 関 し高 ポ テ ン シ ャ ル 状 態 で あ れ ば,速 ミ トコ ン ド リアの分 離. 0,2mM. 方 法61に よ. を 算 出 し た.反 応. 実 験 結 果. 区 画 性 低 下 に よ る 他 の 膜 機 能 へ の 影 響 を 検 討 し た.. 1.. Williamの. 画性あ る. い は イ オ ンの 透 過 性 の影 響 を多大 に受 け る事 で知 ら れ て い る ミ トコ ン ド リ ア 膜 機 能 を 用 い,各. & ADP/O比. ち無 処 理. ミ ト コ ン ド リ ア で も わ ず か づ つ で は あ る が 時 間 と共. に. にK+を. 白/ml). 遊 出 し て い る が,重. を 著 し く 促 進 す る.こ. 1457. 金 属 イ オ ンは そ の遊 出. の 遊 出 速 度 はHg2+>Cd2+>.

(2) 1488. 長. TIME 図1.. 各 種 金 属 イ オ ン のK+遊. buffer 容 量.. (pH7.4) 3ml,各. Rat. No. Change. 反 応 条 件,各. 応 液,. 0.15M. choline. mitochondria(1mg蛋. chloride,. 白/ml).反. AC:. SH修 飾 剤 前 処理 ミ トコ ン ド リア のK+遊. Acceleration. 種 重 金 属 イ オ ン は10μM.. 示 し て あ る 結 果 は,. 亨. MINUTES. 出 作 用.反. liver. 川. 10mM. Tris‑HCl. 応 温 度25℃.反. 応. 種 重 金 属 イ オ ン の 濃 度10μM.. 表1.. NC:. IN. 谷. SH修. IH: DTT. Inhibition. 1mM,. 飾 剤 前 処 理 に よ り,無. 出現 象. NEM.. 10mM.. DTNB.. 0.1mM.. PCMB.. 0.1mM.表. 処 理 に 比 較 し て 変 化 し た か ど う か を 示 し て い る.. に.

(3) Ⅱ. 環 境 汚 染 物(重 金 属 な ど)の生 体 膜 に対 す る作 用. 1489. 比 較 し て 強 く エ ネ ル ギ ー 依 存 のMg2+の. 取 り込 み を. 活 性 化 す る 事 を 報 告 して い る8).著 者 は, K+遊 Cd2+,. Cu2+及. 出現 象. の 面 で,. Zn2+,. びHg2+がMg2+存. 下 で,如. 何 な 作 用 相 違 を 示 す か を 検 討 し て み た.即. ちMg2+. 5mM存. 在 下 の 各 種 重 金 属 イ オ ン に よ るK+. 遊 出 速 度 を 調 べ て み た.〔 図3.図4〕 如 く,. 在. Cd2+,. Zn2+はMg2+に. 認 め ら れ た.ま. た,. よ り明 ら か な. よ り阻 害 を 受 け る 事 が. Hg2+,. Cu2+に. よ るK+遊. 出はほ. と ん ど影 響 を 受 け な い 事 が 認 め ら れ た.以 は, Cd2+,. Zn2+,. Hg2+,. Cu2+のK+遊. 上 の結 果. 出 現 象 に 関 し,. Cd2+とZn2+の. グ ル ー プ とHg2+,とCu2+の. プ に 於 い て,作. 用 部 位(Mg2+結. グル ー. 合 部 位)に. 関 し異 な. る事 を 示 唆 して い る もの と 思 わ れ る. B.. SH基. との 関係. Ⅰの 実 験 よ り示 唆 さ れ た 如 く,各 に よ るK+遊. 出 は 各 種 重 金 属 のSH化. と 関 係 が あ り,膜 性 が 強 い)こ. 成 分 のSH基. ちSH保. Thretol)1mMを. ず れ の 場 合 に もK+遊. は 完 全 に 抑 制 され た.逆 MB(P‑Chloro. mido)で. 図2. 各 種 重 金 属 イ オ ンの濃度 依 存 性‑K+遊 出速 度.反 応 条件 は 図1と 同 じ. 順 に 強 く この 強 さは ほ ぼSH化. 合物. はHg2+,. Cu2+に. よ るK+遊. 出はいずれ も. 飾 剤 に よ る 阻 害 を 受 け な か っ た.. れ らSH修. 即 ち, SH基. た 作 用 を 示 し た.ま. Cu2+の. た,. 注 目 さ れ る.Ⅲ . K+遊. Zn2+に. 修 飾 剤 に 対 して も, Mg2+と. グ ル ー プ とHg2+,. 出速 度 と濃度 との 関係 は 〔図2〕 に示 す.図 か ら明 ら. ちHg2+は 直 線 的 に速. Malaii. は,こ. 金 属 イ オ ン に よ るK+遊. 関 係 は異 な る曲 線 を示 す.即. DTNB(Di. NEM(N‑Ethyl. れ に 反 し, Cd2+,. に対 す る各 重 金 属 の親 和 性 とほぼ一致 す る7)K+の 遊. か な 如 く,各 重 金 属 イ オ ンに よ って速 度 と濃 度 との. Benzoate),. Benzoate),. 阻 害 を 受 け た.こ. Zn2+の. Cu2+>Zn2+の. 出 現象. 修 飾 剤 で あ るPC. ミ ト コ ン ド リ ア を 前 処 理 す る と, DTNB,. PCMBで. μM/mgprotein. にSH基. Mercury. Nitro. 示 され. 護 剤 で あ るDTT(Di. 重 金 属 イオン添 加 前 後 に 反. 応 系 に 添 加 す る と,い. Thio. 合物 の 親 和 性. が 関 与 して い る 可 能. の 問 題 を 検 討 す る意 味 で 表1に. る実 験 を 行 な っ た.即 Thio. 種重金属 イオン. NEM処. よ る もの. 同 様, Cd2+,. グ ル ー プで 異 な っ 理 に よ って 各 種重. 出 が 全 て促 進 を示 した 事 は. 出 と 酸 化 的 リ ン 酸 化 反 応 との 関 係. 以 上 の 実 験 よ り明 ら か な 如 く,各. 種 重 金属 イオ ン. 度 が急 上 昇 す るの に反 し,他 の 金 属 イ オン(Zn2+を. は ミ ト コ ン ド リ ア膜 に 作 用 し,内. 除 く)は一 種 の 飽 和 曲 線 を示 す.こ の事 は各 金 属 イオ. る 事 が 示 さ れ た が,こ. ンに よ って,作 用 部位 が異 な る事 を示 唆 す る もの と. 的 リ ン酸 化 反 応 に 如 何 な る 影 響 を 与 え る か を 検 討 す る 事 は,重. 思 わ れ る. .. 各 種重 金属 イオ ンの作 用 部 位 の 検討 種重金属. 遊 出 させ. の事 は ミ トコ ン ド リアの 酸化. 金 属 イ オ ン の 細 胞 へ の 作 用 を 検 討 す る意. 味 で 重 要 で あ る.図5はCu2+を. 上 記 の 実 験 よ り明 ら か に さ れ た 如 く,各. 部K+を. 題 を 検 討 した もの で あ る.明. 例 に と って この 問 らか にCu2+の. イ オ ン の 作 用 部 位 が 異 な る事 が 示 唆 さ れ た の で,以. 依 存 し て ミ トコ ン ド リ ア 内 のK+は. 下 各 種 重 金 属 イ オ ン の 作 用 部 位 を 検 討 し て み た.. 逆 相 関 的 に 酸 化 的 リ ン 酸 化 反 応 も阻 害 を 受 け る 事 が. A.. 認 め ら れ た.即. Mg2+結 Brierlyら. 合 部 位 との 関 係 は, Zn2+,. Cd2+がCu2+,. Hg2+,. Ag+に. Hg2+に. 遊 出 し,そ. 濃度 に. ち脱 共 役 現 象 を 示 し た(Zn2+,. 関 し て も 同 様 な 現 象 が 観 察 さ れ た) .. れ と. Cd2+ ,.

(4) 1490. 長. 谷. 川. 亨. 図3.. Mg2+. 5mM存. 在 下,非. 存 在 下 のCd2+のK+遊 反 応 条 件 は 図1と gCl2. 5mM添. 出作 用 同 じ, M. 加.. uM/mgprotein そ れ 自 体 で 極 め て 著 し い 障 害 を もた ら す 事 は い う ま. 考. 察. で も な い. 次 に 各 種 重 金 属 イ オ ン のK+遊. 細 胞 膜 や ミ トコ ン ド リア膜 は物 質 の区 画 性 特 に イ オ ンの 蓄 積(細 胞 内,ミ mMの. 多 量 のK+を. Na‑K‑ATPase,ミ. トコン ドリア内 に約100〜150. 含 有 す る9.10)を細胞 膜 の場 合 に は トコ ン ド リアの 場 合 に は高 エ ネ. 出 作 用 部 位 に対 す. る 検 討 を 行 な う. 2.. Mg2+存. 在 下 に よ るK+遊. グ ル ー プ のK+遊. 出 が, Hg2+とCu2+の. 出 現 象 に は 影 響 な く, Cd2+とZn2+. ル ギ ー中 間体(状 態)の 関与 に よ って積 極 的 に保 持 し. の グ ル ー プ で は 阻 害 を 受 け る 点 か ら,. て い る9,10).そ して 蓄積 され たK+は. のK+遊. ン ド リア 内の 種 々のK+依. 細 胞 内 及 び ミトコ. 存 性 の酵 素 反 応 に関 与 し. た り11),ミ トコ ン ド リアのATP合. 成 反 応 に影 響 を与. え12),あ るい は生 体 膜 内 外 の イ オ ン濃 度 勾 配 に よ る膜 電 位 の発 生 を もた らす 等重 要 な作 用 を不 して い る. これ らの 区画 性 が 重 金属 に よ って失 な わ れ る事 は,. 出 作 用 部 位 にMg2+結. Cd2+とZn2+. 合 部 位 が 関 与 し て.い. る 事 が 示 唆 さ れ る. 2.. Mg2+に. プ とCd2+,. よ っ て 識 別 さ れ たHg2+, Zn2+の. グル ー プ は,. て も同 様 に識 別 さ れ た.即 プ はDTNB,. PCMB処. ち,. SH基 Hg2+,. 理 に よ っ てK+遊. Cu2+の. グル ー. 修 飾 剤 に対 し Cu2+の. グル ー. 出が 阻 害 を.

(5) 環 境 汚 染 物(重 金 属 な ど)の 生 体 膜 に対 す る作 用. 1491. 図4.. Mg2+5mM存. 在 下,. 非 存 在 下 のZn2+のK+遊 出 作 用.反. 応 条件 は図. 3と 同 じ.. μM/mg. 受 け,. Hg2+とCu2+の. グ ル ー プ は 膜SH基. 位 で あ る 事 が 示 唆 さ れ る.そ の グ ル ー プ はSH基. protein. が作 用 部. れ に 反 し, Cd2+とZn2+. が 作 用部 位 で な い事 を示 す もの. と思 わ れ る.. 3.. SH化. に 関 し,特. よ り各種 重 金 属 イオ ン. 出 が全 て阻 害 を受 け る事,及. び1,. にCd2+とZn2+と. 結. 2. の考 察 よ り,各 種 重 金 属 イ オ ンの結 合部 位 と作 用 部 位 と に差 が あ る事 が 示 唆 され る.即 ち, 3よ り明 ら かな 如 く,各 種 重 金 属 イ オ ンの結 合部 位 がSH基 あ り, Cd2+とZn2+の. で. グル ー プは 作 用 部 位 がMg2+. 結 合 部 位 で あ り, Hg2+とCu2+の 位 がSH基. 金 属 イ オ ン の う ち,結. 合 部位 と. 金属の作用部位. に 関 し新 た な る 知 見 を. 加 え た も の と 考 え る.. 合 物 で あ るDTTに. に よ るK+遊. 以 上 の 結 果 は,重. 作 用 部 位 と が 異 な る も の も あ り,重. グ ル ー プ の作 用 部. で あ る事 が 示 唆 され る.. 各 種 重 金 属 イ オ ン(Hg2+,. 論 Cd2+,. Cu2+,. ッ ト肝 ミ ト コ ン ド リ ア膜 に 対 す るK+遊. Zn2+)の. ラ. 出 作 用 を検. 討 し以 下 の結 果 を 得 た 。 1.. 各 種 重 金 属 イ オ ン はHg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+. の順 に ミ ト コ ン ド リ ア 内 よ りK+を 順 序 はSH化. 遊 出 さ せ,こ. の. 合 物 に対 す る これ ら重 金 属 イ オ ン の 親.

(6) 1. 1492. 長. 谷. 川. 亨. CuCl2(μM) 図5.. cucl2処. 理 ミ ト コ ン ド リ ア のK+遊. 遊 出 は 図1と は 図1の. 同 じ,酸. 出 と酸 化 的 リ ン酸 化 反 応 と の 関 係.反. 化 的 リ ン酸 化 反 応 は 材 料 及 び 方 法 を 参 照,但. Mg2+. はK+遊. 5mM存. 応 条 件:. K+. トコン ドリ ア. 濃 度 を 使 用.. 和 性 に ほ ぼ一 致 す る. 2.. し,ミ. 5.. 在 下 で, Cd2+とZn2+の. 出 が 阻 害 さ れ,. Hg2+とCu2+の. 以 上 の結 果 よ り, Hg2+とCu2+の. Cd2+とZn2+の. グル ー プ グル ー プ は. グ ル ー プのK+遊. グ ル ー プ と,. 出 作 用 部 位 は異 な. る事 が示 唆 され た.. 阻 害 を 受 け な か っ た. 3.. SH基. 修 飾 剤 で あ るDTNB,. り, Hg2+とCu2+の Cd2+とZn2+の 4.. SH化. PCMBの. グ ル ー プ はK+遊. 本 論 文 を 擱筆 す る に当 り,御 懇篤 な る御 指 導 及 び. 処理 によ. 御校 閲 を賜 わ っ た恩 師 緒方 正 名教 授 に深 甚 の謝 意 を. 出 が 阻 害 され,. グ ル ー プ は 阻 害 を 受 け な か っ た. 合 物 で あ るDTTに. オ ン のK+遊. 表 します.又 終 始,御 鞭 撻 をい た だ い た内 海 耕 慥 助. よ り,全 て の 重 金 属 イ. 教 授 に感 謝 致 し ます.. 出 は 阻 害 を 受 け た.. 文. . Gajdos, 2). A.. 三 浦 豊 彦,斉. and. 京pp. 3) Ibid.. 藤 一,狩. 796‑802,. Brierly,. G. P.:. 5). Passow, H."The. 野 広 之,藤. M.. Arch.. 本 武,多. Environ.. 田 治 編 集.新. Health,. 23:. 270-274,. 1971.. 労 働 衛 生 ハ ン ド ブ ッ ク,労. 働 科 学 研 究 所 発 行.東. 1974.. pp 787-789,. 4). York.. Gajdos-TSrak,. 献. 1974.. J. Biol. Chem. 242: 4324-4328. 1967. red blood Cell.. pp. 71-145, 1964.. Bishop,. C and Surgenor,. D. ed.. Academic. Press.. New.

(7) 環 境 汚 物(重 金属 な ど)の 生 体 膜 に対 す る作 用. 6) Chance, B and Williams, G. R.:. Adv,. 7) Passow, H. The red blood cell: tals,"Effects off, J.,. of Metals. in Enzymol,. Penetration,. on Cells,. Distribution,. Subcellular. Coleman, J. R. and Miller, M. W.,. 17: 65-134, Elements,. Charles. 1493. 1956.. and Toxic Actions. of Heavy. and Macromolecules". ed.. C Thomas Publisher. USA,. pp.. Me. Manil 291-344,. 1973. 8) Brierly, 9). 長 野 敬,中. G. P.:. J. Biol.. 尾 真,赤. Chem. 242: 1115-1122, 1967.. 血 球 の 能 動 輸 送(能. 動 輸 送.井. 上 章,品. 川 嘉 也 編,南. 江 堂,東. 京),. pp.. 205‑229,. 1969. 10). 畠 瀬 修,小 251‑280,. 田 琢 三,ミ. ト コ ン ド リ ア の イ オ ン輸 送(能 動 輸 送,井. 上 章,品. 川 嘉 也 編,南. 江 堂,東. 京),. pp.. 1969.. 11) Schaffer, P. C. and Veneziale, 12) Gomez-Puyou, A., 5339-5345, 1969.. C. M. Eur. J. Biochem.. Sandoval, F.,. Pena, A.,. 35: 18-22, 1973.. Chavez, E. and Tuena, M.:J.. Biol.. Chem. 244.

(8) 1494. 長. The. effects and. of. various. Zn2+). on. 谷. heavy. metal. mitochondrial•@ to. Department. of. K+. Public. The. effects. 1). Hg2+,. Cd2+,. increasing 2). level. The. release 3). of. In. an. K+. the. of by. and. K+. Hg2+. presence. by and. of. to Cd2+. ImM. Prof.. metal. was. DTT,. Hg2+,. Cd2+,. specific. Cu2+. reference. Masana. ions and. Medical. School. Ogata). such. the. the. University. as. Hg2+,. following. Cd2+,. potassium. results ion. were. from. the. Cu2+. and. Zn2+. on. with. the. but. the. obtained; mitochondria. compounds. and. Cu2+. with. Okayama. released. SH. as. HASEGAWA. investigated Zn2+. affinity. (such. mentation. Health,. heavy. were. Cu2+ of. release of. various. membrane. ions. compart. (Director:. mitochondrial•@. 亨. membrane. Tohoru The. 川. Zn2+ not. the. was. inhibited. in. the. of. these. presence. of. Mg2+,. affected. release. of. K+. by. all. metal. ions. was. completely. inhibited. 4). The. K+. release. the. thiol. fencially not. inhibited. 5). The. metal. ions.. by release. by. Hg2+. component these of. and of. Cu2+. was. membrane. inhibited protein,. by but. DTNB the. or. release. PCMB by. which Cd2+. bound and. Zn2+. pre was. reagents. K+. decoupled. the. oxidative. phosphorylation. by. treatment. of. the. heavy.

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