東 金 沢 大学 医学 部 公 衆 衛 生 学 講 座 く主 任

8 8 0 金 沢 大学 十 全 医 学 会椎 誌 第9 9巻 第5号 88 0 ⁻8 9 3 く1 9雲嘲

N M D A

I

複合体

高

性

結合部

関

金 沢 大学 医学 部 公 衆 衛 生 学 講 座 く主 任^二岡田 晃 教 授つ

八 田 耕 太 郎

く平成2年¹0月2 4 日受 付1

最 近， 非 常^によ く洗 浄し た ラット大 脳 皮 質 膜 標 晶を 用^い た^レセ プ タ ^ー 結 合 実 験^{に お い} て，

N ⁻m ethyl⁻D⁻a Spa rtateくN M D Allphe n cycli d in eく^{P C P}l ^{レ セ}プ タ ^ー イ オ^ンチャ ンネル複 合 体^に低 濃 度^の M g^{2 ＋}に対し て高^い親 和 性を有し，仁^3Hコ^{N −1 1−}E^{2−th ie n}ylコ^{cyclohe xyl}l⁻3，4⁻pipe rid in eくE^3Hコ^{T C P}l 結 合 を促 進す る部 位 く高 親 和 性M _g^{2 十}結 合 部 位1 が存 在す ること が 掛 昌さ れ て^いる^． ま た， この高 親 和 性 M g

2＋

結 合 部位はグ^ルタ ミ^ン酸 結 合 部 位 くある^いは N M D A ^{レ セ} プ タ^ー1 や グ リ^{シ ン}結 合 部 位と の間に何 ら^かの機 能 的な相 関を有す ること が 示唆さ れ て^いる． そ^こで本 研 究で は， 非 常^によ く 洗浄し た ラット大 脳 皮 質 膜 標 品^に対す るE^3Hコ^{T C P 結 合を指標と して， N M D AIP C P レ セプ タ ー イ オンチャ ンネル複 合 体}

に おけ る高 親和 性 M g

2 ＋結 合 部 位の性 質を競 合 的N M D A ア^ンタ ゴ^ニ スト お よ び選 択 的 グリ^{シ ン}ア^ンタ ゴ ニス ト を 用^いて調^べた^． 競 合 的N M D A アンタゴ ^ニ ス ト である 3^一くく^士1⁻2⁻C a rbo xy pi_pe r a zinヰyll⁻ p^{r o}p yl⁻l^．pho spho nic a cid く^{C P P}l， D⁻2⁻a min o^．5^．pho spho n ope nta n o ate くD⁻A P 5J ^お よ び 2⁻a min o⁻7⁻ pho spho n ohep t^{a n o a}te くD， L⁻A P 71 の 1 J^L M L^．グ^ルタ ミン酸， 1J^L M グリ^{シ ン お}よ び 3 0 0J^J M M g^{2 十}に よ るL^3Hコ^{T C P} 結 合 清 性 化^に対す る影 響を検 討し た と^ころ． いずれ の N M D A アンタゴ ^ニスト も そ れ ぞ れ濃 度 依存 性^にL^3Hコ^{T C P} 結 合 活 性 化を完 全に抑制し た^． し^かも， N M D A アンタ ゴ^ニストの いずれ も 低 濃 度の M g^{2 ＋} によ るC^3Hコ^{T C P 結 合の活 性 化を最も強く抑 制し， そ の順 序は， M g2 ＋}i グリ^{シ ン ン} L⁻グ^ルタ ミ^ン酸であっ た^． 1jL M L⁻グ^ル タ ミ^ン酸1 _JL M グリシ ンお よ び 3 0 0J^L M g

2十

に よ^っ て活 性 化さ れ る E^3Hコ^{T C P 結 合に対す る選 択 的 グリシ ン アンタゴ ニ スト である 6， 7−d ich lo r oquin o x alin e−2，}

3⁻dio n e く^{D C}QXJ， 7^．chlo r okyn u r e nic a ci d く7⁻C I K Y N Al お よ び 3⁻a min o⁻1⁻hydr o xy⁻2⁻p yr r Olido n e

くH A⁻9 6 61 の作用 は 以下の通り^であった． D CQ X は L⁻グ^ルタ ミ^ン酸お よ び M g^2＋ によ るE^3Hコ^{T C P} 結合 活 性化^に対す る抑制^に比^べてグリシ ン によって活 性 化さ れ るL^3Hコ^{T C P} 結 合を最も強く抑 制し た^． H A⁻9 6 6 はグリシ ン およ び M g

2 ＋ によっ て活 性 化さ れ るE^3Hコ^{T C P} 結 合を同 程 度に抑制し た が， L^rグ^ル タ ミン酸^によ る仁^3Hコ^{T C P 結 合の活 性 化に対し て抑 制を 示 さ な か っ た． 7−CI K Y N A は L−グルタミ ン} 軌 グリシ ンお よ び M g

2 ＋によ^って活 性 化さ れ る E³Hコ^{T C P} 結 合を同 程 度^に抑 制し た^． 以 上 の結 果は，

N M D AIP C P ^{レ セ}プ タ ^ー イ オ^ンチャ ンネ^ル複 合 体^に高 那口性M _g^{2 ＋}結 合 部位が存在す る という推 論を強 く支 持す る知 見であり， ま た同 部 位が競合 的N M D A ア^ンタ^{ゴニ ス}ト結 合 部 位と機 能 的^にき わ め て密 接 な相 互 調 節 作用 を有す ること を 示唆し て^いる^． さ ら^に高 親 和 性 Mg^2＋ 結 合 部 位がグリ^{シ ン}結 合 部位との

間^にも緊密な相互調 節 作用 を有す ること が推 測さ れ る^．

E ey ^{w o r}ds N M D AI ^{P C P r e c e}p t^{o r} io n cha n n el c o mple x， E^3Hコ^{T C P}

bind ing^， M _g^{2 ＋} biⁿd iⁿ_g ^site

， N M D A a ntag^{o n}ist， gl_ycin e a ntag^{o n}ist

A b br e viatio n s こ7⁻CI K Y N A ，7⁻Chlo r ok_yn u r e nic a cid_三C P P，3⁻くく^士l^{−2−C a rb ox}y pi_pe r a zin⁻4 ⁻_y11

p^{r o}p yl^．l⁻pho spho nic a cid _こ D⁻A P 5， D⁻2⁻a mi_{n o}⁻5⁻_pho spho n op^{e n}ta n o ate ニ D CQ ^{X， 6，7．} dich l_{o r oq}uin o x alin e⁻2_，3^儀d io n e，i D ，し A P 7， 2⁻a min o^．7⁻_pho spho n ohep t^{a n o a}te i H A ^，96 6， 3⁻

N M D AIP C P レセプ タ ^ー イ オ^ンチャ ンネ^ル複 合体

フ^ェンサ イ ク リ ジ^ンくphe n cyclid in e，P C Pl は， 呼吸 器系や循 環 器 系を抑 制し な^い優れ た麻 酔 薬と し て導入 さ れ た^． ところ が， 臨 床^に導入 さ れ て間も な く興 奮．

奇妙な行 動． 幻 覚^{な ど を}引き起^こす^こと が明ら か と な り， 麻 酔 薬と し て臨 床で使 用さ れ ること は な く なっ

た． 臨 床で の使用 が中止 さ れ る の と相 前 後して _， P C P は ア メ リ カ合 衆 国^{で 一一}a ngel du st^{7 ，} と呼ば れ て乱

用 さ れ る よ う^にな り， 最 近で は第2 位の乱用薬 物^と なって^いる^{り2 J． 一} 方， 長 期 間の乱用 は精 神分 裂 病 様の 多彩な臨床 像を呈す る精 神障 害を惹 起す ること^瑚 や精 神分裂病を増 悪さ せ ること が明ら^かと な り^句， 以来，

精神分裂 病^の新た なモデルと し て注目 さ れ る よ うに なって^いる^{1 衿，■} そこで，P C P の中枢 薬理^に関す る研 究 が多方面か ら行わ れ て^いる が， 未だ ^一 致し た見解は見

いだ さ れ て^いない ． し か し， 最 近，P C P に対す る^{レ セ} プ タ^ー が脳 内^に広く分布し て存 在す る^こと が見いだ さ れ^柵，P C P の中枢 作 用はこ の レ セプ タ ^ー を介し て発 現 す る の で は な^いか と推 測さ れ， P C P レ セプ タ^ー の特 性を薬理学 的， 分子生 物 学 的に解 明し よ う と す る試み

が行わ れ て^いる^{2 瑚}．

現 在， P C P レ セ プ タ ^{ー に} は， CD^{N −m eth}yl⁻D⁻

a spa rtateくN M D AJ レ セプ タ^ー と共 役す る タ イ プ とe

J レセプ タ^ー と共 役す る タ イ プ の 2種 類が想 定さ れ て いる^{1 01．} N M D A レセプ タ ^ー と共 役^{す る P C P レ セプ} タ ^ー は， N M D A レセ プ タ^ー と複 合 体を形 成し ている イ オ^ンチャ ンネ^ル内^に存 在す る と考え ら れてお り^{1 い}，

全体と し て N M D AIP C P レ セプ タ ^ー イ オ^ンチャ ンネ ル複 合 体 く^{N M D A}J P C P r e c ep to r io n cha n n el

C O mple幻 と呼ば れ て^いる． こ の複 合 体は， イ オ ^ン

チャ ンネ^ル内に存 在す る^マ グ ネ^シウムイ オンくMg^2＋1 結合部 位^{1 2 ，1 3 ，}， N M D A くあ る^いは グ^ルタミ ン酸1 結 合 部

位^{1 1 ，}， グ リ^{シ ン}結 合 部 位^{1 4 ト岬}， 亜鉛イ オ^ンく^Zn2り 結 合

部位^{1 7 ト瑚}， ポ リ ア ミ^ン結 合 部位^{式 服冊}を有し， そ れ ぞ れ の

間で相互調 節 作用 がある と考え ら れ てい る1 2，1 鋤1 91 とト卿

と^ころで_， イ オンチャ ンネ^ル内^に存 在す る M g^2十結 合部位は電 位 依 存性 く^{V O}ltag^e−dep^{e n}de nt m a n n e rJ ^に

チャ ンネ^ルを 阻害し^{祁 ト 3 2，}， 里 で標 識し た P C P のア ナ

ログ仁^3Hj^{N −}く1⁻仁^{2−th ie nyl}コ^{cyclohe xyl}l⁻3，4^．pi_pe ri^． din eくE^3Hj^{T C P}l の P C P ^レセプ タ^{ー へ}の結合を阻害す る と考え ら れ ている ^錮 ． ご く最 近， 非 常に良く洗 浄し た ラット大 脳 皮 質^{ホ モ}ジ ネ ^ー ト を 用^いた^レセプ タ ^ー 結 合実験に お い て ，3 0叫 M 以下^の低 濃度のM _g^2＋を認 識 し て仁^3Hコ^{T C P} 結 合を活 性 化す る部 位 く高 親 和 性

a min o⁻1⁻h_ydr o xy⁻2⁻_{p yr r O}lido n ei E^3Hコ^{T C P}， E^3Hコ

8 81

M _g^2＋結 合 部 位1^， 即ち M g^2＋ に対す る高親 和 性 結 合 部 位の存 在が提 唱さ れ て^いる^瑚． こ の高 親 和 性 M _g^{2 十}結 合 部 位は，仁^3Hコ^{T C P} 結 合を活性 化す る だ け で な く．

反応 初 期 速 度^{を 上}昇さ せ る^こと^， 仁^刊コ^{T C P} 結 合 活 性 化はグ^ルタ ミ^ン酸やグリシ ン によ る仁^3Hコ^{T C P} 結 合活 性 化^に対し て相 加 的で あ ること， さ らに M _g^{2 ＋}によ る

仁^aHコT C P 結 合の親 和 性は グ^ルタ ミン酸やグリシ ン に よ^って さ らに高 親 和 性側^に移 行す る^こと な ど が明らか にさ れ^{て い}る^おI． この ような知 見は， 高親和性Mg^{2 ＋}結 合 部 位と グ^ルタ ミ^ン酸結 合 部 位 くあ る^いは N M D A レ セプ タ ^ー一^対や グ リ^{シ ン}結合 部 位^{抑と の}間^に何らか の機 能 的な相 関が あ る^こと を 示唆し て^いる^． 新たに見^いだ さ れ たこの高 親 和 性 M g^{2 ＋}結 合 部 位の性 質を明ら かに す ること は N M D AJIP C P レ セプ タ^ー イ オ^ンチャ ンネ ル複 合体^の中枢 神 経 系^にお け る機 能的 役 割を 理解す る 上 で き わ め て重 要で あ る と^いえ る が， その詳 細は未だ 十 分^に検 討さ れ て^いな^い． そこで， 上述し た グ^ルタ ミ ン酸 結合 部 位 くあ る^いは N M D A ^レセプ タ^ー1 や グ リ シ ン結合 部 位との間^に想 定さ れ て^いる機能 的 相 関を考 え る 上で_， 高 親 和 性 M_g^2＋ 結 合部 位に対す る N M D A ア^ンタ^{ゴニ ス}ト や グ リシ ンアンタ^ゴニストの作用 を検 討す ること は高 耗和 性 Mg²

＋ 結合 部 位の性 質を解 明す る ^一 つの有 力な手段^にな る と考え ら れ る^．

そこ で今回， ラット大 脳 皮 質^{ホ モ}ジ ネ^ー トに対す る

E^3Hコ^{T C P} 結 合^を指 標と して， 競合 的N M D A ア^ンタ ゴ^ニ ス ト^{3 8，} で あ る 3^一くく士ト2⁻C a rb o xy pipe r a zin^．4⁻_ylト

Pr Op yl⁻l⁻pho spho nic a cid くC P P1^{3 9 ト 4 1，}， D⁻2^一年^min o⁻

5⁻pho spho n ope nta n o ateく^{D−A P5}1^{4 2 鳩}， 2⁻ami n o⁻7^．pho⁻ Spho n ohep ta n o ate m ，L^．A P 7I^叫， グ リ^{シ ン}ア^ンタ^ゴニ

ス ト ^であ る 6， 7⁻dich lo r oquin o x alin e⁻2， 3⁻d io n e

くD CQXl ^朋 ， 7⁻Ch lo r ok_yn u r e nic a ci d く⁷−^{C I K Y −}

N AJ^4714Bl． 3⁻a min o心 hydr o xy⁻2⁻p y^{r r O}li do n e くH A⁻ 9 6 61^{4 9 動} を 用^いて N M D AIP C P レ セプ タ ^ー イ オ^ンチャ

ンネ^ル複 合体^{に お}け る高 親和 性 M g^2十結 合 部 位の性 質 を詳 細^に検 討し た と^ころ非常に興 味あ る結果 を得たの で こ こ に報 告し^， 若干の考察を加え る^．

材 料^およ び 方 法

I ^． 薬 品

本研 究^{に お い}て使用 し た薬品 は次の通りであ る^． L⁻グルタ ミ ン酸， グ リ^{シ ン} くS igm a C he mic al Co m pa ny， St． Lo uis， M O， U^．S^．A上 ^{C P P， D−}A P5_， し A P 5， D_， L⁻A P 7， D CQ X， 7⁻C I K Y N A ， H A⁻9 6 6

N ⁻く¹⁻E^{2 −t}hie nylコ^cy^clohe xyll^−3，4−Pi_peri din eニ N M D A ， N ⁻m eth_yl⁻D⁻a Sp^{a r}tateニP C P，phe n cy^clidi_{n e}

88 2 八

くT o c ris Ne u r a min Ltd．， Bu ck hu r st H ill， U ^．KI^．ニ

E^3Hj^{T C P く47．8 C ilm m oll くNe w Engla nd N u cle a r，}

B o sto n，M A ，U．S ．A1．IP C P は 塩 野義 製 薬 株 式会 社 伏 阪1 よ り提 供を 受 け た^．

工工． 実験 方法 1 ^． 膜 標 品^の調 製

W ista r 系 雄 性ラットく¹5 0 ⁻2 5 0gl を断 頭し， 直ちに

脳を取り出し， 大 脳 皮質を 0^．3 2 M s u c r o s e でホモ ジ ネ ^ー 卜 し て， 9 0 0x g^， 1 0分 間， 4 ⁰C で遠心し た^■ 上清 を再びホ モジ ネ ^ー 卜 し た乳 20 ^，0 0 0X g^，2 0分 間， 4⁰C で遠心 し て沈 澱部 分 くP2分 酎 ^を得た⁻ P²分 画 中^に存 在 す る内因 性ア ミ^ノ酸な ど を可能な限り除去す る目 的で 以下^に述^べる操作を行^った^． 先 ず． P²分画に2 0倍 量の 5 0m M Tris⁻H C l pH 7．6ノ1 0m M E D T A 緩 衝 液 く緩 衝 液Aンで ホ^モジ ネ^ー ト し， 2 0，0 0 0X g， 2 0分 臥 4 ⁰C で 遠 心^．洗 浄を行った． 得ら れ た沈 漆を2 0倍 量の緩 衝 液 A で^{ホ モ}ジ ネ ^ー ト し た後， 3 7⁰C ， 1 0分 間の プ^レイ ^ン

苫

． 1

．

−

d

冒

三

三

P u コ

． q d U

こH

L

キ^{ュベ ー シ ョン}を行^い， 上述し た条 件^で2 回目の洗 浄^．遠 心し た^． こ こ で得ら れ た 沈津を2 0倍 量の緩衝 液 A で ホ モジ ネ ^ー 卜 し， ドライ ア イ^スを 用^いて凍 結， 融 解 tfr e e zing⁻tha wingl を行^い ， 3 回目^の洗 浄^．遠 心し た． 最 後に得ら れ た沈 漆は， 5m M T ris⁻H C l 緩 衝 液 くpH 7．引^{で ホ モ} ジ ネ^ー 卜 し， 超 低 温 庫 く⁻8 0⁰Cl 内^に保

存し た0

実 験 当日， 凍 結保 存し た膜 標品 は， 室 温^で融 解し た 後， 2 0倍 量の 5^m M Tris^．H E P E S 緩 衝 液 くpH 7^．61 を 用^いて 2 0，0 0 0X g， 2 0分 臥 4⁰C ^で2回 目 洗 浄 ^一遠 心

し^， 結 合 実 験^に供し た^． 2 ^． E^里コ^{T C P 結 合 実 験}

膜 標 品 く蛋白 量10J^L gl は，5nM E^3Hコ^{T C P お}よ び必 要^に応じ た濃 度の賦 清剤 ある^いは阻 害 剤と共^に 5mM T^ris⁻H E P E S 緩 衝 液 くpH 7^．61 ^で2 3⁰C ^にて 1 時 間イ^ン

キ^{ュベ ー ショ ン}し た． イ^ンキ ^{ュベ ー ション}は ポ リ プロ

ピレ ンチ^{ュ ー} ブくFalc o n， NJ，U ．S．A．1 ^の中^で全 体 量

F i_g．1． E ffe cts of しgluta mate， glycin e a nd M g

2＋

o n E^3Hコ^{T C P bind in}g to r at c 。rtic al ^m e mbr a n e s． くAl^こE ffe cts of L^．glut_{a m}ate a nd glycin e． Fr o z e n⁻tha wed

a nd e xte n siv ely w a shed r at c o rtic al m e mbr a n e s w e r e in c ubated with 5 nM

亡^3Hコ^{T C P a nd i}n c r e a sing c o n c e ntr atio n s of L^．gluta m ate く■l^{o r} gly^cin e く^Al く0⁻1 0 0_J^LMl^． くBl^ニE ffe cts of M _g^2＋． Fr o z e n⁻tha w ed a nd e xt_{e n s}iv ely w a shed r at c 。rtic al m e mbr a n e s w e r e in c ubated with 5 ⁿM E^3Hコ^{T C P a nd v a rio u s}

c o n c e ntr atio n s of M _g^2＋ く0⁻1m Ml^． T he r e s ults w e r e o n e r epr e s e ntativ e e xpe rim e ntfr o m atle a st thr e e s epa r ate e xpe rim e nts e a ch r u n in triplic ate．