金沢大学医学部微生物学教室（主任 西田尚紀教授）

Cl． welchiiの血清学的型判定法と毒素型判定法の比較

1．人糞より分離したC1． welchiiの凝集西

金沢大学医学部微生物学教室（主任 西田尚紀教授）

     吉   沢    潤

      （昭和41年3月3日受付）

 Clostridiaの分騒ではその血清学的分類はいろい ろ試みられているが1）2），species或いは型判定の規 準或いは補助として殆んど用いられていない．その最 大の理由は，凝集反応の値がその病原性と最も関係深 いと考えられる毒素の強さ或いは性質を必ずしも指示

しないことにあると思われる3），

 CI， welchiiの凝集反応についてはすべての教科書 4）5）はstrain−specificityであると記載し，型別を 凝集反応によって行なうことは不可能であると述べて いるが，これは自然界に存在するCl． welchiiの殆 んどを占めるA型菌についてのことであって，B．C．D．

E．F．型に型別の共通抗原が存在することについては既 にHenderson 6）， Bergmann 7）が述べている．しか しながら．これらの研究はいずれも毒素判定をして型 を決められたものについての抗原分析であって，実際 のB．C．D．E．F各藩の分離同定にどの程度に役立ちう るかについて試みた入はいないように思える．勿論，

型同定には毒素判定法が現行の基準であるから8）9），

常に毒素と照合して凝集反応法の価値をきめるべきで あるが，毒素判定法そのものも必ずしも完全なもので なく現在止むを得ざるもの10）として用いられているこ とから之にかわる方法が望まれていることも実際であ る．かかる意味において私はB．C．D．R型の各型の凝 集抗原が実際に供されるか否かを検討したいと考えて

この実験を計画したが，これに先だち，凝集反応が不 可能とされているA型菌についてこの事実を確かめる べく実験を行なった成績について述べたい．

実 験 方 法

（1）使用菌株：

 A菌型として，PB 6 K， SR−12， H：obbsのNo．1 からNo．11（但しNo．4を欠く），人糞よりの分離

株183株．B型菌はL5，3110． C型菌は3182，3227．

D型菌はL8， Lgを用いた．但しPB 6 Kは教室保存

の；標準株，SR−12， L5， L8， Lgは英国Leeds大学の

所蔵株を分与されたもの，Hobbsの株は北海道干網 の飯田広夫氏より分与され，分離株183株中115株は入 糞の70。10分加熱分離株41株及び100。10分加熱分離株 74株で残り68株は時期を異にレ入糖から70。10分分離 株37株，90。10分の14株，100。60翻し17株よりなる．

その他は英国のNCTCから得たものである．

（2） 抗血清の作製法：

 初めZeissler平板で15時間培養の菌を用いたが，

Henderson， Mandia及び多くの著者は加熱抗原より ホルマリン抗原を推奨しているので後にPope消化 培地或いは3％プロテオーゼペプトン（大五もしくは Difcoのいずれでもよい）にglucoseを1％に加え たもので9時間培養の菌を用いた．悪用された菌は生 食水で1回洗瀞するにとどめ元培養液量の5分の1の 濃度にしたものを用いた．この際用いた菌の稀釈液は 0，5％ホルマリン加生食水であった．その免疫術式は，

3日間隔で0．5，1．0，1．0，1．5，2．0，2．0，2．0，

3．0，3．0，3．Om1をウサギの耳静脈に注射した．菌 液は古くなると塊状の外観を示すことがあったので2 週間ごとに新しく作り直した．上記の注射終了後，試 験採血を行ない充分な凝集価を示すとき，最終の注射 から7〜10日目に全採血を行ない，血清を分離し，56

。C水浴中30分加温し非働化し，これに1％マーゾニ ン溶液を1／100容加え冷蔵庫に保存した．

（3）凝集反応の方法：

 抗原液の作製：Zeissler平板の菌を用いる場合，

Zeissler平板で24時間嫌気培養した菌を集め，液体 培地の菌を用いる場合15m1入りの中試験管に10％

肉カス加クックドミートブロースで12時間培養した上

 AComparison of a Serological Typeing with the Routine Toxin Typing Method

for C1． Welchii I． Agglutinability of Cl・welchii Strains Isolated from H：uman Feces・

Jun Yoshizawa， Department of Bacteriology（Director：Prof． S． Nishida）School of

Medicine， Kanazawa University．

液1mlを移植し9時間培養し，その遠心沈渣を洗う ことなく0．5％ホルマリン加生食水で均等な浮遊液と

した．

 凝集反応の手技：前記の方法で作製保存した抗血清 を生理食塩水で12．5倍に希釈し，これより倍々希釈血 清列各0．5mlを小試験管に作り，これに前述の保存 菌液（0．5％ホルマリン加生食水に浮遊し氷室に一夜 入れて置いたもの）を使用に際しMcFarland No．5 11）相当の菌濃度になるまで更に0．5％ホルマリン加生 食水を加え，これを抗原液として各倍々希釈血清列に 0．5mlずつ加える．判定に際しては従って第1本目 が25倍で始まる数値となる．但し別法として，前記の 5倍濃度の菌液を各血清列に1〜2滴滴下する方法も あるが判定には殆んど差がなかった．但しこの際の凝 集価は血清そのものの希釈数値で判定した．判定は37

。C艀卵器中4時間後に一応の値を見，更にこれを冬 なら室内に夏なら氷室に翌日まで置いて判定した．判 定の基準は，まず肉眼で明らかな凝集を見，疑わしい 凝集に対して凝集鏡を用い最終判定をした．

 吸収血清の作製法：Zeissler平板で24時間培養し た菌または液体培地で9時間培養した菌を遠心し集菌 しこれを原血清にそれがドロドロになるまで加え，37

。C艀卵器に2時間入れ作用させた後遠心し，その上 清に更に同じ菌を追加し37。C 2時間作用させた後氷 室に一夜放置し，その遠心上清を吸収血清とした．

実 験 結 果

（1）PB6K， SR−12，生理，各菌株相互の関係  A型標準株PB6K，及びSR−12の2株と，人糞より 100。60分加熱分離株 生理 の1株に対する抗血清を 作製し，抗原として各Zeissler平板24時間培養の菌 を0．5％ホルマリン生食水に浮遊させたものを用い，

相互の関係を交差凝集反応によって検討した．結果は 表1の如くであり，二二いずれも株特異性を示した．

それで抗原を加熱処理（80。30分，80。60分，100。30 分，100e60分加熱）し加熱抗原での交差凝集反応を行 なったが，やはり他の株と凝集することはなかった．

また，PB6K及び生理は80。30分以上の加熱により抗 原性状が変化して被凝集性の消失しているのに対し SR−12のみは80。60分までの加熱処理に対し被凝集性 が保たれていることがわかった．

（2）PB6K， SR−12，生理と他の分離菌との関係  先ず人糞由来の分離株6株を用いてPB 6 K， SR−

12，生理の抗血清と凝集反応を試みた結果，生理抗血 清によく凝集する1菌株No．41（凝集価800）を偶然 発見したので，更に入糞由来の分離菌115株を全部

Zeissler平板に24時間嫌気培養しその菌を用い．先

ず生理抗血清（15倍），PB6K（10倍）， SR−12（10倍）

の三者混合抗血清でタメシ凝集反応を行ない凝集した ものについて定量的凝集反応を行なった．その結果は 表2の如くで，人由来の分離菌の殆んどはこれら各抗 血清に対し凝集しないものであった．恥く小数の凝集 を認めたものに限っていえばLaboratory strainの PB6K， SR−12よりも教室で分離した生理株に対し凝 集しやすい傾向が見られた．

（3）Hobbsの各菌株相互の関係

 Hobbs 12）が食中毒から分離した株について血清型 を樹立しているので，この菌を用いて我々の分離した 菌との血清学的関係について検討した．先ずHobbs の各菌相互について交差凝集反応を行なうと，表3の 如く，かなりの弘仁相互の共通性が認められた．また これらの抗血清はB．C．DL各型の菌とも低凝集価で反 応を起した．しかし各型に一番よく共通性を示した No．6またはNo．9で各抗血清を吸収し，次いでこ の吸収血清について凝集反応を行なうと表4（No．6 で吸収した場合）の如く吸収後の各抗血清はそれ自体 の抗原のみと凝集するものとなった．この吸収血清を 用いて前述の分離株115株で凝集反応を試みたが殆ん どすべての株は凝集することなく3株だけ25倍の凝集

表1 C1． welchii PB6K， SR−12，

  生理株相互の交差凝集価 抗血清

PB5コ

口R−12

生 理

使用抗原

PB6K

SR−12 生 理

PB6K

SR−12 生 理

PB6K

SP−12 生 理

抗原作製の条件

非鰍§謝18劉1謝翻

25600   0   0  0 800  0

 0  0

1600

︵U︵UO

 0 400  0

000 ︵UOO

 0 100  0

00︵U

OAUO

000︵UOO ︵UOO0ハUO000

表2  C1． welchii PB6K， SR12，

 生理株と入由来分離株の関係

抗血清

生 理

PB6K

SR−12

  下記凝集価を示す株数

800   200   100  50〜25   0 3   2   1   5   104 0   0   0   2   113 0   0   0   1   114

表3 Hobbsの各株相互米の交差凝集反応

Hobbs

三型株

123567891011

各  型  の  抗  血  清

1 2

3 6

7 8

9 10 11

1600  50  25  25

 0

 50

 0

100  50

 0

100−

1600

一一

Q5

 −50

 50

 0

 25 100  50  25

25 50 800

100

50  0  0 50 25  0

 50

100

 50  50 3200  50

100

 50  25

100

100

 0  0

 50  50 1600

100

 50  50  50

 0

100

 0

 25

100 100

3200

100

 0

 25

 50  50

 50

 0

 50  50

100

1600  50 100

 50  50  25  50

 25  50

 0

 50 1600  50

 0

 50

 0  0

 50  50  25  50  50 3200 米但し抗血清でNo．4， No．5は欠．抗原ではNo．4を欠く．

表4 Hobbsの各型菌の被吸収抗血清と各Hobbs株の関係

   （各抗血清をHobbsの6型菌で吸収した場合＊＊）

Hobbs

の潮型株

123567891011

抗

血

清 （吸収 血清）

・一6・ P2−613−616−617−618−61g−6「・・一6L11−6

1600†

 0  0  0  0  0

 0  0  0  0

 0

1600

 0  0  0  0  0  0  0  0

 0  0 800  0  0  0  0  0  0  0

0000000000 ⁰

 0  0  0  0

1600

 0  0  0  0

 0  0  0

 0  0  0 800  0  0  0

 0

 0  0  0  0  0  0 800  0  0

 0  0  0  0  0  0  0  0

1600

 0  0  0  0  0  0  0  0  0  0

3200 来…1型の原抗血清を6型の薗で吸雨後の抗血清を意味する．以下これに準ずる．

＊＊…9型で吸収した場合もこれと殆んど同じ成績を示した．

†…凝集価を示す．

価を示したにすぎなかった．

（4）分離A型菌の各菌株との関係

 我々が更に時；期を異にし入糞より分離した68株のう ち70。10分加熱分離の4株，90。10分加熱分離の1株，

100。60分加熱分離の4株を選んでそれぞれ前述の手技 により抗血清を作製し，これに対し各菌68株で交差凝 集反応を行なった．その結果，凝集価が認められたす べては表5に示す如くであって，自己の株とは1600〜

400の値を示すが，他の株との間には殆んど凝集反応 は認められないか或いは凝集することがあってもその

値は低かった．

 一方，この分離株の抗血清9種類に対するB。C．D 型菌との凝集反応を検討したが，いずれの間にも凝集

は認められなかった．

（5）B．C．D型抗血清に対するA型菌の関係  先ずPB6K， SR−12及びHobbsの各型との関係 を検討したが，いずれもB．C． D型抗血清との間には

凝集は認められなかった．

 次に入由来の分離菌115株でこの各型抗血清に対し 凝集反応を試みたが，凝集を認め得たのは11株であっ

た，

 しかし，青山らのC1． welchii食中毒例13）からの

分離菌20株のうち13株のS型株は1株だけを例外とし

すべてがD型血清に50の凝集価を示したのは通常見る

ことのできぬ現象であり興味深かった（但し他のR型

株7過すべては凝集しなかった）．

表5 分離株来相互凝集反応（凝集価を示したもののみを示す）

分離株

（記号）

㎜飛球㎜筋枷脇㎜畿撒罐儲

○ ○

○

71・117・・2171・3171・41g1・2巨6・・116・51・6・6116・7

800＊米

400  0  0  0

 0  0

50

 0  0        2

000000005

50

g00500500050000000000 噌1  8      

000000000000000000000

      4 0000050000000005000000

        爾b  爾b2    0000000000050000000

0

      8

0000000000000000000

      0      8

0000000000000000000

       0       8

＊…70。分10分分離株37株，90。10分分離株14株，100。60分分離株17株計68株

＊来…凝集価

考 察

 自然界の土壌14）或いは人糞エ5）から分離されるC1．

welchiiの殆んどはA型に属すると思われるが，我々 は入糞から分離した合計183株の菌について凝集反応 を試み，いずれも従来の記載通りstrain−specificity

を肯定する成績を得た．

 しかしながら最近Hobbsらは食中毒の際の起炎菌 としての耐熱性のA型菌について凝集反応によって Typingが可能であるとし12），またこれを支持する

ものとして沢山の食中毒に際し，Hobbsの血清型の

いずれかに属する菌型が報告されている16）17）18）19）20）21）

22）23）．

 一方，これに対しHa11ら24）はアメリカにおける C1． welchii食中毒の43％の株がHobbsの型血清に よって凝集するにすぎなかったと述べている．しかし これらの菌はHa11らも述べる如く耐熱性において Hobbsらの株とかなり異なるように思われる．三舟 25）は正常人の糞便を100。C10分加熱して得た471株の 内41株（8．7％）がHobbsの型血清に凝集したと報 告しているのに対し，飯田ら26）は正常人601名の糞便 を100。C60分加熱して得た147株のうち58株（39．4株）

がH：obbsの型血清に凝集すると述べた．赤真27）は ノーマルクローラーとしてのCL welchiiのうち極 めて一部のものだけがHobbsの型血清に凝集するこ とを示した．ノーマルフローラとしてのCl． welchii は殆んど耐熱性のない菌群であること28）を考え合わせ ると，耐熱性の菌特に食中毒の際に現われる群熱性菌 が抗的に共通因子を持つように思える．これは将来の

検討にゆだねたい．

 Cl． welchii菌のstrain−specificityを示す原因

の一つとして，培養条件があると思われる．Hobbs

らはその型抗血清は8型のうち3，4，5型を除いて

共通抗原が全くないと述べたのに対し，我々は各型間

にかなりの共通抗原を認め得たしまた，B． C． D型菌

とも低値ながらも共通抗原があることが判った．三舟

はHobbsの3型と4型，7型と9型の間にのみ共通

抗原があると述べていていくらかHobbsらの成績と

異なるにすぎないが，我々の成績はこの二者から大き

く異なっている．私はこの差が用いられた培養条件の

差によるものであると考え検討中であり（第2報での

べる），培養条件によって凝集価が著しく影響をうけ

ることについては三舟がすでに述べている．

結 論

 C1． welchii A型菌相互の凝集反応においては，殆 んどは株特異性が強く，これを血清学的に分類するこ

とは不可能であるという従来の事実を全く肯定する結 果を得た．他方Hobbsの耐熱性菌の各型相互の間及 びこ．れらの菌とB．C． D型菌相互の間には低値ながら 交差凝集反応が認められた．   ゴ

 （稿を終るに臨み，終始御懇篤なる御指導ならびに御校閲を賜 った恩師西田尚紀教授に深謝致します．またHobbs株の分与を

うけた北海道衛研の飯田広男博士に感謝致します）

文 献

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西田尚紀＝医学と生物学，68，93（1964）．

       Abstract       

  Almost all of 115 strains of Cloε 7ゴ4三物ωθ16雇ゴisolated from human feces

sa血戸1es exhibited strain−specific agglutinability whilst serotype strains established

by Hobbs et al（1953）displayed weak cross−agglutinatioロnot only with each other

of serotype strains but also with strains of different toxigenic types（B． C and D

types）of Cl． welchii．