低分子抗体の高密度配向固定化技術
の開発と免疫測定の高感度化
京都工芸繊維大学分子化学系
准教授 熊田 陽一
タンパク質を固定化した新しい材料設計
（インタラクティブバイオ界面）
材料基板 タンパク質（バイオ分子）生体分子の機能
• 反応を触媒する力
• 分子を認識する力
様々な材料
• 有機材料
• 無機材料
• 複合材料
新しいバイオ材料
• 医療材料
• 医療診断材料
• バイオ電池
• 抗菌材料
• 固定化触媒
• アフィニティ分離材
＋
エンジニアリングとしての課題 （製造コスト、安定性、パフォーマンス・・・）固定化
抗原抗体反応を利用した免疫診断（
ELISA）
リガンド(抗体) の固定化 ブロッキング 検体の結合 Washing Washing 酵素標識抗体 の結合 シグナルの検出 Washing Washing • 単位操作的特徴 固液間の吸脱着操作 物質移動律速 平衡・非平衡操作 • 試薬的特徴 抗体の特異性 抗体の親和定数(Ka) 抗体の速度定数(kon, koff) 抗体の固定化密度 抗体の安定性 抗体の生産コスト 固定化 PS plate従来技術とその問題点
免疫検査には、
抗体を固定化した担体
（プレートやラテックス粒子）が用いられているが、
・ 抗体の密度が低く、配向が不均一・不適当
・ 担体との接触によって活性が大きく低下する
・ 抗体の製造コストが極めて高い
等の問題があり、慢性的な感度不足と検査コストの
高騰を引き起こしている。
抗体固定化材料のパフォーマンス
密度
X
配向性
X親和性X
残存活性
生産コスト
パフォーマンス
=
• 特異性・親和性の高い抗体か？
• 高密度に固定化できるか？
• 安定に固定化できるか？
• 配向はどの程度均一か？
• 製造コストは安価か？
これらの因子をいかに厳密に
制御できるかが研究のカギ
これまで重要視されてきた因子
リガンド(抗体) の固定化 物理吸着 抗体固定化プレート （販売価格：5～10万円）材料親和性ペプチドを導入した
単鎖抗体を設計
抗原認識部位
診断に必要な部分
診断に不必要な部分
低分子化
一本鎖化
単鎖抗体 タグ付き単鎖抗体タグ導入
完全長抗体（従来の抗体）タグ付き単鎖抗体の高密度配向固定
残存活性 高 ○ 固定化密度 低 × 生産コスト 高 × 従来の抗体 残存活性 低 × 固定化密度 中 △ 生産コスト 低 ○ 単鎖抗体（タグなし） 変性 残存活性 高 ○ 固定化密度 高 ○ 生産コスト 低 ○ タグ付き単鎖抗体 ペプチドタグ プラスチック基板材料親和性ペプチドを利用したタンパク質の固定化
材料親和性ペプチド：
固相表面の構造を認識し高親和的に付着するペプチド
特徴：
• ペプチドの導入によってタンパク質を高密度に固定化できる。
• ペプチドの導入によってタンパク質の配向性を制御できる。
• ペプチドを介して固定化を行うことで高い生理活性を維持できる。
親和性ペプチド プラスチック基板 目的タンパク質PS-tag, PC-tag, PMMA-tag, SiN-tag
ペプチドタグ融合グルタチオン
S トランスフェラーゼ
GSTのアミノ酸配列
MSPILGYWKIK
GLVQPTRLLLEYLEEKYEEH
LYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD
VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEIS
MLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLS
KLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFML
YDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI
PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPP
KSDLIEGRG
IPG
NSS
PS-tag:
RIIIRRIRR
PC-tag:
NSNFFGLVDGLNFAVQYLGK
PMMA-tag:
DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK
SiN-tag:
GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIE
C-terminus N-terminus材料親和性ペプチド融合
GSTの調製
親和性ペプチドのDNA 親和性ペプチド融合 GST発現Vector 親和性ペプチドの 遺伝子 精製 GSTrap HP column Elution ： 20mM GSH 100mM Tris Vector構築 形質転換 本培養 37℃ 2×YT 培地 （抗生物質：Amp） pGEX-3X GSTのDNA IPTG 1mM 発現 30℃ 7h 2×YT 培地 （抗生物質：Amp） 親和性ペプチド融合GST-1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 0 250 500 750 1000 1250 1500 Incubation time, sec
∆ F req uency , H z wt-GST GST-PS19-6
PS-tag融合GSTの高密度配向固定
Quartz Crystal Microbalance (QCM)
PS-tagを導入することで迅速かつ高密度な固定化が可能。
タンパク質が付着すると振動数が減少する。
PC-tagおよびPMMA-tag融合GSTの高密度配向固定
-500 -400 -300 -200 -100 0 0 250 500 750 1000 1250 1500Incubation time, sec
∆ F req uency , H z wt-GST GST-PC-MLT8 GST-PC-OMP6 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0 0 250 500 750 1000 1250 1500
Incubation time, sec
∆ F req uency , H z wt-GST GST-PM-OMP25 PMMA-tag融合GST vs PMMA表面 PC-tag融合GST vs PC表面
Quartz Crystal Microbalance (QCM)
PC-tag、PMMA-tagを導入することで迅速かつ高密度な固定化が可能。
光源 分光器 光源 分光器 相互作用による 膜厚変化 センサーチップ 干渉 干渉 ボトム 波長(nm) 反射率 (% ) 膜厚変化により ボトムがシフト ⊿λ 波長(nm) 反射率 (% )
反射干渉分光（
RIfS）センサー
センサーチップボトム波長のシフト量を吸着量とみなす
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 100 200 300 400 500 600 波 長シ フ ト 量 （ n ｍ ） 時間 （秒） 試料注入 20倍以上高密度な固定化に成功
RIfSセンサチップ上へのGSTの選択的固定化
GST-SiN-tag (ELN-V821) wt-GST センサの大幅な高感度化に期待 本研究で開発されたSiN-tagはSiN基板に対して広い汎用性を有している。材料親和性ペプチドを導入した
単鎖抗体を設計
抗原認識部位
診断に必要な部分
診断に不必要な部分
低分子化
一本鎖化
単鎖抗体 タグ付き単鎖抗体タグ導入
完全長抗体（従来の抗体）マウス抗体 （150 kDa） 低分子化 ラクダ抗体 （75kDa） 低分子化 VHH (13kDa) ・世界最小 ・熱安定性大 Fab （50kDa） scFv （30 kDa） ・ 汎用性大 ・ 結合活性大
材料親和性ペプチドを導入した様々な低分子化抗体を調製可能
・ 発現が容易 ・ リフォールディングが簡便これまでに開発したタグ付き低分子抗体
抗体 由来 対象
Anti-RNase A scFv, Fab, VHH (3) マウス、ラクダ モデルタンパク質 Anti-CRP scFv, Fab (4) マウス 炎症マーカー
Anti-AAT scFv マウス 肝がんマーカー Anti-CEA scFv, Fab マウス 大腸がんマーカー Anti-CA19-9 scFv マウス 膵がんマーカー Anti-hIgG scFv マウス モデルタンパク質 Anti-hIgA scFv マウス 腎臓病マーカー Anti-TSH scFv, Fab マウス バセドウ病マーカー Anti-TF scFv, Fab (2) マウス 様々なガンのマーカー Anti-AFP scFv, Fab (2) マウス 肝がんマーカー
Anti-NP sｃFv, Fab マウス インフルエンザマーカー Anti-hCG VHH リャマ 妊娠検査マーカー Anti-Lysozyme VHH (2) ラクダ モデルタンパク質 Anti-Ovalubmin VHH (2) ラクダ モデルタンパク質 Anti-α-amylase VHH (2) ラクダ モデルタンパク質
タグ付き低分子抗体の広い汎用性を検証中、今後も検査項目を追加していく予定
200k 116k 66k 45k 31k 21k 14k 培養上清 精製後scFv MW SDS-PAGEの結果 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 20 40 60 80 100 120 DO 値 (-) gl uc os e( g) Ye as t e xt rac t( g) 培養時間(H)
glucose Yeast extract 溶存酸素濃度(DO値)
低分子抗体の生産濃度 VHH：1g～10g/L
scFv: 1g～4g/L
PS-tag融合単鎖抗体を用いる
低コストかつ高感度
な医療診断
（
CEA (大腸がんマーカー)の検出）
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 20 40 60 80 100 A bs o rb ance at 450 ( ref . 650 nm ), -CEA concentration, ng/ml scFv-PS / phi-PS plate Whole Ab/MaxisorpscFv-PSをリガンドに用いることで
10倍
の高感度化に成功！
サンドイッチ
ELISAによるCRPの検出
(3種類のPS-tag融合scFvの感度比較)
0.0 1.0 2.0 3.0 1 10 100 1000 CRP concentration (ng/ml) A bs o rb ance a t 405 nm ,-● scFv
●
scFv-
PS
●
scFv-
PSII
●
scFv-
(PS)
＊ Whole Ab
PS-tag融合scFvを用いることで高感度な抗原検出が可能PS-tag融合単鎖抗体を用いる
低コストかつ高感度
な医療診断
（
TSH (甲状腺刺激ホルモン)の検出）
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0.01 0.1 1 10 100 1000 A b so rb a n c e a t 4 50 n m (r ef. 6 50 n m), -TSH concentration, ng/ml scFv-PS (840) Whole Ab (840)scFv-PS (phi-PS plate), whole Ab (Maxisorp)
scFv-PM固定化PMMA plateによる抗原検出
0.0 1.0 2.0 3.0 0.01 0.1 1 10 100 1000 AB S a t 450 n m ( Re f. 650n m) , -biotin-RNase, ng/ml scFv-D15 scFv-PM 特注PMMA製プレート PMMA-tagの導入によって単鎖抗体をPMMAプレート上に高密度・高活性に固定化できた。 （タグなし）0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.1 1 10 100 A bs or banc e, - biotin-RNase (ng/ml) Fab H-PM-His Fab L-PM-His Fab-PM-His (H+L) scFv-PM-His
Fab H-PM-HisおよびFab L-PM-Hisを単独で固定化した場合には抗原検出はできず、 Fab-PM-His (H+L)ならびにscFv-PM-Hisを固定化した際に高いシグナルが得られた。 Anti-RNase Fab-PM-His (H+L)は「PMMAプレートへの付着力」と「抗原に対する結合 活性」の両方を保持している。
Anti-RNase
Fab
-
PM
-His（H+L）固定化PMMA plateの評価
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0.01 0.1 1 10 100 1000 Ab so rb an ce a t 450 - 650 n m , -biotin-hCG concn, ng/ml VHH (45ug/ml) VHH-PMMA-tag (45 ug/ml) PMMA-tagの導入によってラクダ抗体（VHH）をPMMA基板表面に高密度か つ高活性に固定化可能であり、高感度に抗原検出可能である。
ラクダ由来
VHH固定化PMMAプレートによるヒトhCGの検出
特注PMMA製プレート材料親和性ペプチドのまとめ
PS-tag
PMMA-tag PC-tag SiN-tag
認識可能な表面 phi-PS(＋Tween20) その他PMMA PC SiN タグ付きGST ○ ○ ○ ○ タグ付きscFv ○ ○ N.D. ○ タグ付きFab ○ ○ N.D. N.D. （検討予定） タグ付きVHH ○ ○ N.D. N.D. （検討予定） 固相Refolding ○ N.D. （検討予定） N.D. N.D. 液相Refolding ○ （+ polyD-tag） ○ N.D. ○ （+ polyD-tag）
新技術の特徴・従来技術との比較
• 材料親和性ペプチドを融合した低分子抗体に
よって免疫診断の高感度化が可能。
• 従来はポリスチレンのみの使用に限られてい
たが、材料親和性ペプチドの種類を変えること
で様々な表面に抗体を固定化可能となった。
• 本技術の適用により、
10倍以上の高感度検出
ならびに、抗体の製造コストを従来の
1/10以下
に削減できる。
実用化に向けた課題
• 現在、当研究室が保有している１５種類の
低分子抗体について本技術の有用性を実
証している。一方で、本技術を臨床検査に
利用するためには、実用化に見合った優
良な低分子抗体を新たに取得する必要が
ある。
• 長期間の保存安定性について、今後評
価・検討していく必要がある。
各種リアルタイムバイオセンサへの応用
センサー基板 低分子抗体 の配向固定 コーティング 厚み：20 ~ 50nm 抗原の検出 シグナルセンサー上に固定化したscFvに抗原が結合するとリアルタイム
にシグナルが検出される。
表面プラズモン共鳴
(SPR)センサーへの応用
Biacore X-100SPRセンサーの原理
センサーチップ(Au薄膜)lazer
Prism
Gold
phi-PS film
高感度
SPFSセンサの開発
SPR-SPFS複合機による超高感度バイオセンサの開発
SPFSセンサを用いる超高感度医療診断
1 10 100 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 0 10 20 30 40 50 60 100 200 300 400 Antibody conc. (µg/mL) A d s or be d an ti b od ies ( ng /c m 2 ) CRP conc. (pM) F lu o res c e nc e i nt ens it y scFv whole antibody scFv whole antibody (a) (b) 1 10 100 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 0 10 20 30 40 50 60 100 200 300 400 Antibody conc. (µg/mL) A d s or be d an ti b od ies ( ng /c m 2 ) CRP conc. (pM) F lu o res c e nc e i nt ens it y scFv whole antibody scFv whole antibody 1 10 100 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 0 10 20 30 40 50 60 100 200 300 400 Antibody conc. (µg/mL) A d s or be d an ti b od ies ( ng /c m 2 ) CRP conc. (pM) F lu o res c e nc e i nt ens it y scFv whole antibody scFv whole antibody (a) (b)抗体の固定化密度
SPFSセンサの感度
リアルタイムバイオセンサ上へのscFvの固定化
Quartz Crystal Microbalance (QCM)
Gold
phi-PS film
scFv固定化QCMセンサによる抗原検出
-400 -300 -200 -100 0 0 2 4 6 8 10 Incubation time (min)∆ F (Hz) 10 µg/ml BSA 0.1 µg/ml Antigen 1 µg/ml Antigen 10 µg/ml Antigen
検出時間
3分において0.1 – 10 µg/mlの抗原溶液の検出が可能であった。
RIfSセンサーの原理
研 究 の 背 景
RIfSセンサー開発機 (wacaris) センサ基板表面 SiN Si反射干渉分光（
RIfS）センサ
センサチップの材料は窒化ケイ素（SiN） anti-RNase scFv-SiN-D15 vs RNase RNase antigen anti-RNase scFv-SiN-D15 anti-RNase scFv-D15 RNase antigen SiN-tag融合scFvの方が10倍程 度高感度な検出が可能であった。 SiN-tag融合scFvのSiN基板上への固定化とRIfSセンサによる抗原検出 anti-RNase scFv-D15 vs RNase
