博 士 （ 理 学 ） 北 郷 悠 学 位 論 文 題 名
Structural Biology of Cellulosome Components （ セル ロ ソー ム構 成 要素 の構 造 生物 学的 研 究）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
セル ロー ス は植 物の 細胞 壁の 主要 成分 とし て地 球上 に最 も豊富 に存在するバイオ マス の1っ であ る． セル ロー ス分 解酵 素であるセルラーゼを産生でき る一部の微生物に 限っ て， セル ロースを炭素栄養源として利用することができる，その 中でも，結晶性セ ルロ ース を分 解できるほど高効率のセルラーゼ分解能を持つ，巨大な タンパク質複合体 セル ロソ ーム を産生する微生物が知られている．セルロソームは，複 数の活性タンパク 質と1っの 足場 タン パク 質が 会合 した ，非常に特徴的な構造をとって いる．活性タンパ ク質 は， さま ざまなセルラーゼと糖質結合タンパク質からなる．対照 的に足場タンパク 質は ，ま った く酵素活性を持たず，複数の活性タンパク質とタンパク 質―タンパク質相 互作 用に よっ て会合し，擬似の枝分かれ構造を構成する役割を果たし ている，セルロソ ーム 全体 とし ては，多数の活性モジュールが柔軟性のある部位でっな がれたマルチドメ イン 様の 構造 をとっており，含まれるセルラーゼの多様性と，この独 特の柔軟性を持つ た構 造が ，セ ルロソームの極めて高いセルロース分解活性に寄与して いる．一方で，セ ルラ ーゼ 活性 や糖質結合活性，そしてセルロソームの高次構造を支え るタンパク質一タ ンパ ク質 相互 作用部分といった原子レベルの詳細な機構については， 未解明な部分が多 い， 本研 究は ，X線 結晶 構造 解析 によ ってセルロソームの詳細な構造 を明らかにし，そ こか らセ ルロ ソームの高効率セルラーゼ活性や，独特の高次構造の詳 細を解き明かして いく目的で行っている．
本研 究は ， 三重 大学 大学 院資 源循 環学 科と 共同 研究 を行 ってお り，代表的なセル ラーゼ分解性嫌気性菌であるCtostridium thermocellum及びClostridium josui由来セルロ ソ ー ム の 構 成 タ ン パ ク 質 に つ い て ，X線 結 晶 構 造 解 析 に 取 り 組 ん で い る ． 特 にc． thermocellumセルロソームの活性タンパク質CelJ中の活性モジュールCe144Aについて，
X線結 晶構 造解 析に 成功 した ． CelJは2つ の 活性 モジ ュー ルと2っの 糖質結合モジュー ル で 構 成さ れる マル チド メイ ン酵 素で あり ，そ の 活性 モジ ュー ルの1っ であ るCe144A は ． 糖 加水 分解 酵素 ファ ミリ ー44 (GH44)に 分類 され るセ ルラ ーゼ であ る．Ce144Aは p‑i，4．エンドグルカナーゼ活性の ほかにキシラナーゼ活性，リケナーゼ活性，キシログ −1514一
ル カ ナ ー ゼ 活 性 が 確 認 さ れ て お り ，基 質 特 異 性に 幅 が ある こ と が知 ら れ てい た ． 野 生 型Ce144Aは ， 亜鉛 の 異常 散乱を用 いた2波長異 常散乱法 によっ て位相決 定さ れ ，0.96Aの高 分 解 能で 構 造 が決 定 さ れ た．Ce144AはTIMバ レルに 似たTIM‑likeバ レ ル とp‐ サンドイッチドメインから構成され，カルシウムイオンが結合した小さなドメイ ンが付属していた．全体構造は，p゛サンドイッチ部も含めて糖加水分解酵素GH5，30，39， 51に それぞれ 属する 酵素と類 似して おり，こ の立体 構造類似 性から，2つの活性残基が 推定された，これらの糖加水分解酵素で，基質特異性はそれぞれに異なっており，GH30， 39，51の 酵 素が ェ キ ソグ ル カ ナーゼ 活性であ るのに 対し，GH5とCe144Aが 属するGH44 は エンドグ ルカナ ーゼ活性 を示す ．次に，既に活性が確認されていたセロオリゴ糖を結 晶 に導入し ，反応 後産物が タンパ ク質に結合した状態の複合体構造を得ることに成功し た ， こ の構 造 で は， 導 入 した6糖もし くは5糖の非還 元側4糖が反 応後産 物として 電子 密 度中で明 確に観 察され， 詳細な 基質の認識環境が明らかとなった．構造類似性から推 定 された2つの 活性残基 は，基質 の切断 端の上下 に位置 しており，加水分解反応を行う た めに適当 な位置 を占めて いた． そこで， この2つの残 基にそれぞれグルタミンへの変 異 をかけた 変具体 を作製し(E186Q，E359Q)，基質として活性が確認されているカルボキ シ メチルセ ルロー スに対す る活性 測定を行った結果，野生型と比較して明らかな失活が 確 認された ．この 実験結果 とGH5，30，39，51との立体構造類似性とを合わせて，この2 つ のグ ルタミン 酸が活 性残基で あると 同定した ，この2っの 変異体の うち，E186Qと基 質 との複合 体の結 晶構造も 決定し ，活性部位より還元末端側の基質認識機構も明らかと な った．糖 加水分 解酵素に は，保 持型と反 転型の2っの 反応メカニズムが存在すること が 知ら れている が，以 前にGH44に 属する酵 素につい て，反 転型であ るとい う実験結 果 が 報 告 が され て い る． こ のGH44に属 す る 酵 素とCe144Aは60％ 近い ， 高 い1次 配 列相 同 性がある にも関 わらず， 本研究 の立体構造から得られた情報は，保持型の加水分解を 行 う こ とを 強 く 示唆 し て いた ．そ こで， プロトンNMRに よって反 応産物 の立体異 性体 の 経時 的変化を 測定し ，Ce144Aでは 保持型の 加水分 解が行わ れている という 直接的な 情 報を 得ること ができ た．Ce144Aの 特徴とも 言える ，幅のあ る基質特 異性は ，基質が 結 合する分 子表面 の溝に空 間的な 余裕があること，及び基質との数箇所の水素結合によ っ て説明す ること ができた ．特に 分子表面に，基質が結合する溝から分岐するような大 き な溝 は，Ce144Aの キシログ ルカナ ーゼ活性 を説明 するのに 適当であ り，キ シログル カナーゼ活性の詳細な解析が進行中である．
学 位 論 文 審 査の 要 旨 主査 教授 田中 勲 副査 教授 佐々木直樹
副査 教授 渡邉信久（名古屋大学）
副査 准教授 姚 閔
学位論文題名
Structural Biology of Cellulosome Components （セルロソーム構成要素の構造生物学的研究）
セルロースは植物の細胞壁の主要成分として地球上に最も豊富に存在するバイ オマスの1っである．セルロース分解酵素であるセルラーゼを産生できる一部の微 生物に限って，セルロースを炭素栄養源として利用することができる．その中でも，
結晶性セルロースを分解できるほど高効率のセルラーゼ分解能を持つ，巨大なタン パク質複合体セルロソームを産生する微生物が知られている．セルロソームは，複 数の活性タンパク質と1っの足場タンパク質が会合した，非常に特徴的な構造をと っている．活性タンパク質は，さまざまなセルラーゼと糖質結合タンパク質からな る．対照的に足場タンパク質は，まったく酵素活性を持たず，複数の活性タンパク 質とタンパク質―タンパク質相互作用によって会合し，擬似の枝分かれ構造を構成 する役割を果たしている．セルロソーム全体としては，多数の活性モジュールが柔 軟性のある部位でっながれたマルチドメイン様の構造をとっており，含まれるセル ラーゼの多様性と，この独特の柔軟性を持った構造が，セルロソームの極めて高い セルロース分解活性に寄与している．一方で，セルラーゼ活性や糖質結合活性，そ してセルロソームの高次構造を支えるタンパク質―タンパク質相互作用部分とぃ っ た 原 子 レ ベ ル の 詳 細 な 機 構 に つ い て は ， 未 解 明 な 部 分 が 多 い ． 本研究では，代表的なセルラーゼ分解性嫌気性菌であるCloslr idium thermocellum セル ロソ ーム の活 性タンパク質CelJ中の活性モジュールCe144AについてX線結晶 構造解析を行い，セルロソームの高効率セルラーゼ活性や，独特の高次構造の詳細 を調べた．CelJは2っの活性モジュールと2っの糖質結合モジュールで構成される マル チド メイ ン酵 素であり，その活性モジュールの1っであるCe144Aは，糖加水 分解酵素ファミリー44 (GH44)に分類されるセルラーゼである．Ce144Aはp‑i，4― エンドグルカナーゼ活性のほかにキシラナーゼ活性，リケナーゼ活性，キシログル カナ ーゼ 活性 が確 認さ れて おり ，基質 特異 性に 幅があることが知られていた，
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野 生型Ce144Aは， 亜鉛の異 常散乱を用 いた2波長 異常散乱法によって位相決定 さ れ，0.96Aの高分解能で構造が決定された．Ce144AはTIMバレルに似たTJM―like バレルとp―サンドイッチドメインから構成され，カルシウムイオンが結合した小さ なドメインが付属していた．全体構造は，p‐サンドイッチ部も含めて糖加水分解酵 素GH5，30，39，51にそれぞれ属する酵素と類似しており，この立体構造類似性から，
2っの活性残基が推定された．これらの糖加水分解酵素で，基質特異性はそれぞれ に異なっており，GH30，39，51の酵素がエキソグルカナーゼ活性であるのに対し，
GH5とCe144Aが 属 するGH44は エ ンド グル カナーゼ 活性を示 す．次に ，既に活 性 が確認されていたセロオリゴ糖を結晶に導入し，反応後産物がタンパク質に結合し た 状態の複合体構造を得ることに成功した．この構造では，導入した6糖もしくは 5糖 の非還元 側4糖が反 応後産物として電子密度中で明確に観察され，詳細な基質 の 認識環境が明らかとなった．構造類似性から推定された2っの活性残基は，基質 の切断端の上下に位置しており，加水分解反応を行うために適当な位置を占めてい た ．そこで，この2っの残基にそれぞれグルタミンヘの変異をかけた変異体を作製 し(E186Q，E359Q)，基質として活性が確認されているカルボキシメチルセルロース に対する活性測定を行った結果，野生型と比較して明らかな失活が確認された．こ の実験結果とGH5，30，39，51との立体構造類似性とを合わせて，この2っのグルタ ミ ン酸が活 性残基で あると同定した．この2っの変異体のうち，E186Qと基質との 複合体の結晶構造も決定し，活性部位より還元末端側の基質認識機構も明らかとな っ た．糖加水分解酵素には，保持型と反転型の2っの反応メカニズムが存在するこ と が知られ ているが ，以前にGH44に属する酵素について，反転型であるという実 験 結 果 が報告がさ れている ．このGH44に 属する酵 素とCe144Aは60%近 い，高い1 次配列相同性があるにも関わらず，本研究の立体構造から得られた情報は，保持型 の 加水分解 を行うこ とを強く示 唆してい た．そこ で，プロトンNMRによって反応 産 物の立体 異性体の 経時的変化を測定し，過去の報告を覆してCe144Aでは保持型 の加水分解が行われているという直接的な情報を得ることができた． Ce144Aの特徴 とも言える，幅のある基質特異性は，基質が結合する分子表面の溝に空間的な余裕 があること，及び基質との数箇所の水素結合によって説明することができた．特に 基質結合部位以外に分子表面に存在する大きなクレフト構造から，Ce144Aのキシロ グ ルカナー ゼ活性は 側鎖の位置に制限されずに主鎖部分を切断できることを示唆 している．
本学位論文は，エンドグルカナーゼCe144Aについて構造決定を行い，さらに基質との 複合体結晶構造解析により，活性機構と独特の基質認識機構を研究したものである．本 研究が生物科学に及ばす貢献には多大なものがあり，よって審査員一同は申請者が博士
（理学）の学位を得る十分の資格があるものと認めた，
