リンゴを利用した発酵酵素シロップによるがん細胞増殖抑制，抗酸化，α-グルコシダーゼ阻害作用に関する研究

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65Functional Food Research Vol.16 2020. リンゴを利用した発酵酵素シロップによるがん細胞増殖抑制，抗酸化，α-グルコシダーゼ阻害作用に関する研究 Cancer cell growth inhibitory, anti-oxidant, and α-glucosidase inhibitory effects of enzyme syrup obtained from apple fermentation. 中谷美咲，関洋子 * Misaki Nakatani, Hiroko Seki. Fukagawa Fukagawa. 野菜や果物は長時間の保存が難しく，一般的には野菜はピクルスや漬物，果物はジャムに加工して保存されてきた．しかし，加工の際の酸処理や加熱によって，野菜・果物に含まれる酵素を不活性化してしまう，加熱により総ビタミン C 量が低下するという問題があった．そこで最近では果物や野菜を生のまま砂糖漬けにして発酵させることで，有用な物質の破損なしに加工・保存する方法がある．果物や野菜を砂糖漬けにすることで，数日で野菜や果物から出てきた水分で砂糖が溶け，シロップ漬けの状態となる．このシロップは酵素シロップと呼ばれ，発酵による有用成分の増加および機能性の向上，がん細胞増殖抑制作用が期待できる．そこで，本研究ではりんごを利用した酵素シロップに着目し，発酵によるがん細胞増殖抑制作用，抗酸化作用，α-グルコシダーゼ阻害作用を調査した．また，発酵に関与している微生物の同定を行った．りんごは青森県の早生ふじりんごを用い，16 分割にした後，1.1 倍の砂糖と共にガラスの容器で 2 週間室温に保存し，発酵 7 日目と 14 日目のシロップを用いてマウス白血病細胞株 P388 の細胞増殖への影響，抗酸化活性，α-グルコシダーゼ阻害活性を測定した．がん細胞増殖抑制作用を評価するため，細胞数を調整したマウス白血病細胞株 P388 に発酵 7 日目と 14 日目の酵素シロップまたは滅菌水を添加し，37°C で 7 日間 5.0％ CO2 環境で培養し，p388 の細胞数を比較した．酵素シロップの抗酸化作用は DPPH ラジカル消去活性を，α-グルコシダーゼ阻害作用はα-グルコシターゼ阻害活性を測定した．発酵に関与している微生物を同定するため，酵素シロップを適宜希釈し標準寒天培地に塗抹し，35℃で 2 日間培養した．2 日後，出現したコロニーの微生物同定を行った．その結果，がん細胞増殖抑制作用の評価では，発酵 7 日目および 14 日目の酵素シロップで p388 細胞の増殖抑制効果が確認された．抗酸化作用の評価では，酵素シロップの抗酸化活性と比較してリンゴ自体の抗酸化活性で高い値が確認された．α-グルコシダーゼ阻害作用の評価では，発酵 7 日目および 14 日目の酵素シロップで高いα-グルコシダーゼ阻害活性が確認された．また，発酵に関与した微生物を同定した結果，相同値 97％で Metschnikowia pulcherrima であった．以上のことからリンゴを利用した酵素シロップはがん細胞増殖抑制作用，α-グルコシダーゼ阻害作用が確認され，発酵に関与している微生物は Metschnikowia pulcherrima であることがわかった．. Functional Food Research 16：65︲74，2020. keywords りんご，発酵，がん細胞増殖抑制，α-グルコシダーゼ阻害. 要旨. 受付日 2020 年 4 月 9 日受理日 2020 年 5 月 28 日原著玉川大学農学部生命化学科 Department of Life Science, Faculty of Agriculture, Tamagawa University 〒 194-8610 東京都町田市玉川学園 6-1-1 ＊ [email protected]. 66. はじめに. 野菜や果物は劣化が早く，比較的長時間の保存が難しいため，一般的には野菜はピクルス（酢漬け）や漬物（塩漬け），果物はジャムに加工して保存されてきた．野菜の品質低下は，微生物の繁殖による汚染と腐敗であり 1），これらの保存法は微生物の増殖を抑え，野菜や果物の品質の低下を抑える効果がある 2）．ピクルスは pH を下げることで細菌の増殖を抑えることができ 2），酢に漬ける前に茹でる場合は，加熱により微生物を減らすことができる．漬物は塩分濃度を上げることで，タンパク質や澱粉の分解に関する酵素活性を下げたり 3），微生物の繁殖を抑えたりできる 3）．ジャムは糖度を上げることで水分活性を下げ，微生物の繁殖を抑えられる 4）．これらの加工によって野菜や果物を長期間保存することが可能となったが，一般的に低い pH や高い塩濃度，加熱によって野菜や果物に含まれる有用な酵素を不活性化してしまう 5），加熱により総ビタミン C 量が低下する 6），などといった問題があった．そこで最近では果物や野菜を生のまま砂糖漬けにして，発酵させることで，加熱や酸による有用な物質の破損なしに保存する方法がある．これは酵素シロップと呼ばれており，作り方は，洗って適度な大きさに切った野菜や果物とそれに対して 1.1 倍の量の砂糖を滅菌したビンに詰めて数日から数週間保存する 7）．すると，浸透圧により野菜や果物から水分が出てきてシロップ漬けの状態になり，野菜や果物に含まれる常在菌によって発酵が進む 8）．果物はシロップ漬けとして食べられ，シロップは果物の甘さやフレーバー，有効成分が溶け出しており，水や炭酸水などで割って飲むことができる．. 常在菌による野菜や果物の発酵については，リンゴ，ナシ，ニンジンを含む飲料を発酵させることでグルコースやフルクトースが増加し，抗酸化作用の増加が報告されている 9）．また，常在菌により発酵したタマネギで強力な抗がん作用や抗菌作用も報告されており 10），常在菌がマウス結腸腫瘍形成を抑えるとも報告されていることから 11），野菜や果物の発酵により甘みが増し，健康に対する有効成分の増加および機能性の向上，抗がん，抗菌作用が期待できる．. 一方，リンゴは中央アジアを原産地とするバラ科リンゴ属の落葉果樹で，世界各地で広く栽培されており，古くから食物として摂取されている 12）．現在も生産量は増加し，一般的に生食では皮を剥いて食べることが多く，加工品ではジュース，焼きりんご，ジャ. ム，果実酒などがあり，一年中口にすることができる私たちに身近な果物である 12）．西洋のことわざに. 「An apple a day keeps the doctor」とあるようにリンゴを摂取することは健康に寄与することは広く知られているように，リンゴ果肉にはビタミンやペクチンなどの食物繊維やカリウムなどが豊富に含有されている 13）．また，リンゴのポリフェノール摂取はがんへの予防効果が高いとされ，他にも抗がん作用，メラニン生成抑制作用，抗酸化作用，血圧上昇抑制，脂質代謝制御機能，アレルギー発症抑制，血中コレステロール低下など多くの機能が期待される 13）．また，リンゴ果肉の発酵により，ポリフェノールが増加することで，抗酸化作用の向上が報告されている 14）．このことから，リンゴを利用した酵素シロップは様々な機能性の向上が期待できる．リンゴは果肉だけでなく皮や芯の部分にも多くの機能性成分を含んでおり，リンゴの皮や種にポリフェノールが果肉部より多く含まれていることが報告されている 13）．このことから，現在リンゴ果汁の生産の際に排出される残渣は機能性食品素材として注目されている 15）．実際，青森県ではリンゴの搾汁残渣が年間を通じて 15,000 t 以上産出されており 15），今後残渣をうまく利用してくことで，廃棄物量の削減につながる．さらに近年では食生活の質的な向上に伴い，不必要な加熱を避けたり，できるだけ化学的に合成された保存料を使わなかったりするなど，素材の特徴を生かした食品が好まれており，この傾向に酵素シロップは適している 16）．. そこで，本研究では廃棄される皮および芯を含んだりんご全体を利用した酵素シロップに着目し，発酵によるがん細胞増殖抑制作用，抗酸化作用，α-グルコシダーゼ阻害作用を調査した．まず，がん細胞増殖抑制作用についてはマウス白血病細胞 p388 の増殖に対する影響を，α-グルコシダーゼ阻害作用については α-グルコシダーゼ阻害活性，抗酸化作用については DPPH ラジカル消去活性を調査した．さらに，酵素シロップの発酵メカニズムについて，酵素シロップ作成過程における pH 変化の調査および酵素シロップを標準寒天培地と BCP 加プレート培地で培養した際に出現したコロニーの微生物同定を行い，本研究の酵素シロップ作成に大きく寄与している微生物種を特定した．. 67Functional Food Research Vol.16 2020. Ⅰ．試料と方法. 1 試料. リンゴ（青森県産早生ふじりんご）はスーパーで購入した．. 試薬. ERDF 培地は極東製薬工業株式会社製の「極東 E-RDF 培地」および炭酸水素ナトリウムをそれぞれ超純水で終濃度 1.8％および 0.10％になるように調製し，メンブランフィルター（0.22 µm）でろ過滅菌を行った．. マルトース溶液は富士フイルム和光純薬株式会社の D（+）マルトース一水和物を超純水で終濃度 5.0％になるように調製した．. α-グルコシダーゼは天野エンザイム株式会社製の「α-グルコシダーゼ「アマノ」SD」を 0.1 M KH2PO4/NaOH 緩衝液（pH 7.0）で終濃度 1.0％になるように調製した．. 炭酸ナトリウムは和光純薬製の炭酸ナトリウムを超純水に終濃度 0.2 M になるように調製した．. DPPH 溶液は東京化成株式会社製の「1,1-Diphe- nyl-2-picrylhydrazyl Free Radical」を 50 ％エタノールで終濃度 80 mg/L になるように調製した．. 標準寒天培地は栄研化学株式会社製の「パールコア標準寒天培地」を超純水で 2.4％になるように調製し，オートクレーブで滅菌後，滅菌プレートに分注した．. BCP 加プレート培地は日水製薬株式会社製の「BCP 加プレートカウントアガール」を超純水で 2.5％になるように調製し，オートクレーブ滅菌後，滅菌プレートに分注した．. 酵素シロップの作成. 酵素シロップは，水道水約 1 L に重曹を小さじ約 1 杯溶かした重曹水にリンゴを 1 分浸し，残留農薬を除去した．水分をふき取り後，16 等分に切断したリンゴと 1.1 倍の上白糖を滅菌した瓶に砂糖，リンゴ，砂糖の順になるように詰め，蓋を完全に閉めずに日が当たらない常温に置いた．2 週間毎日 1 回かき混ぜ，酵素シロップを作成した．砂糖が完全に溶けきり，シロップとなるまでに 3 〜 5 日を要するため，本研究では酵素シロップ作成時から 7 日目と 14 日目のシロップを評価した．なお，マウス白血病細胞 p388 細胞への影響を調査する際は，これを 0.22 µm フィル. ターでフィルター滅菌したものを用いた．. 2 方法. がん細胞増殖抑制作用の評価. がん細胞増殖抑制作用は前培養したマウス白血病細胞 p388 を遠心分離し（3500 rpm, 6 min, 25℃）， ERDF 培地を 4 mL，ウシ胎児血清 FBS（Fetal bovine serum）（biosera 社製）を 1 mL で再懸濁させた後，10 cm シャーレに細胞数を 5 × 10⁴ cell/mL になるように調整した．フィルター滅菌した酵素シロップまたは滅菌水を 0.5 mL 添加し，37℃，5.0％ CO2，湿度 90％以上の条件の下 2 〜 7 日間インキュベートした．各培養日数において，培養液 10 µL 中の細胞数を細胞計算盤（C-Chip）を用いて測定した．. α-グルコシダーゼ阻害作用の評価. α-グルコシダーゼ阻害活性の測定は太田ら（2011） 17），鈴木ら（1981）18），馬場（2009）19）を参考に行った．. 酵素反応させる試験区分 A と，酵素反応させない試験区分 B の 2 種類を作成した．A と B の試験管に基質である 5.0％マルトース 0.05 mL，酵素シロップを 0.025 mL 加え，α-グルコシダーゼの至適温度である 60℃で 5 分間保温した．保温後，試験区分 A には，酵素である 1.0％のα-グルコシターゼ 0.025 mL 加え，60℃で 20 分間保温し，酵素反応させた．反応後，0.2 M 炭酸ナトリウム 0.4 mL 加え，反応を停止させた．試験区分は 0.2 M 炭酸ナトリウム 0.4 mL 加えてから 1.0％のα-グルコシターゼ 0.025 mL を添加し，60℃で 20 分間保温した．A, B それぞれ 0.01 mL を別の試験管にとり，それぞれの試験管にグルコース CⅡ・テストワコー（和光純薬製）の発色液 3 mL を加え 20 分間室温に放置した後，プレートリーダー（Bio-Rad 社製）で吸光度を測定した. （505 nm）．また，ブランクとして，試験材料の代わりに同量の脱イオン水を加えたものを A，B の試験区においてそれぞれ用意した．そのうち，酵素反応ありの試験管を試験区分 C，酵素反応なしの試験管を試験区分 D とした．. α-グルコシターゼ阻害活性は以下に示す式に吸光値を代入して計算した．. α-グルコシターゼ阻害活性（％）＝ 100-（A-B）/ （C-D）× 100. 68. 抗酸化作用の評価. 80 mg/L の DPPH 溶液 3.6 mL にフィルター滅菌した酵素シロップ 0.4 mL 加えて撹拌し，30 分室温に放置した後，プレートリーダー（Bio-Rad 社製）で吸光度を測定した（540 nm）（B）．また，コントロールとして試料溶液の代わりに蒸留水を加えたもの（C）およびブランクとして DPPH の代わりにエタノールを加えたもの（A）について，それぞれの 30 分後の吸光度を測定した．. DPPH ラジカル消去能は以下に示す式に吸光値を代入して計算した 20）．. DPPH ラジカル消去能（%）＝ C-（B-A）/C×100 A：ブランクの吸光度 B：酵素シロップの吸光度 C：コントロールの吸光度. 発酵に関与している微生物種の同定. 発酵過程における pH 変化を調査するために，リンゴはおろし器で擦りおろした液を，酵素シロップは発酵 7 日目と 14 日目の原液をそれぞれ pH メーター. （株式会社堀場製作所社製）で測定した．発酵過程における微生物数の変化を調査するために，酵素シロップおよびシロップ漬けのリンゴ 2.5 g に 0.9％滅菌食塩水を添加し，25 mL に定容した．これらを適宜希釈し，それぞれ標準寒天培地と BCP 加プレート寒天培地に 100 µL ずつ塗抹し，標準寒天培地は 35℃で 48 時間，BCP 加プレート寒天培地は 50℃で 72 時間培養した．. 標準寒天培地で出現した菌の同定は株式会社ファスマックに依頼した．真菌については，GenCheck DNA Extraction Reagent を用いて抽出した DNA と LSU-F プライマー：GACCGATAGCGAACAAGTA および LSU-R プライマー：TTGGTCCGTGTTTCAA- GA を用いて 28S rDNA 遺伝子の一部（D2 領域）を PCR により増幅し，その塩基配列に基づいて同定した．当該遺伝子の PCR による増幅は，95℃，10 分の前処理の後，95 ℃，30 秒，50 ℃ 30 秒，72 ℃， 1 分のサイクルを 38 回繰り返し，最後に 72℃，7 分保持することで行った．上記 PCR 産物に対して，LSU-F および LSU-R primer を用いて Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer でシークエンス解析を行い，得られた配列を Applied Biosystems 社の「MicroSeq ID システムデータベース」で解析し，一致率の最も高い菌種を同定菌種とした．. 統計分析. データはフィッシャーの 3 原則に基づき一元配置の分散分析によって，平均値の差は t 検定で評価し，すべて有意水準 5％とした．. Ⅱ．結果. 1 がん細胞増殖抑制作用の評価. 図 1に発酵 7 日目の酵素シロップを添加したものと滅菌水を添加したものの p388 細胞の経時変化を示す．3.3 cell/mL（×10⁴）の p388 細胞に 7 日目の酵素シロップと滅菌水を添加したところ，滅菌水添加では 278 cell/mL（×10⁴）まで増加し（p ＜ 0.05），酵素シロップ添加では，0 cell/mL（×10⁴）から 3.9 cell/mL（×10⁴）の間で増減がみられた（p ＜ 0.05）．培養 2 日目での滅菌水添加は 23 cell/mL（×10⁴）でシロップ添加は 1.4 cell/mL（×10⁴）であり有意な差がみられた（p ＜ 0.05）．培養 5 日目での滅菌水添加では 18 cell/mL（×10⁴）でシロップ添加は 2.0 cell/mL（×10⁴）であり有意な差がみられた（p ＜ 0.05）．培養 7 日目での滅菌水添加は 278 cell/mL でシロップ添加は 0 cell/mL（×10⁴）であり有意な差がみられた（p ＜ 0.05）．図 2に発酵日数 14 日目の酵素シロップを添加したものと滅菌水を添加したものの p388 細胞の経時変化を示す．5.6 cell/mL（×10⁴）の p388 細胞に発酵 14 日目の酵素シロップと滅菌水を添加したところ，滅菌水添加では 308 cell/mL（× 10⁴）まで増加し（p ＜ 0.05），酵素シロップ添加では，1.5 cell/mL（×10⁴）から 31 cell/mL （×10⁴）の間で増減がみられた（p ＜ 0.05）．培養 2 日目での滅菌水添加は 21 cell/mL（×10⁴）でシロップ添加は 1.5 cell/mL（×10⁴）であり有意な差がみられた（p ＜ 0.05）．培養 5 日目での滅菌水添加は 183 cell/mL. （×10⁴）でシロップ添加は 31 cell/mL（×10⁴）であり有意な差がみられた（p ＜ 0.05）．培養 7 日目での滅菌水添加は 308 cell/mL（×10⁴）でシロップ添加は 7.0 cell/mL（×10⁴）であり有意な差がみられた. （p ＜ 0.05）．. 2 α- グルコシダーゼ阻害作用の評価. 表 1に発酵によるα-グルコシダーゼ阻害活性の変化を示す．. リンゴのα-グルコシダーゼ阻害活性は 31％で，酵. 69Functional Food Research Vol.16 2020. 素シロップは発酵 7 日目において 98％，14 日目において 96％でリンゴ自体のα-グルコシダーゼ阻害活性より酵素シロップの方が有意に高い値を示した（p ＜ 0.05）．酵素シロップでは 7 日目と 14 日目において有意な差はみられなかった（p ＞ 0.05）．. 3 抗酸化作用の評価. 表 2に DPPH ラジカル消去活性の変化を示す．リンゴの DPPH ラジカル消去活性は 96％で，酵素シロップは発酵 7 日目において 71％，14 日目において 69％でリンゴ自体の DPPH ラジカル消去活性は酵素シロップより有意に高い値を示した（p ＜ 0.05）．. 4 発酵に関与している微生物種の同定. 表 3に発酵過程における pH の変化を示す．リンゴ自体の pH は pH 4.1，酵素シロップ発酵７日目で pH 4.3，発酵 14 日目で pH 4.2 で，発酵による pH の経時変化は確認されなかった（p ＞ 0.05）．表 4に発酵 7 日目および 14 日目の微生物検査に. おけるコロニー数を示す．BCP 加プレート培地では 7 日目，14 日目とも検出されなかったが，標準寒天培地では酵素シロップに漬かっているリンゴは発酵 7 日目で 8.6 × 106 CFU/g で，14 日目で 1.3 × 10⁷ CFU/g まで増加し（p ＜ 0.05），酵素シロップは 7 日目で 4.3 × 107 CFU/ ｇで，14 日目で 1.5 × 10⁸. ●：滅菌水 ▲：酵素シロップ *; p<0.05 滅菌水と酵素シロップ添加で有意差あり. ●：滅菌水 ▲：酵素シロップ *; p<0.05 滅菌水と酵素シロップ添加で有意差あり. p3 88. ce lls. /m L( ×1. 0⁴ ). 0. 100. 200. 300. 400. days 0 2 4 5 7. p3 88. ce lls. /m L(. ×1 0⁴. ). 100. 200. 300. 400. days 0 2 4 5 7. 表1. 発酵によるα-グルコシダーゼ阻害活性の変化試料 α-グルコシダーゼ阻害活性(%) p リンゴ 31 ± 1.2 -. ＊. ＊. ＊. ＊. ＊. ＊. ●：滅菌水 ▲：酵素シロップ *; p<0.05 滅菌水と酵素シロップ添加で有意差あり. ●：滅菌水 ▲：酵素シロップ *; p<0.05 滅菌水と酵素シロップ添加で有意差あり. p3 88. c el. ls /m. L( ×1. 0⁴ ). 0. 100. 200. 300. 400. days 0 2 4 5 7. p3 88. c el. ls /m. L( ×1. 0⁴ ). 100. 200. 300. 400. days 0 2 4 5 7. 表1. 発酵によるα-グルコシダーゼ阻害活性の変化試料 α-グルコシダーゼ阻害活性(%) p リンゴ 31 ± 1.2 -. ＊. ＊. ＊. ＊. ＊. ＊. 図 1 発酵日数 7日目の酵素シロップ添加時の p388 細胞の経時変化測定は n = 8 で行った． ●：滅菌水 ▲：酵素シロップ. *; p ＜ 0.05 滅菌水と酵素シロップ添加で有意差あり．. 図 2 発酵日数 14日目の酵素シロップ添加時の p388 細胞の経時変化測定は n = 8 で行った． ●：滅菌水 ▲：酵素シロップ. *; p ＜ 0.05 滅菌水と酵素シロップ添加で有意差あり．. days. days. 70. CFU/g まで増加した（p ＜ 0.05）．標準寒天培地で確認されたコロニーは性状，色がす. べて同じであったことから，標準寒天培地で出現したコロニーについて微生物同定を行った．. 表 5にサンプルから得られた塩基配列と相同値（%Match）の高い上位 10 種を示す．その結果，Metschnikowia pulcherrima が相同値 97 ％で最も高かったことから，発酵に関与した微生物種. 試料 α-グルコシダーゼ阻害活性 (%) p リンゴ 31 ± 1.2 -. 発酵日数 7 日目 98 ± 2.6 p ＜ 0.05*. 試料 DPPH ラジカル消去活性 (%) p リンゴ 96 ± 0.03 -. 発酵日数 7 日目 71 ± 0.01 p ＜ 0.05* 発酵日数 14 日目 69 ± 0.01 p ＜ 0.05*. 試料 pH. リンゴ 4.1 ± 0.01. 7 日目 4.3 ± 0.01. 14 日目 4.2 ± 0.004. BCP 加プレート培地標準寒天培地. リンゴシロップリンゴシロップ. 7 日目 0 0 (8.6 ± 0.25) × 106 (4.3 ± 0.060) × 107. 14 日目 0 0 (1.3 ± 0.015) × 107 (1.5 ± 0.014) × 108. p - - p ＜ 0.05* p ＜ 0.05*. %Match Sequence Entry 97.37 Metschnikowia pulcherrima(ATCC=18406) 83.68 Metschnikowia reukaufii(ATCC=18407) 82.63 Metschnikowia zobellii(ATCC=22302) 82.39 Metschnikowia bicuspidata var.bicuspidata(ATCC=22297) 78.33 Candida oregonensis(ATCC=42268) 77.92 Candida pseudointermedia(ATCC=60126) 77.88 Candida intermedia(ATCC=14439) 77.34 Candida melibiosica(ATCC=18738) 75.31 Candida fructus(ATCC=24122) 75.28 Candida musae(ATCC=24123). 表 1 発酵によるα -グルコシダーゼ阻害活性の変化. α-グルコシダーゼ阻害活性の結果は平均値と標準偏差を表す．測定は n = 4 で行った． * 発酵日数 7 日目および 14 日目はリンゴと比較して有意差あり．. 表 2 発酵によるDPPHラジカル消去活性の変化. 表 3 発酵過程による pHの変化. DPPH ラジカル消去活性の結果は平均値と標準偏差を表す．測定は n = 5 で行った． * 発酵日数 7 日目および 14 日目はリンゴと比較して有意差あり．. DpH の結果は平均値と標準偏差を示す．測定は n = 3 で行った． * pH は検討したすべての値で有意差なし．. 表 4 微生物検査におけるコロニー数 (CFU/g). 表 5 サンプルから得られた塩基配列と相同値 (%Match) の高い上位 10種. コロニー数の結果は平均値と標準偏差を示す．測定は n = 2 で行った * リンゴ，シロップとも 7 日目と 14 日目のコロニー数に有意差あり．. 71Functional Food Research Vol.16 2020. は Metschnikowia pulcherrima であると考えられる．また，Metschnikowia reukaufii が相同値 84％， Metschnikowia zobellii が相同値 83％であった．. Ⅱ．考察. 1 がん細胞増殖抑制作用の評価. 図 1，図 2より，発酵日数 7 日目，14 日目の酵素シロップはともに強いがん細胞増殖抑制作用を示した．リンゴはリンゴポリフェノールによる抗がん作用が報告されている．リンゴポリフェノールの一つであるフロレチンは抗腫瘍活性が報告されており，様々なヒトがん細胞を移植した無胸腺ヌードマウスのがんの進行の抑制効果を示した 21）．また，がん細胞のシグナル伝達を妨げる化合物の能力を示すなど抗がん剤開発のための有望な候補となっている 21）．また，リンゴに最も多く含まれるプロシアニジンも抗腫瘍作用が報告されており，T 細胞性免疫応答を増強することでマウスのがん細胞増殖を抑制した 22）．これらポリフェノールは果実よりも果皮や種子に多く含まれており 23），ブドウを発酵させて作られる赤ワインに多くのポリフェノールが含まれているのは主にブドウの果皮や種子に含まれるポリフェノールが発酵により抽出されたためである 24,25）．本研究においてもリンゴの果皮や種子のポリフェノールが発酵により抽出され，酵素シロップに多く含まれていた可能性が高い．これらから本実験の結果は，リンゴの元々持っているがん細胞増殖抑制作用を持つ物質がシロップに溶け出し，がん細胞増殖抑制作用を示したと考えられる．. 2 α - グルコシダーゼ阻害作用の評価. 表 1より，リンゴそのものに 30％のα-グルコシダーゼ阻害活性が確認された．リンゴにはプロシアニジンというポリフェノールの一種が含まれており，これは血糖値の上昇抑制が報告されていることから 26），リンゴ自体にα-グルコシダーゼ阻害活性があることがわかる．しかし，今回の実験においてリンゴ自体の α-グルコシダーゼ阻害活性よりも酵素シロップの方が有意に高い値を示した．リンゴのポリフェノールは果皮や種子に多く含まれており 23）．発酵を開始すると果皮や種皮からプロシアニジンを含んだポリフェノールが抽出されると報告されていることから 24,25），本研究においても，酵素シロップにリンゴ中のポリ. フェノールが多く抽出され，これらが高いα-グルコシダーゼの阻害活性を示したと考えられる．. 3 抗酸化作用の評価. 表 2より，DPPH ラジカル消去活性はりんごが 96％で最も高い値を示した．リンゴには抗酸化成分としてのポリフェノールを多く含有することが報告されている 27）．また，リンゴポリフェノール中で最も含有量の多いプロアントシアニジンはカテキン類よりも高い抗酸化作用を有すると報告されていることから 28），リンゴのポリフェノールは抗酸化作用に大きく寄与しているといえる．しかし，このポリフェノールは果物や野菜の組織内に含まれているポリフェノール酸化酵素と反応することにより褐色の物質に変化するため 29），調理や加工段階で抗酸化作用の低下が起こる．薗田ら（2016）は青森県産のジョナゴールドを用いて 50％リンゴ果汁溶液を作成し，60 分放置した結果，約 40％の DPPH ラジカル消去活性の低下を報告している 29）．しかし，本実験においては，リンゴが加工されているにも関わらず，約 25％の低下であった．りんごは発酵により抗酸化活性が上昇すると報告されており，これはポリフェノールが水と比較して 10％アルコールによく溶け，発酵中に放出されるためである 30）．またリンゴの皮には，リンゴの果肉よりも数倍高いポリフェノールが含まれており，また種子にも多量のフロリジンやフロレチンが含まれている 30）．リンゴ全体を利用して発酵することで，多くのポリフェノールがジュースやワイン，またはその他の製品に移行する 30）．したがって，リンゴ果汁のみではなく，果皮や種子からも多量のポリフェノールが抽出されたことにより高い DPPH ラジカル消去活性を示したと考えられる．. 4 発酵に関与している微生物種の同定. 表 3より，酵素シロップ作成において pH の経時変化は確認できなかった．乳酸菌による発酵では pH が低下し，Lactobacillus plantarum はリンゴ酸を乳酸と炭酸ガスに変換することにより pH を低下させ 31），豆乳ヨーグルトの発酵においては発酵 1 日目で pH 7.0 から pH 5.0 となり，その後 14 日目にかけて pH 4.0 まで低下したと報告されている 32）．しかし，本研究では発酵期間中に pH の低下はみられず，表 4より BCP 加プレート培地でコロニーが確認でき. 72. なかったことから，本研究における酵素シロップは乳酸菌による発酵ではないといえる．リンゴ果汁の自然発酵において，発酵初期に Saccharomyces bayanus 種が，発酵後期に Saccharomyces cerevisiae 種の生存が認められている 33）．Saccharomyces 属は醸造に関わる重要な酵母で 34），一部の酵母は標準寒天培地で生育が確認されている 35）．また，酵母は発酵期間中の pH 変化がわずかであることも報告されていることから 36），本研究においても酵母菌が増殖したと考えられる．. 微生物検査において Metschnikowia pulcherrima が相同値 97 ％であった．Metschnikowia pulcher︲ rima は主にリンゴやブドウなどの果物 37,38）や果樹に隣接する土壌 39）に生息し，成長基質としては主にグルコースおよび他の糖とされている 40）．ワイン製造において芳香における重要な酵母であり 41），低アルコール濃度のワイン製造ができることで注目されている 42）．本研究では酵素シロップの材料がリンゴで上白糖を使用していることから，Metschnikowia pulcherrima が働く条件を満たしている．また，リンゴで最も強い微生物種で 43），ワイン発酵においても発酵の最初の段階で優勢であると報告されている 44）．このことから，本研究においても他の菌種の増殖を抑え，この酵母のみにより発酵が進んだといえる．Metschnikowia pulcherrima のコロニーはクリーム色であり 45），一般生菌で確認されたコロニーの色と一致した．Metschnikowia pulcherrima は pH 3.6 から pH 5.2 で最大キラー効果を示すと報告されており 46），本研究の酵素シロップの pH は発酵期間を通してこの範囲内であった．これは表 4で確認された一般生菌の培地において Metschnikowia pulcherrima のみ生育が確認されていることと一致する結果であった．. まとめ. 本研究ではリンゴを砂糖漬けにして発酵させた酵素シロップのがん細胞増殖抑制作用，α-グルコシダーゼ阻害活性作用，抗酸化作用，発酵に関与している微生物の同定を行った．がん細胞増殖抑制作用では酵素シロップにおいてマウス白血病細胞 p388 の増殖抑制効果が確認された．α-グルコシダーゼ阻害作用ではリンゴ果実よも酵素シロップで高い阻害活性が確認された．抗酸化作用ではリンゴ果実自体と比較すると酵素シロップで低い値となった．ま. た，発酵に関与している微生物を同定した結果，相同率 97％で Metschnikowia pulcherrima であった．リンゴを砂糖漬けにして保存すると Metschnikowia pulcherrima によって発酵され，できあがった酵素シロップには高いがん細胞増殖抑制作用およびα-グルコシダーゼ阻害作用があることがわかった．これらの作用にはポリフェノール成分が大きく関与していると考えられることから，今後，シロップ中のポリフェノール成分を調査することで，酵素シロップのさらなる評価につながることが期待される．. ◆文献 1) 泉秀実．カット野菜の微生物学的品質と微生物制御．. 日本食品科学工学会誌．2005; 52: 5: 197-206. 2) 松田敏生，矢野俊博，丸山晶弘，熊谷英彦．有機. 酸類の抗菌作用 - 各種 pH における最小発育阻止濃度の検討 -．日本食品工業学会誌．1994; 41: 687- 702.. 3) 宮尾茂雄．発酵漬物と塩．日本海水学会誌．2002; 57: 11-16.. 4) 横関源延．水分活性と微生物．食衛誌．1975; 16: 146-152.. 5) 田川彰男，小川幸春．青果物ブランチングおよび乾燥へのマイクロ波の利用．浦上財団研究報告書． 2007; 15: 9-15.. 6) 分部麻希，村上千秋，丸山武紀，新谷いさお．野菜ジュース調整時の還元型及び酸化型ビタミン C の変化．日本調理科学会誌．2000; 33: 2: 221-228.. 7) Rietoi. じっくり時間をかけて作ろう！酵素シロップの作り方とアレンジレシピ．https://kinarino. jp/cat4-%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%83 %A1/8523-, 2017; 2019.12.26 accessed.. 8) Dong AR, Thuy HVT, Lo R, Bansal N, Turner MS. A genetic diversity study of antifungal Lacto︲ bacillus plantarum isolates. Food Control. 2017; 72: A: 83-89.. 9) Yang X, Zhou J, Fan L, Qin, Z, Chen Q, Zhao L. (2018) Antioxidant plantarum strains. Food Sci- ence and Biotechnology JST. 2018; 27: 1719- 1726.. 10) Ravanbakhshian R, Behbahani M. Evaluation of Anticancer Activity of Lacto-and Natural Fer- mented Onion Cultivars. Iranian Journal of Sci- ence and Technology, Transactions A:Science. 2018; 42: 1735-1742.. 11) Kumar RS, Kanmani P, Yuvaraj N, Pattukumar VA, Thirunavukkarasu CV, Arul V. Lactobacillus plantarum AS1 Isolated from South Indian Fer- mented Food Kallappam Suppress 1,2-Dimethyl Hydrazine (DMH)-Induced Colorectal Cancer in Male Wistar Rats. Applied Biochemistry and Biotechnology. PartA.Enzyme Engineering and Biotechnology. 2012; 166: 620-631.. 73Functional Food Research Vol.16 2020. 12) 辻賢治．ポリフェノール：薬用植物および食品の機能性成分 < 普及版 >．株式会社シーエムシー出版． 2019; 東京 : 158-161.. 13) 庄司俊彦．果実・果汁飲料と機能性成分 (4) リンゴと機能性成分 - リンゴポリフェノールの科学 -．食品と容器．2013; 54: 3: 143-148.,. 14) 中島伸佳，桑木信輔，石原浩二，田中英彦．乳酸菌・酵母発酵により発酵熟成させた「植物発酵エキス」の有効性．岡山県立大学保健福祉学部紀要．2012; 19: 1: 39-48．. 15) 小川拓人，右田光，島田聡子，市田淳治，長田恭一 . りんご搾汁残渣に存在するグルコシルセラミドの構造とその含有量．日本食品科学工学会誌．2014; 61: 6: 251-257.. 16) 森地敏樹．食品保存における乳酸菌の利用．日本食品科学工学会誌．2001; 49: 4: 207-219．. 17) 太田千穂，枩岡樹子，加藤善久，原口浩一，遠藤哲也，古賀信幸 . フェニルプロパノイド類とフラボノイド類の抗酸化作用とα-グルコシダーゼ阻害作用：構造活性相関について．中村学園大学・中村学園大学短期大学部研究紀要．2011; 43: 243-249. 18) 鈴木幸雄，山崎良樹，内田綱．種々の種子からの基質特異性が異なる多型のα-グルコシダーゼ．農学研究．1981; 59: 37-55.. 19) 馬橋由佳．炊飯過程における米内在性酵素の米飯食味への関与．日本調理科学会誌．2009; 42: 6: 369-377.. 20) 荒木裕子，山内なつき，篠原尚子，渡邊悟．国産紅茶の DPPH ラジカル消去活性とポリフェノール成分について 2014; 紀要 : 6: 1-10.. 21) Choi, BY. Biochemical Basis of Anti-Cancer- Effects of Phloretin-A Natural Dihydrochalcone, Molecules, 2019; 24: 2: 278.. 22) Zhang L, Wang S, Liu Z, Zhang L, Wang S, Wang B. Procyanidin, a kind of biological flavonoid, induces protective anti-tumor immunity and pro- tects mice from lethal B16F10 challenge. Inter- national Immunopharmacology. 2017; 47:251- 258.. 23) Satoru, K., Hiroyuki, Y., Soichi, N. Effects of Shading on the Levels and Activities of Antioxi- dative Compounds in the Skin of Lemons and Apples, J.Japan.Soc.Hort.Sci. 2003; 72: 3: 221- 223.. 24) 佐藤充克．赤ワインの健康効果〜レスベラロールについて：最近の話題〜．J．ASEV Jpn. 2015; 26: 1: 18-26. . 25) 横塚弘毅．日本のワインづくり赤ワインの製造におけるポリフェノールの挙動と役割．日薬理誌． 2000; 116: 補冊 1: 7-15. . 26) 庄司俊彦．リンゴ由来プロシアニジン類の機能性評価と機能性表示食品の開発腸内環境に着目したリンゴの機能性研究．日本農芸化学会誌．2017; 55: 9: 631-636. . 27) 濱渦康範，上田裕子，伴野潔．リンゴ ‘ つがる ’ 果実の抗酸化能と含有ポリフェノール成分の関係．園学雑．1999; 68: 3: 675-682. . 28) 濱渦康範，飯島悦子 . リンゴ果実抽出物のポリフェノール組成と抗酸化性．日本食品科学工学会誌． 1999; 46: 10: 645-651. . 29) 薗田邦博，玉田葉月，浅野 ( 白崎 ) 友美，橋本沙幸 . リンゴ果汁の褐変および DPPH ラジカル消去活性に対する柑橘系果実果汁添加の影響．金城学院大学論集自然科学編．2016;12: 2: 29-36.. 30) Pawel S, Tomasz T, Aleksandra DC, Pawel S, Ta- deusz T, Maria C. Influence of Prefermentative Treatments and Fermentation on the Antioxidant and Volatile Profiles of Apple Wines. J. Agric. Food Chem. 2009; 57: 11209-11217.. 31) Achi O K, Akubor P I. Microbiological characterization of yam fermentation for `Elubo' (yam flour)production. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2000; 16: 1: 3-7.. 32) 中川良二，藪内裕子，八十川大輔，長嶋浩二．Lac︲ tobacillus plantarum HOKKAIDO を用いた豆乳ヨーグルトの製造およびその機能性．日本食品科学工学会誌．2005; 52: 3: 140-143.. 33) Valles B S, Bedrinana R P, Garcia A G, Simon A Q. A molecular genetic study of natural strains of Saccharomyces isolated from Asturian cider fermentations. Journal of Applied Microbiology. 2007; 103: 4: 778-786.. 34) 見方洪三郎．最新の Saccharomyces 属酵母の分類．醸協．1998; 93: 11: 858-862.. 35) 有田富和，宮﨑麻由，植木洋，加藤浩之，那須務，渡邉節，沖村容子，御代田恭子．不良食品からの酵母様真菌類の分離と同定．宮城県保健環境センター年報．2010; 8: 42-44.. 36) 橋本俊朗，木村宏忠，高橋清．酵母による豆乳の凝固について．日本食品工業学会誌．1985; 32: 4: 255-259.. 37) Bizeau C, Moreau M. Evolution of yeast flora on cider apples in Brittany. Yeast. 1989; 5: Special: 491-494.38) Magyari I, Bene Z. Morphological and Taxonomic Study on Mycobiota of Noble Roted Grapes in the Tokaj Wine District. Acta Alimentaria. 2006; 35: 2: 237-246.. 39) Vadkertiova R, Dudasova H, Stratilova E, Balas- cakova M. Diversity of yeasts in the soil adjacent to fruit trees of the Rosaceae family, Yeast, 2019; 36: 10: 617-631.. 40) Nisiotou AA, Chorianopoulos N, Nychas GJE. Yeast heterogeneity during spontaneous fermentation of black Conservolea olives in different brine solutions. Journal of Applied Microbiology. 2010; 108: 2: 396-405.. 41) Su Y, Seguinot P, Sanchez I, Ortiz JA, Heras JM, Querol A, Camarasa C, Guillamon JM. Nitro- gen sources preferences of non-Saccharomyces yeasts to sustain growth and fermentation under winemaking conditions. Food Microbiology. 2020; 85: 103287.. 42) Varela C, Barker A, Tran T, Barker A, Tran T, Borneman A, Curtin C. Sensory profile and vol-. 74. Storage of vegetables and fruits for long durations inactivates important enzymes and degrades useful components such as vitamin C. An effective method of preservation bypassing these issues is by fermentation. The enzyme syrup extracted from fermented fruits and vegetables is presumed to have high concentrations of effective components. In this study, we investigated the cancer cell growth inhibitory, anti-oxidant, and α-glucosidase inhibitory effects of enzyme syrup obtained by fermenting apples. Moreover, we aimed to identify the microorganism responsible for fermentation.. Apples were sliced and stored with 1.1 times sugar in a glass container for 2 weeks. Enzyme syrup was extracted after 7 and 14 days.. To assess cancer cell growth inhibitory effects of the enzyme syrup, leukemia cell line P388 was grown in syrup or sterilized water at 37°C, 5.0% CO2 for 7 days, after which the amount of P388 in each medium was compared. To assess anti-oxidant effect, DPPH radical-scavenging activity was checked. Further, to test α-glucosidase inhibitory effects, α-glucosidase inhibiting activity was investigated. To identify the microorganism responsible for fermentation, enzyme syrup was spread onto a standard agar plate and incubated at 35°C for 2 days. The DNA of the resultant colonies was analyzed.. As observed, cell growth was suppressed with both 7 and 14 day fermented syrup. However, the anti-oxidant activity of the syrup was lower than that of apple extract. Furthermore, fermented syrup had high α-glucosidase inhibiting activity. The microorganism was identified as Metschnikowia pulcherrima in 97% of the colonies. To conclude, we found that apple fermented enzyme syrup has cancer cell growth inhibitory and α-glucosidase inhibitory activity.. Abstract. atile aroma composition of reduced alcohol Mer- lot wines fermented with Metschnikowia pulcher︲ rima and Saccharomyces uvarum. International Journal of Food Microbiology. 2017; 252: 1-9.. 43) Gross S, Kunz L, Mueller DC, Santos KA, Fre- imoser FM. Characterization of antagonistic yeasts for biocontrol applications on apples or in soil by quantitative analyses of synthetic yeast communities. Yeast. 2018; 35:10: 559-566.. 44) Schuetz M, Gafner J. Analysis of yeast diversity during spontaneous and induced alcoholic. fermentations. ournal of Applied Bacteriology. 1993; 75: 6: 551-558.. 45) UCDAVIS Viticulture and Enology. Metschnikow︲ ia pulcherrima, https://wineserver.ucdavis. edu/industry-info/enology/wine-microbiology/ yeast-mold/metschnikowia-pulcherrima. 2018; 2020.1.10 accessed.. 46) Farris G A, Mannazzu I, Budroni M. Iden- tification of killer factor in the yeast genus Metschnikowia. Biotechnology Letters. 1991; 13: 4: 297-298.