ラット免疫グロブリンの分離と子宮液中における免疫グロブリンの同定について

1977年2月 家 畜 繁 殖 誌22巻4号

ラ ッ ト免 疫 グ ロブ リンの分 離 と子 宮 液 中 に お け る免 疫

グ ロ ブ リ ン の 同 定 に つ い て

長 谷 川 喜 久*・ 菅 原 七 郎 ・竹 内 三 郎

(東北 大学農学部

家畜繁殖学教 室)

発 情 前 期 の ラ ッ トの子 宮 分 泌 液 中 に,血 清 蛋 白質 で あ るalbuminとglobulinお よび 子 宮 液 に 特 異 的 で あ る と考 え られ る多 くの蛋 白質 が 含 まれ てい る こ と を著 者 ら は す で に 明 らか に した1∼3)。 また,発 情 前 期 か ら発 情 期 に か け て増 加 す る 子宮 液 の蛋 白質 の 多 くは,γ 一globulin で あ る こ と を 明 らか に した1)。 しか しな が ら,ラ ッ ト子 宮 液 中 のimmunoglobulinの 種 類 につ い ては,ま だ殆 ど知 られ て い な い 。 従 って,こ れ らに 関 す る知 見 を 得 る こ とは,生 殖 免 疫 学的 な観 点 か ら非 常 に 重 要 で あ る とい わ れ てい る4∼7)。そ こで,本 研 究 に お い て まず ラ ッ トの immunoglobulin特 にIgGとIgA 8∼11)の分 離 を 試 み, そ れ ら の性 質 を 検 討 した。 さ らに,生 殖 免疫 学 的 観 点 か ら,子 宮 液 中 のimmunoglobulinの 同 定 を 行 った 。 材 料 お よ び 方 法 1)血 清,子 宮 液 お よび 初 乳 血 清 お よび子 宮 液 の採 取 は 前 報 の 方 法 に よ り 行 っ た1)。 初 乳 は分 娩 後2日 か ら3日 目 の新 生 児 の ラ ッ トの 胃か ら採 取 し,PBS(pH7.2)で2倍 に希 釈 後,5℃ で 12,000r.p.m. 1時 間 遠 心 分 離 を 行 って 乳 清 を 分 離 し, 以後 の実 験 に用 い た。 硫 安 飽 和 溶 液 に よる塩 析12),disc電 気泳 動 法,amido blackに よる染 色 な どは常 法 に よ り行 った1)。 2)Column chromatography Gelはsephadex-G200とsepharose-6Bを 用 い た 。 い ず れ もPBS溶 液 中で 膨 潤 させ た 後 に,長 さ100cm, 直 径2cmのcolumnに 充 填 した。 緩 衝 液 の流 速 は1 ml/cm2/hrで 行 った 。流 出液 は3mlず つ 分 取 し,分 光 光 度 計 に よ り波 長280mμ を 用 い そ の 吸 光 度 を 測 定 し た 。 イ オ ン 交 換chromatographyは,長 さ50cm,直 径3cmのcolumnに 充 填 し たDEAE celluloseを 用 い て 行 っ た 。

3)SDS polyacrylamide gel電 気 泳 動 法

WEBERとOsBORN 13)お よ びDUNKERとBUECKEBT 14) の 原 法 お よ び 林 と 大 場 の 改 良 法15)に よ り行 っ た 。acryl-amideの 濃 度 が5%のgelを 用 い,tracking色 素 は,0.1%のcoomasie brilliant blue R250溶 液 を 用 い た 。 蛋 白 質 のSDS化 は50℃ に2時 間 置 い て 行 っ た 。 2-rnercaptoethanol(2-ME)処 理 を す る 場 合 は,2。ME

の 終 末 濃 度 が4%に な る よ う に 試 料 に 加 え てSDS化 を 行 っ た 。acrylamide,bisacrylamideは,そ れ ぞ れ chloroformとacetoneで 精 製 し て か ら 用 い た 。 染 色 は 電 気 泳 動 後 にcoomasie brilliant blue G250に よ っ て 行 っ た16)。 蛋 白 質 分 画 の 易 動 度 を 測 定 し た 後,標 準 蛋 白 質 と し て はthyroglobulin(MW:65×104),ferritin(MW:54 ×104),bovine γ-globulin(MW:17.5×104),bovine semm albumin(MW:6.7×104),β-lactoglobulin (MW:3.6×104)お よ びchymotrypsinogen A(MW: 2.5×104)な ど を 用 い 各 分 画 の 蛋 白 質 の 分 子 量 を 概 算 し た 。 4)蔗 糖 密 度 勾 配 遠 心 分 離 法 0.01Mの リ ン酸 緩 衝 液 を 用 い て5%か ら20%の蔗 糖 密 度 勾 配 液4mlに 試 料 を0.2ml載 せ,日 立 のRP 400のroterを 用 い,35,000r.p.m.で8時 間 遠 心 分 離 を 続 け た 。 分 子 量 の 標 準 蛋 白 質 と し て は,urease(MW: 48.5×104)とcatarase(MW:22×104)を 用 い た 。 5)Ouchterlony法 お よ び 免 疫 電 気 泳 動 前 報3)と 同 様 に 行 っ た 。 6)IgGとIgAの 分 離 IgGの 分 離 は,硫 安 の40%飽 和 に よ り血 清 か ら 得 た globulinをDEAE cellulose column chromatography

に よ り行 っ た17)。 流 出 液 は,0.01M:pH7.5・0.02M

pH6.2・0.05M:pH5.3の リ ン 酸 緩 衝 液 を 順 次 用 い,

*現 所 属:群 馬 大 学 医 学 部 産 婦 人 科 学 教 室

Isolation of rat immunoglobulins

and

determina-tion of immunogiobulins

in rat uterine fluid.

HASEGAWA, Yoshihisa*,

Shichiro

SUGAWARA &

Saburo TAKEUCHI (Laboratory

of Animal

Reproduc-tion, Tohoku University,

Sendai; *Present address:

Department

of Obstetrics

and Gynecology,

School

of Medicine, Gunma University,

Maebashi 371)

1977年2月

家畜繁殖 誌22巻4号

最 後 に,0.5MのNaCIを 含 ん だ0.05Mの リン酸 緩 衝 液 で 溶 出 した。 血 清 か らのIgAの 分 離 は 硫 安33%飽 和 に よ り得 た γ-globulinをsepharose-6Bに よ り分 画 した。 初 乳 中 のIgAは 前 述 の乳 清 を 酢 酸 に よ りpH4.6に 調 整 し沈 澱 物 を 除 き,さ らに 硫 安50%飽 和 に よ っ て albuminを 除 い た 後 にsephadex-G200,sepharose-6B お よびDEAE cellulose column chromatographyに よ って 分 画 した 。

実 験 結 果

1.Immunoglobulinの 分 離

1)IgG: DEAE cellulose column chromatography の結 果 はFig. 1に 示 す よ うに4分 画 に 分 かれ た が,図 示 した よ うに5分 画 に分 け て 各 分 画 の蛋 白質 成 分 を 免 疫 電 気 泳 動 に よっ て 分 析 した 。 そ の結 果,第1分 画 は 最 も 陰 極 側 に2本 の沈 降 線 を示 して い た の でIgG2分 画 と推 定 す る。 第II分 画 は,第1分 画 の蛋 白 よ りや や 陽極 側 に 1本 の沈 降 線 を示 しIgG1分 画 と推 定 され る。 第III分画 お よ び第IV分 画 に は,IgG1と 他 のglobulinが 混 在 し てい た 。 第V分 画 に は多 種 のglobulinが 含 まれ て お り, IgAお よびIgMは こ の分 画 に 混 入 して い る と考 え ら れ る。

2)IgA:sepharose-6B column chromatography に よっ て得 られ た結 果 はFig.2aに 示 し,各peakの 免 疫 電 気泳 動 像 はFig. 2bに 示 した 。 第2峰 は 陽 極 側 の蛋 白質 で あ り,第3峰 は 陰 極 に 移動 す る蛋 白 質 で あ っ た 。 しか し第1峰 はDAUGHADAYの 蛋 白質 の測 定 法1)に よ っ て も蛋 白質 は 全 く検 出 で きな か った 。 次 に 初 乳 か らIgAの 分 離 を 行 っ た 。sephadex-G200 column chromatographyに よ っ て 得 た 第1峰 をse-pharose-6B column chromatographyを 行 い,2つ の 分 画 像 を 得 た 。 免 疫 電 気 泳 動 の 結 果 か ら 最 初 のpeakは IgM,次 のpeakはIgA分 画 で あ る こ と が わ か っ た 。 血 清 お よ び 初 乳 よ り得 たIgAはdisc電 気 泳 動 で は 原 点 よ りわ ず か に 移 動 す る の み で あ っ た 。 免 疫 電 気 泳 動 像 で は,そ れ ぞ れ のIgAは 原 点 よ りや や 陽 極 側 に 位 置 し て い た が,血 清IgAは 乳 清IgAよ り も わ ず か な が ら 陽 極 側 に 移 動 した 。 血 清 と 乳 清 のIgAをOuchterlony 法 で 分 析 し た 結 果,こ れ ら のIgAは 融 合 し,免 疫 化 学 的 に 等 し い こ と が わ か っ た(Fig. 3b)。 次 に これ ら のIgGお よ びIgAの 物 理 化 学 的 性 質 に つ い て 検 討 し た 。SDS電 気 泳 動 の 結 果 はFig. 4に 示 す

と お り で あ る 。IgG1お よ びIgG2は と も に 多 く のband に 分 か れ た が,bovineγ-globulinやaldoraseに 近 い 位 置 に 主 な 分 画 が 認 め られ た(Fig.4A,B)。 ま た2-ME処 理 に よ り,こ の 蛋 白 質 分 画 は 分 子 量 の 小 さ い3つ のbandに 分 か れ た 。 血 清 と乳 清 のIgAは,原 点 近 く のthyroglobulinとferritinの 間 の 位 置 にbandが Fig. 1. Fractionation of rat serum ƒÁ-globulins

by DEAE-cellulose chromatograthy with stepwise addition of phosphate buffers.

Fig. 2a. Fractionation of rat serum ƒÁ-globulins by sepharose-6B column chromatography. Fig. 2b. Each peak was analyzed for

immu-noglobulin by immunoelectrophoresis.

1977年2月

家畜 繁殖誌22巻4号

現 れ た 。 また,2第ME処 理 す る こ とに よ り3つ あ るい は そ れ 以上 の蛋 白質 に 分割 され た 。 血 清IgAに つ い て,さ らに 蕨糖 密 度 勾 配 超遠 心 法 に よ っ て検 討 した が,Fig,5に 示 す とお り,血 清IgAは 標 準 蛋 白 質 のureaseよ り高 分 子 で あ る こ と が わ か っ た 。 3)ラ ッ トのIgGとIgAの 共 通[性に つ い て:Ou-chterlony法 に よ って 分 析 した と こ ろ,IgGとIgAの 間 に 交 差 反 応 が 見 られ た 。 さ らに,抗IgA家 免 血 清 を IgGで 吸 収 した 後 に も,そ の抗 体 と ラ ッ トのIgAと の 間 に 反 応 が み られ た 。 2.子 宮液 中 のimmunoglobulin 発 情 前 期 の子 宮 液 中 に γ-globulinに 相 当す る蛋 白質 が 多 量 含 有 され て い る こ とは 実 験 の結 果 明 らか に な った が1,3),さ らに 免疫 化 学 的 な 検討 を 加 え た 。 抗 子 宮 液 抗 体(AUF)と 血 清 お よび 血 清 で 吸 収 した 抗 子 宮 液 抗 体 (AUF+S)に 子 宮液 を 反応 させ る と,globulin領 域 に 位 置 す る 子宮 液 に 多量 に 含 まれ て い る 蛋 白 質 は,AUF に 血 清 あ るい は 子 宮 液 を 反 応 させ る と沈 降 線 を 形 成 し た。 しか し,吸 収 後 の 抗 体 に 子 宮 液 を 反 応 させ て も沈 降 反 応 は認 め られ な か った 。次 に 血 清 と乳 清 か ら得 たIgG, IgA,IgMとAUFの それ ぞれ の 間 の 反 応 で は,IgG とは 痕跡 程 度 の沈 降 線 が 認 め られ るに す ぎず,子 宮 液 中 にIgGの 少 な い こ とが 示 され た 。IgMに 対 して は,不 明瞭 な沈 降 線 が 認 め られ た。IgAとAUFと 反 応 で は 極 め て鋭 敏 な沈 降線 を 形成 し,そ の沈 降線 の位 置 は,血 清 とAUFの 反応 で 観 察 され た 沈 降線 の 位 置 と ほ ぼ一 致 した。 こ の沈 降 線 は,血 清 お よび初 乳 か ら 分 離 し た IgAが 示 した沈 降 線 よ りも さ らに 陰 極 側 に あ り,IgG1 の位 置 に まで 伸 び て い た 。IgG1とAUFと の 間 に は, 極 め て微 弱 な 沈 降 線 の形 成 しか 認 め られ な か った 。 蔗 糖 密 度 勾 配 法 に よ り子 宮 液 中 の蛋 白質 の分 子 量 を測 定 し,前 述 のIgAの 分 析 の結 果 と比 較 検討 した(Fig. 7)。 そ の結 果,子 宮 液 の蛋 白 質 は,cataraseよ り分 子 量 の小 さい もの が 殆 どで あ り,大 きい も のは 少 な か っ

Fig. 3a.

Immunoelectrophoretical

analysis

of

serum

protein,

and

IgG.

Uper

well

contain normal rat serum (S), and lower

well IgG.

Fig. 3b.

Ouchterlony

test

of rat IgA.

Uper

well contain

anti-rat

serum antiserum,

lower left contain secretary

IgA (SIgA)

obtained from colostrum and lower right

contain secouns peak in Fig. 2a.

Fig. 5. Density gradient ultracentrifugation of rat serum IgA compared to marker proteins. Sedimentation is from right to left.

Fig. 7. Density gradient ultracentrifugation of rat uterine fluid at 22:00 of proestrus compared to marker proteins.

1977年2月 家 畜 繁 殖 誌22巻4号 た 。 しか しな が,前 述 のIgAの 沈 降位 置,さ らに 高 分 子 分 画 の 位 置 にpeakを 認 め た 。

考

察

人 や マ ウ ス のimmunoglobulinに つ い て は,そ の 物 理 化 学 的,免 疫 化 学 的 性 質 やallotypeの 遺 伝 学 的 性 質 に つ い て 非 常 に 多 くの 研 究 が 見 られ る 。 し か し ラ ッ トの immunoglobulinに 関 す る 研 究 は 比 較 的 少 な い よ うで あ る 。 初 めARNASONら18)に よ っ て ラッ トのimmuno。 globulinはIgGとIgXに 分 類 さ れ,そ の 後,IgGに はIgGaとIgGbのsubclassが 発 見 さ れ,IgXは, そ の 易 動 度 が 人 のIgAに 類 似 し て い る こ と か らIgAと 考 え られ た 。 し か し,蛋 白 質 の 物 理 化 学 的 性 質 はIgA と は 異 な り,γ1,7Sγ1,あ る い はIgG1と 呼 ば れ て い る immunoglobulinに 属 す る も の の 一 種 で あ っ た19)。 しか し,ラ ッ トのIgAは 最 近 に な っ て,γ-globulinの 免 疫 電 気 泳 動 に よ る 沈 降 線 に つ い て,各 々 のimmunoglobulin が 同 定 さ れ る こ と に よ り,IgAの 位 置 も 示 さ れ た20)。 一 般 にimmunogiobulinの 分 離 は 種 々 のchromato-graphyや 電 気 泳 動 法 な ど に よ り行 わ れ て い る が,本 研 究 に お い て も,IgGの 分 離 法 はDEAE celluloseを 用 い た イ オ ン 交 換column chromatographyに よ り,IgA

の 分 離 法 はsephadex-G200お よ びsepharose-6Bを 用 いcolumn chromatographyを こ よ っ て 行 っ た 。IgGに 用 い る 緩 衝 液 は 分 離 す るsubclassや 動 物 の 種 な ど に よ り種 々 の も の が 使 用 さ れ て い る 。 著 者 ら は,リ ン酸 緩 衝 液 を 用 い,イ オ ン 交 換chromatographyに よ りIgGの 分 離 を 行 っ た17,21)。 す で に ラ ッ トの 外 分 泌 物 よ りIgAの 分 離 は 試 み ら れ て い る が,血 清IgAの 分 離 は あ ま り行 わ れ て い な い 。 sephadex-G200を 用 い たcolumn chromatography に よ っ てIgAを 単 離 す る こ と が で き な か っ た の で, sepharose-6Bを 用 い たcolumn chromatographyに よ り,塩 析 で 得 た γ-globulinか ら のIgA分 離 を 試 み た と こ ろ,ほ ぼ 単 一 の 蛋 白 質 を 得 る こ と が で き た 。 人 血 清 のIgAはmonomerで あ り分 子 量 は 分 泌 型IgAの 半 分 以 下 で,IgGの そ れ に 近 似 して い る と さ れ て い る11)。 本 研 究 に お い て ラ ッ トのIgGお よ びIgAに つ い て の 物 理 化 学 的 性 質 を 検 討 し た 結 果,IgGの 分 子 量 は 約16 万 で,3つ のsubclassか ら 構 成 され て い る と 推 定 さ れ た 。 血 清 お よ び 乳 清 か ら得 たIgAの 分 子 量 はIgGの 約3倍 で あ り,IgG同 様 に4つ のsubclassの 存 在 が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 人 と ラ ッ トのimmunoglobulinを 比 較 す る た め に,人 のIgGと 血 清IgAをSDS電 気 泳 動 に よ り分析 した とこ ろ,人 のIgGの 泳動像 と ラ ッ ト のIgGの 泳動 像 は類 似 して い た が,ラ ッ トと人 の血 清 IgAの 泳 動 像 は 異 な り生 物 物 理 化 学 的 に 性 質 の異 な る こ とが 明 らか に な っ た。 従 来,ラ ッ トの 分泌 液 中 のIgAの 分 離 は 主 に 初 乳 を用 い て行 わ れ て い るが,SUTECH8CHULFEら22)の 初 乳 か ら のIgAの 分離 法 を試 み た が,未 だ か な りの混 入 物 が あ った 。 そ こで,本 実 験 で は,酢 酸 お よび硫 安 に よ る処 理 お よびsepharoser6Bに よ るcolumn chromatography を 行 うこ とに よ りIgAを 単 離 す る こ とが で きた 。

他 の動 物17)のIgAの 分 離 に用 い られ て い るDEAE cellulose column chromatographyを 応 用 した ラ ッ ト

の初 乳IgAの 分離 法 で は,本 実 験 に お い て は 他 の 報 告17,22)に示 され た よ うな 良 い結 果 は得 られ な か った。 免 疫 生 殖 学 の研 究 に よ り,雌 の 生殖 器 管 に 抗精 子 抗体 が 産 生 され る と,そ れ が 不妊 の 原 因 とな る可 能 性 のあ る こ とが 報 告 され て い る4,5)。そ れ らの 抗 体 の 産 生 され る 機 序 に つ い て は,す で に 多 くの研 究 が み られ る とは い え, 未 だ 不 明 の点 が 少 な くな い 。 特 に,そ れ ら の過 程 に おけ る抗 原 の感 作 と,そ の後 の生 殖 器 道 分 泌 液 へ の 抗 体 の 移 行 につ い て 明 らか にす る た め,種 々の 動物 に つ い て immunoglobulinの 検 索 お よび 同 定 が試 み られ て い る。 しか しな が ら,ラ ッ トの 子 宮 液 中 のimmunoglobulin に 関 す る報 告 は み られ な い 。 本 研 究 に おい て,ラ ッ ト血 清 中 のimmunoglobulinの 性 質 を 検 索 す る と と も もに, 子宮 液 中 のimmunoglobulinに つ い て も 検 討 し た 。 IgGは,発 情 前 期 か ら発 情 期 の 子宮 液 中 に は 殆 ど認 め られ な か た 。 従 っ て,交 尾 に よ り子 宮 内 に 入 っ た精 子 は IgG抗 体 に曝 され る危 険 性 は殆 どな い と考 え ら れ る。 な お,卵 管 に お け る感 作 につ い て は 不 明 で あ るが,少 な くと も妊 娠 初 期 の子 宮 液 中 のimmunoglobulinの 組 成 は 血 清 の そ れに 類 似 して い る と ころ か ら23),受 精 卵 の成 長 また は 着 床 時 期 に 卵 がIgG抗 体 に よ る 阻 害 を 受 け る 可 能 性 が あ る。 IgAに つ い て は,未 だ 不 明 の 点 が あ るが,子 宮 液 中 に は γ-globulinが 多 く存 在 し,分 子 量 か ら推定 すれ ば IgG likeで あ るが,免 疫 学 的 に は 抗IgG抗 体 とは沈 降 線 を形 成 せ ず,む しろ抗IgA抗 体 と交 差 した｡免 疫 電 気 泳 動 に お け る沈 降線 は よ り原 点 に 近 い と ころ(既 知 の IgAに 近 い 位 置)に 認 め られ る の で,子 宮 液 に多 い γ-globulinは お そ ら くIgAで あ ろ う と考 え られ る。 そ の 蛋 白 質 の物 理 化 学 的 性 質 は,血 清 お よび 乳 清 か ら分 離 し たIgAと は 異 な る もの で,分 子 量 も小 さい もの と思 わ れ る。 142

1977年2月 家 畜 繁 殖 誌22巻4号 これ まで の研 究19)によ っ て,ラ ッ トの血 清IgAは 高 分 子 型 と低 分 子 型 の2種 類 が あ る こ とが 示 唆 され て い る こ とな どを 考 え 合 わ せ る と,ラ ッ ト子宮 液 中 に 特 に 多 い 血 清 蛋 白質 は,血 清 中 の低 分 子 のIgAが 透 過 して 子 宮 液 中 に認 め られ る た め で あ ろ う と推 定 され る。 こ の よ うに,著 者 らの研 究 に よ って ラ ッ トの発 情 期 の 子 宮 液 中 の蛋 白質 組 成 の特 異 性 が 明 らか に さ れ た が, 血 清 と子 宮 液 中 のimmunoglobulinの 組 成 の違 い は 子 宮 組 織 に よ り制 御 され て い る も の と思 わ れ る。

要

約

本 報 で は,ラ ッ トのimmunoglobulinの 分 離 同定 お よび そ の物 理 化 学 的 性 質 を し らべ る と共 に,子 宮 液 中 の immunoglobulinの 存 在 様 式 の特 異 性 に つ い て 検 討 し た｡ IgGとIgAは 血 清 お よび初 乳 乳 清 か ら,塩 析,gel 炉 過 お よび イ オ ン交 換column chromatographyに よ っ て 分離 され た 。 そ れ ら の物 理 化 学 的 性 質 の検 討 をdisc お よびSDSgel電 気 泳 動,免 疫 電 気 泳 動 お よび蔗 糖 密 度 勾 配 遠心 分離 に よ り行 った と こ ろ,IgGとIgAの 分 子 量,そ れ らのsubclassと 免疫 化学 的 性 質 が 明 らか に され た 。 子 宮 液 中 のimmunoglobulinに つ い て,免 疫 化学 的 方 法 に よ り同 定 した とこ ろ,IgGが 著 し く少 な く,IgA と免 疫 化 学 的 に 共 通 で あ り,IgAよ り 分 子 量 の 小 さい immunoglobulinが 認 め られ た。 (1976.7.15受 付)

文

献

1)長 谷 川(喜)・ 菅 原(七)・ 竹 内(三):本 誌,19, 26, 1973. 2)長 谷 川(喜)・ 菅 原(七)・ 竹 内(三):本 誌,19, 73, 1973. 3)HAsEGAWA,Y.,S.SuGAwARA&S.TAKEUCHI:

Tohoku J..Agr. Res. 25, 67, 1974.

4)礒 島(晋):妊 孕 現 象 に 関 す る 免 疫 学 的 研 究 第23 回 日本 産 科 婦 人 科 学 会 宿 題 報 告,東 京,1971.

5)BEHRMAN,S.J.:The Mammalian Oviduct ed.B.J.BLANDAu&E.S.E.HAFEZ.The

University of Chicago Press Chicago, London 1971.

6) EDwARDS, R.G.: Immunology and Reproduc-tioned.R.G.EDwARDs,International Planned Parenthood Federation Loridon 1969. 7) BEHRMAN,S.J.,M.E.LIEBERMAN,N.UcHIDA

&R. AxsBACxER: Pathways to Conception ed.A.I.SHERMAN,C.C.THoMAs Publisher Springfield, Il1inois 1971.

8) TOMASI, T.B. & J.BIENENSTOCB: Advances in Immunology Vo1. 9 ed. F.J. DIXON and

H .G. KUNREL, Academic Press Now York, London1968.

9) BEER,A.E.&R.E.BILLINGHAM: Advances in Immunology Vol.14 ed.F.J.DIXSON& H.G. KUNKEL, Academic Press New York, London 1971.

10)小 林(邦):生 物 物 理 化 学,18,35,1974. 11)小 林(次):蛋 白 核 酸 酵 素,18,828,1974.

12)松 岡(雄):免 疫 学 ・ ア レ ル ギ ー 学 実 験 法,進 藤 宙 二 監 修,文 光 堂,東 京,1971.

13)WEBER,K.& M. OSBON: J.Biol.Chem., 244, 4406, 1969.

14) DuxKER, A. K. & R. R. RuECxER.T : J. Biol. Chem., 244, 5074, 1969. 15)林(健)・ 大 場(義):蛋 白 質 核 酸 酵 素,17,304, 1972. 16) DIEZEL,W.,G.KOPPERSCHLAGER&E.HOFMAN: Analyt. Biochem., 48, 617, 1972. 17)臼 井(美)・ 成 内(秀)・ 松 橋(直):免 疫 化 学,中 山 書 店,東 京,1973. 18)ARNASON,B.G.,C.deVAUXST.CYR&P. GxABAR: Nature, 199, 1199, 1963. 19) BAZIN, H., A. BECKERS & P. OUERINJEAN:

Eur. J. Immunol., 4, 44, 1974.

20) BisTANY, T. S. & T. B. ToMASI: Immuno-chem., 7, 453, 1970.

21) JONES, V.E.: Immunology, 16, 589, 1969. 22) STECHSCHULTE, D. J. & K.F. AUSTEx: J.

Immunol., 104, 1052, 1970.

23)長 谷 川(喜)・ 菅 原(七)・ 竹 内(三):本 誌,22, 109, 1976.

Summary

Present study was designed to isolate immunoglobulins from serum and colostrum whey, and

determine immunoglobulins in uterine fluid of proestrous rat. Results obtained were as follows:

1. Subclass of IgG and IgA in serum and colostrum whey were obtained by DEAE cellulose, sephadex-G 200 and sepharose-6B column chromatography (Figs. 1 •`3).

electro-1977年2月 家 畜 繁 殖 誌22巻4号

phoresis and density gradient ultracentrifugation methods (Figs. 4, 5). Molecular weight of isolated IgG and IgA was about 16•~104 and 50•~104, respectively.

3. Immunoglobulins in uterine fluid were determined by immunoelectrophoresis. Although high

molecular IgA in uterine fluid determined by physicochemical analysis was very small amount, uterine fluid contained high level of the protein component reacted to serum IgA, of which molecular weight

is smaller than 20•~104.

Immunoglobulin G was not appeared in the rat uterine fluid at 22:00 of proestrus.

Explanation of Figures

Fig. 4. SDS acrylamide

gel electrophoresis

of immunoglobulins.

(A)

rat immunoglovulin

G2a

(B)

rat immunoglobulin

G1

(C)

human serum immunoglobulin

A

(D)

rat serum immunoglobulin

A

(E)

rat colostrum immnoglobulin

A

2ME, SDS gel electrophoretic

pattern

of protein

treated

with 2-melcaptethanol.

Fig. 6. Immunoelectrophoretic

analysis

of immunoglobulins

and specific portein in uterine

fluid

at 22:00 of proestrus.

UF, uterine

fluid

AUF, anti-uterine

fluid antiserum

S, serum

AUF+S,

AUF absorbed with serum protein

1977年2月

家 畜繁殖誌22巻4号

PLATE

Fig. 4.