高血圧自然発症ラット導管系血管平滑筋における収縮反応亢進とカルシウム動態異常に関する研究

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(1)博士学位論文. 高血圧自然発症ラット導管系血管平滑筋における収縮反応冗進とカルシウム動態異常に関する研究. 関口富美子博士薬. 3 7.

(2) 博士学位論文. 高血圧自然発症ラット導管系血管平滑筋における収縮反応冗進とカルシウム動態異常に関する研究. 平成 12年 6月. 関口富美子.

(3) 目次. 序論司ーーーーー----同ーーーーーーー----ー田---ーーーーーー--ーーーーーーーーーー歯周ーー-----ーー『ー-1. 第 1章高血圧自然発症ラット大動脈を用いた収縮実験における至適初期伸展張力の検討ーー--ーー自由ーーーーーーーーーーーーーー---ー-ーーーーーーーーーー--3 I.緒言 ---国ーーーーーーー四ーー『同ーーーー・"ーー同ーーー--‘ー----ーーーーーー--自『ー田ーーー--3. I I . 実験方法ーーーー---ーーーーーーーーーーー勘ーーーーーーーーー----ーーーー四ーーーーーーーーーーー-3 1 . 実験動物-ーーーーー----ーーーーーーーーーーーーー由回ーーーー『ーーーーーー司ーー田ーー----3 2 . 血圧測定-ーーー値目ー四回ーーー--------ーー----ーーー『ーーー四四ー-------ー--4. 3 . 標本 -----戸------国司ーー園田ー田町----岨町--------ーーー幽四ーー -------4 4 . 生理学的塩類溶液回ー司自----幽--副司司岨ー-----------------ー戸 -4 5 . 張力誤u 定幽--自由司直田----曲目ー四甲回目白----ーーーー胡町------悶------何回目5. 6‘ 試薬ー司自--喧-----四回『四回ーー四回世ー戸田--------自問 --------------5 7 . 統計処理 -----自由ーーーー---ー幽--園田ー国町一国---園町ーー----------四ー -5 I I I . 実験結果. E. 戸 --------------ー国ー田町田ー曲目『ー--戸田町一---------回目ー田町 -6. 1 . ラットの体重と血圧叩『個目白血園田ーー一回目ー唱曲目見『血-司冊目白園田-曲師ー司ー-6 E. -6 2 . 自発性筋緊張におよぼす初期伸展張力の影響ーー白押ー---ーーー--ー--白 3 .N o r a d r e n a l i n e収縮におよぼす初期伸展張力の影響四回目~ ----由担-申 --7 4 . 高 K+収縮におよぼす初期伸展張力の影響ー崎町田幽------白ー四ーーーーー--9. 5 .A c e t y l c h o l i n eによる内皮依存性弛緩におよぼす初期伸展. 目 --四--曲目白血ーー------ー周目白血---ーーー岨---1 1 張力の影響ーーーーーーー幽帽回 F. 6 . Sodiumn i t r o p r u s s i d eによる弛緩におよぼす初期伸展張力の影響----12 c e t y l c h o l i n e内皮依存性弛緩に対する 7 . 各イ申展張力下における a N G n i t r o L a r g i n i n eおよび i n d o m e t h a c i nの効果-ーーーーー---ーーーーーーーー -13. I V . 考察，ーー恒ー明ーーー時ー四ー--------ーーーー町ー--.----ー--ーーーーーー--ーーーーー同 15 V . 小括-ーーーーーーーーーー--・帽ーーー---ーー--・司ーーーーーーーー『ー---------司ーーー-19. 第 2章高血圧自然発症ラット大動脈平滑筋における自発性筋緊張ーーーーーーーーー--20 1.緒言ーーーー司ーーーーーーーーーー---闇・ー-ー"ーーーーーーーーーーー田恒ー司『ーーー同ーーーーーー--20 1 1.実験方法----ーーーーーーーーーーー---ーー由同ーーーーーーーーーーーーーーーーーーー----白慣 20.

(4) 1 . 実験動物ーーーーー---ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー・ーーー司司-20. 2 . 血圧測定ー ----悶ーーーー同ーーーーーーーーーーーーーーーー曲目ーー田'ーーー戸ー・ーーー回目-2 1 1 3 . 標本 ----ーーーーーーーーーー・ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー---2 4 . 生理学的塩類溶液"ーーーーーーー『ーーーーーーーーーーーーーーーーーーー』ーーーーーーーー-2 1 5 . 張力測定ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー------ーーーーーーーーーーーーー-2 1 2 6 . 細胞内 Ca +レベル測定ーーーーー，ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-2 2. 2 7 . 試薬-ーー田明ー『ーーーーーーー--司自---ーーーーーー『ー白幽ーーーーーーーーーーーーーーーー-2 8 . 統計処理ーーーーーーーーーーーーーー----ーーーーーーーーーーーーーーーーーー'ーーーーーーー-22. I I I . 実験結果ーーーーー司ーーーーーーーーーーー------------ーーー由ーーーーーーーーーー----2 3 1 . 用いたラットの血圧ーー・ーーーーーーーーー---司ーーーーーーーーーーーーーーーー----2 3 2 . 血圧と自発性筋緊張の関係司ー司ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-24 2 +濃度と自発性筋緊張の関係ーーーーーー司自ーーーーーーーーーーーーーー司 2 6 3 . 細胞外 Ca. 4 . 自発性筋緊張におよぼす n i f e d i p i n eの影響，田ーーーーーーーーーーー『ーーーーー-27 5 . 細胞内 Ca2+レベルと自発性筋緊張の関係『ーーーーーーーーーー---ーー『司田ー-28 I V . 考察-ーー田明ーーーー血・ーーーーーー明司ーーーーーー-ーーーーーーーーーーーーー園田ーーーー自由ーーー-29. V . 小括-ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー -32 第 3章高血圧自然発症ラット大動脈平滑筋における自発性筋緊張の. 3 内皮による調節ーーーーーーーー幽ー・ーーーーーーーーーーーーーーーーーーー"ーーー四ーー-ー----3 I.緒言ーーーーーーーーーー回目『ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー----33. I I . 実験方法ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー自由ー戸田ーー--34 1 . 実験動物ーーーー・ーーーーーーー---ーーーーー自由ーーーーーーーーーーー『ーーーーーーーーーー -34. 2 . 血圧測定四戸ー『司ー戸時ー『田周回ーーーーーーーーー四ーーーーーーーーーーーーーーー“ーーーーー -34 3 . 標本-ーーーーーー・ーーーーーーーーーーー"ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー--同 34 4 . 生理学的塩類溶液ーーーーーーー『ーー，ーーーー血ーーー--ー自由ーー』ー-ーーーーーーーー -34 5 . 張力測定ーーー『・ーーーーー四・ーーーーーーーーーー『司回目ーーーーーーーーーーーーー'ー周回目 -34. 6 . 試薬-ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー司ー-35 7 . 統計処理ーーーーーーーーーーー'ー---岨ーー戸田ーーーーーーーー鳴周司聞ー戸ー四団ーーーーー四戸 35. I II . 実験結果ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-36 1 . ラットの血圧ーーーーーーーーーーーーーーー『ーーーーーーーーーーーーー田ーーーー同ーー ----36. I I 由.

(5) 2 . 細胞外 Ca2+濃度上昇に伴う自発性筋緊張上昇に対する内皮. の抑制効果白幽ーーー四ーーーーー閉・--ーーーーーーーーーーー幽ーーーーーーーーーーーーーーー-36 3 . 内皮による自発性筋緊張調節における一酸化窒素の関与ーーーーーーーー-38 4 . 内皮による自発性筋緊張調節における内皮由来収縮因子. および過分極因子の関与ーーーーーーーー'ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-ーー-43 I V . 考察ーーーーーー『ーーー幽ーーーーーーーーーーーーーーー・ーーーーーー白血ー'ーーーー--ーーー ----44 V . 小括 --ーーーーーーーーー'ーーーーー由ー・ーー四ーーーーー'ーーーーーーー幽ーー同ーーーーーーーーー--47. 第 4章高血圧自然発症ラット頚動脈平滑筋における筋小胞体 Ca2+ポンプ. 阻害薬による収縮と細胞外 Ca2+-ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー司ーーーーーーーー-48 1 緒言ーーーーーーーーーーー岨・ー司ーーーーーーーーーー白色ーーー----ーーーーーーーーーーーーーー ----48. I I 実験方法国司------------------------ー司自由血田園田事時ー『ーー『ーーーー-49 E. 1 . 実験動物ーー叩--------ー--四四--ー------ーーーーー----ーーーーーーーーーー-49. 2 . 血圧測定ー目白個闇聞--ーーーー------------司噌噸ー----ーーーーーーーーーーーー-49. 3 . 標本-ーーーー・・ーーーーーーーーーーーーーーーーーーー・園田--四ーーーーーーーーーーーーーーー-49 4 . 生理学的塩類溶液. E. ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-49. 5 . 張力測定ーーー白白咽悶----司~-----ー回目白時価甲骨- ----ーーーーーーーー------49 6 . 細胞内 Ca2+レベル測定司ーー司曲由'個目咽--回ーー--ーーーーーーーーーーーーーーーー-50. 7 . 膜電位測定問司噂-------------司時噂ーーーー------------ーーーーーーー-50 8 . 試薬 -ーーーーーーーーーーーーーー--ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-51 9 統計処理 ----ーーーーーーーー・ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-51. I I I . 実験結果ーーー----町田ーー--ーーー幽ーーーーー・ーーーーーー司ーーーーー『ー---ーーーーーー四 51 1 ラットの体重と血圧ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー'ーーー-51. 2 筋小胞体 Ca2+ポンプ阻害薬による収縮ーーーーーーーーーーー曲目』ーーーーーーーー-51 2 2 3 . 筋小胞体 Ca +ポンプ姐害薬による収縮と細胞外 Ca+ -- ーーーーーーーーー-53 2 2 4 . 細胞内 Ca +レベルにおよぼす筋小胞体 Ca+ポンプ阻害薬の影響ーーー-5 5 2 2 5 . 筋小胞体 Ca +ポンフ阻害薬による細胞内 Ca+レベルの上昇. におよぼす細胞外 Ca2+除去および、 verapamilの影響ーーーーーーーーーーーーー-55 2 6 . 膜電位におよぼす筋小胞体 Ca +ポンフ阻害薬の影響ーーーーーーーーーーー-5 7. I V . 考察-ーーーーーーーーーーーー園周『ー-----ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー司ーーーーーーー-58. -I I I-.

(6) V. 小括ーーーー四ーーーーーーー戸司ーー ----幽ーーーーーー幽ーーーーーーーーーーーー-----ーーー叩ー-62 総括ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー司ーーーーー明ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー-64 引用文献ーーーーーー』ーーーーー"ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー------------ーーーーー-6 7 略語一覧ーーーーーーーーーーーーー・『ーーーーーー --ーー弔問ーーーーーーーーーー事ーーーー由ーーーーー』ーー幽ー--8 2. 謝辞. 国. IV 司.

(7) 論. 序. 高血圧自然発症ラット (SHR) は Okamoto& Aoki1) によって WistarKyotoラット (WKY) から開発された遺伝的に高血圧を発症する高血圧モデル動物である. SHR. を用いた研究は多岐に亘るが，特に血圧変化の影響を直接受ける心臓や血管に関する研究は非常に多い. 血管は内側から内皮，平滑筋，外膜の 3 層で構成されている.血圧の上昇，低下は血管平滑筋の収縮，弛緩によって調節されており，この収縮，弛緩の調節には交感神経，各種ホルモン，血管内皮から遊離される各種因子が寄与しているが， SHR ではこれら血管平滑筋緊張の調節因子すべてにおいて異常が報告されている. 2-1 0 ). 血管平滑筋の収縮，弛緩は主に細胞内 Ca2+濃度の増加，減少によって調節されている.細胞内 Ca2+の増加には細胞外からの Ca2+流入および、細胞内 Ca2+貯蔵部位(筋小胞体)からの Ca2+遊離が，その減少には細胞外への Ca2+汲み出しおよび筋小胞体への Ca2+取り込みが関与している山岡 SHRの血管平滑筋では様々な部位において細胞内 Ca2+調節機構の異常が数多く報告されており. 12- 2 0 ). 平滑筋調節に関与する各種. 因子の異常だけでなく平滑筋自体の異常かふ各種調節因子に対する血管平滑筋の反応性が異なっている可能性も考えられる. SHR大動脈平滑筋では静止時において正常血圧ラットの大動脈平滑筋ではみられ. ない自発性の収縮(自発性筋緊張)を示すことが報告されている. 21. 均.同様な報告. は SHRの頚動脈お)や大腿動脈 ηzη のような導管系の動脈平滑筋においてみられる. この自発性筋緊張は細胞外 Ca2+の除去で消失することから， SHR の動脈平滑筋では細胞外からの Ca2+流入が増加していると考えられている. 19，21. ー拘.この Ca2+流入増加. が SHR動脈平滑筋における様々な収縮薬，弛緩薬に対する反応性の異常に寄与していることを示唆する論文も多い. η26-2 8 ). これらのことから SHR動脈平滑筋におけ. ，あるいは細胞膜の興奮性の関係を検討することはる収縮反応と細胞内，外の cf SHR血管平滑筋の異常を研究する上で重要と考えられる.. 血管内皮は種々の因子を遊離して由管平滑筋の収縮を調節しているがの血管ではこれら因子の遊離にも異常があることが知られている. 32. 29-3 1 ). SHR. 均.その異常は. すべて内皮依存性弛緩の障害に結びっくものであり，内皮由来弛緩因子.

(8) ( e n d o t h e l i u m d e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r， EDRF) あるいは内皮由来過分極因子 ( e n d o t h e l i u m d e r i v e dh y p e r p o l a r i z i n gf a c t o r，EDHF) の遊離減少. 一明，内皮由来収. 8，36. e n d o t h e l i u m d e r i v e dc o n t r a c t i n gf a c t o r，EDCF) の遊離増加が報告されている縮因子 ( -42). 40. その結果， SHRの内皮正常血管では平滑筋収縮の増加あるいは収縮抑制の減少. がみられる明. 本研究では異なった血圧を示す各系統の高血圧自然発症ラットの血管，特に導管系血管である大動脈と頚動脈を用いて，これら血管平滑筋標本でみられる細胞外 Ca2+ に依存した自発性筋緊張，あるいは試薬による収縮反応克進の機序を，張力，細胞内 Ca2+レベル，細胞膜電位を測定することで検討した結果をまとめた.また，伸展の影響，内皮による調節についても検討を加え，これら高血圧ラットの血管平滑筋および血管内皮の異常について総合的に考察した.. -2 咽.

(9) 第 1章. 高血圧自然発症ラット大動脈を用いた収縮実験における至適初期伸展張力の検討. I.緒. Eヨ. 他の平滑筋と同様に血管平滑筋の収縮は実験初期に標本に与えられる壁伸展に影響を受けることが知られている叫を受けることが報告されている. 44-5 0 ). 作動物質に対する感受性もまた伸展の影響. 5 1，5 2 ). 高血圧動物の血管平滑筋は高い内腔圧にさらされており，そのため正常血圧動物と比べ受動的な壁伸展は大きい.この壁伸展の違いは作動物質による収縮や， SHR の大動脈平滑筋でみられる自発性筋緊張 21 羽に影響を与えると考えられる. 血管平滑筋の収縮反応は内皮によっても調節されているが展によって影響を受けることが報告されているは内皮依存性弛緩の障害が報告されている. 50，53. 29-3 1 ). 内皮の機能も伸. ザさらに高血圧動物の血管で. 32一明.. SHRと正常血圧の W i s t a rKyotoラット (WKY) では血圧が大きく異なり血管平. 滑筋や内皮における伸展の影響も異なっている可能性があるため. SHR と WKY の. 血管に対する収縮薬や弛緩薬の効果を比較する際，初期伸展張力の影響を考慮することが重要である.本章では脳卒中易発症性 SHR (SHRSP) と WKY の大動脈における非刺激下の張力(自発性筋緊張)と n o r a d r e n a l i n e (NA) あるいは高濃度 K+による収縮，および a c e t y l c h o l i n e (ACh) による内皮依存性弛緩に対する初期伸展張力の影響を比較検討し，これらラット大動脈標本を用いて実験する場合の至適伸展張力についても検討した.. II . 実験方法. 1.実験動物実験には 16週齢，雄性の WKYと SHRSPを用いた.これらラットは初め Dr .Okamoto. -3-.

(10) ，，拘から譲り受け，我々の動物飼育室で交配，飼育したものである.飼育は室温 22. 155. + 2 C，湿度 60% ， 1 2h rの明暗サイクルの条件下で行い，固形飼料 C F u n a b a s h iSP) 0. と水を自由摂取させた.. 2 .血圧測定すべてのラットは実験に用いる前に小動物非観血式白動血圧計(上田製作所， UR5 0 0 0 ) を用いて回i トc u f f法で血圧を測定した.測定に際し，ラットを 40o Cで 1 0分. 間加温した.この操作は安定した血圧を得るために必要であった.. 3 .標本ラットはエーテル麻酔下，頚動脈から脱血死させ，胸部大動脈を摘出した.胸部 o d i f i e dTyrode液中で結合組織および脂肪を除去し，幅 1m mの大動脈は冷却した m. 輪状標本とした. ACh による内皮依存性弛緩反応の観察には内皮正常標本を用いたが，この標本作製にあたっては内皮を傷害しないように最大の注意を払い，さらに実験結果から内皮を傷害したと思われるものは除外した.血管平滑筋に対する伸展の影響を検討した実験では内皮除去標本を用いたが，この標本は輪状標本の内腔を柔らかいゴムで擦過して作製した.内皮が完全に除去されているか否かは ACh による内皮依存性弛緩の消失によって確かめた.. 4 .生理学的塩類溶液実験には生理学的塩類溶液として m o d i f i e dT y r o d e液を使用した.その組成は以下の通りである (mM):NaCl，1 3 7 ;KCl， 5. 4 ;CaC12， 2 . 0 ;MgC12，1 .0 ;NaHC0 1 .9 ;NaH2PO 中 3 1 ヲ. 0. 4 ;g l u c o s e，5 . 6 ;e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e (EDTA) 0 . 0 2 6 ;O2959 丸 C0 混合ガス 25 % ヲ. を通気したときの 37 Cにおける pH7. 3 .H i g h K +Tyrode液は m o d i f i e dTyrode液の NaCl 0. をすべて KCl に置き換えることで作製した. K+濃度の異なる各種 K+Tyrode 液は m o d i f i e dTyrode液と High-K+Tyrode液を目的の K+濃度となるよう適当な比率で混ぜ. 合わせ作製した. Ca2+ f r e eTyrode液は m o d i f i e dTyrode液から CaC12 を除くことで作製した.. -4 司.

(11) 5 .張力測定幅 1m mの輪状標本の内腔に 30μmのタングステンワイヤーを 2本通し，一方を o d i f i e dTyrode液を満たした内容積約 1 0mlの液槽にアクリル製の標本棒に固定し， m. 移した.この液槽は二重ガラス構造になっており，恒温槽 (THERMOMATEBF-41， BATEBZ-41; ヤマト科学)で 37o C に温めた温湯を液槽の外層に循環することで一. 定温度の実験条件を保った.輪状標本の内腔に通したタングステンワイヤーの他方は張力トランスジューサー (UL-2GR;MINEBEA) に固定し，その張力変化を等尺性に測定した.張力トランスジューサーからの信号は血圧用アンフ (BIOPHYSIOGRAPH 1 8 0 4 ; 三栄測器)を通し，熱ペン書きオシログラフ (RECTI-HORIZ-8K-22-1-H; 三 4-50mN， 1mN=98mg) は自栄測器)に記録した細種々の強さの初期伸展張力 ( 2 + f r e eTyrode液中でかけた. Ca2 ←freeTyrode液中発性筋緊張の発生を抑えるため Ca. 0minインキュベートした後， n o r m a lm o d i f i e dTyrode液に交換し， 1h r標本を平で1. 衡にさせてから K50Tyrode液で 2回収縮させた.この手順は安定した結果を得るた r e eTyrode液に 2 . 0m MCa2+ を添加したときめに必要であった‘自発性筋緊張は Ca2+f 四. にみられる収縮として測定し，その発生張力は実際の収縮力 (mN) で表した. 4 e r a p a m i l( 1 0 -5 M) と p a p a v e r i n e( 10 M) を添加して標本を完全に実験の最後に v. 弛緩させ，すべての張力変化はこのレベルを 0 として測定した. a. なお，この弛緩し. たレベルは細胞外 Ca2+除去下で弛緩したレベルと一致していた司. 6 .試薬 o r a d r e n a l i n eb i t a r t r a t e(Sigma， St .L o u i s， M O，実験に用いた試薬は以下の通りである.N USA)，a c e t y l c h o l i n eh y d r o c h l o r i d e(ACh，S i g m a ) sodiumn i t r o p r u s s i d e(SNP ，Sigma) NG_ ヲ. ヲ. n i t r o L a r g i n i n e (L-NNA，S i g m a )，i n d o m e t h a c i n (和光，大阪)， v e r a p a m i lh y d r o c h lOlide. (エーザイ，東京)， p a p a v e r i n eh y d r o c h l o r i d e( S i g m a )， c a l c i u md i s o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e(EDTA，和光)•. 7 .統計処理 ts . e . m e a nで表した.有意差検定は S t u d e n t 'st 検定を用いて行得られた値は means:. . 0 5未満を有意差有りとした. い， P値が 0. -5-.

(12) III . 実験結果. 1.ラットの体重と血圧実験に用いた 1 6週齢のラットの収縮期血圧は SHRSPで 241: t1 .6mmHg( n= 5 2 )， WKYで 1 3 1: t0 . 9mmHg ( n= 5 7 ) であり，前者において有意に高い値であった (p< 0 . 0 01 ).これらラットの体重は SHRSP，WKYでそれぞれ 249: t3 . 0g ( n= 5 2 )，330: t 3 . 6g (n=5 7 ) であり，前者において有意に小であった ( pく 0.000.. 2 . 自発性筋緊張におよぽす初期伸展張力の影響平滑筋の収縮反応は内皮に強く影響を受けることから，本実験には平滑筋の反応のみを測定するため内皮を除去した標本を用いた. SHRSP 大動脈内皮除去標本は Ca2+f r e eTyrode液中で初期伸展張力をかけた後， 2m MCa2+を添加すると自発性の収. 縮反応(自発性筋緊張， a c t i v et o n e ) を示した ( F i g . 1).この自発性筋緊張は初期伸展張力が 4mNの場合においても観察され，また伸展張力の増加に伴い急激に増加し F i g .2 ) . 一方， WKY標本では自発性筋緊張が弱く，初期伸展張力lOmN以下でた (. ほとんど張力発生はみられなかった.初期伸展張力が 20m Nを越えると自発性筋緊張が観察されるようになり，この発生張力は SHRSP標本同様，伸展張力増加に伴い増大した ( F i g .2 ) . WKY，SHRSP標本で比較すると自発性筋緊張はどの初期伸展張力下においても SHRSP標本で有意に高い値を示した ( Pく 0 . 0 5 ).. t. C: a 勺r e e 2mMC a ' .. t K 5 0. ~w. Figure1 Th ea c t i v et o n e組 dK50-indu c e dc o n t r a c t i o ni nt h ee n d o t h e l ilUlld e n u d e da o r t i cp r e p 訂 a t lO n o f SHRSP. Th ea c t i v et o n e was measureda s at e n s i o n出 a td e v e l o p e di nr e s p o n s et o 血er e f r e e， 2m MCa2+， K50andW i n d i c a t eCa2¥f r e eT y r o d e ' ss o l u t i o n ， a d m i n i s t r a t i o no f2 . 0m MCa2+. Ca2+2 r e a d m i n i s t r a t i o no f2 . 0m MCa+，T y r o d e ' ss o l u t i o nc o n t a i n i n g50n品1 K andwasho u tw i t hnonn a 1 T y r o d e ' ss o l u t i o n，r e s p e c t i v e l y . 十. -6-.

(13) o WKY • SHRSP. 自唱. 芝 E. 5. ~. *. B. 4. 〈ち. 2. 0". 4. 1 0. 20. 30. 40. 50. P a s s i v eforce(mN). Figure2 R e l a t i o n s h i p betweenp a s s i v ef o r c e and aιhve t o n e III 血ee n d o t h e l i m n d e n u d e da o r t i c r er e p r e s e n t e da s 血e mean : t : s . e . m e岨 o f8 1 1 p r e p a r a t i o n s from WKY 姐 d SHRSP. Data a 1 3p r e p a r a t i o n sfromSHRSP. A s t e r i s k si n d i c a t es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s p r e p a r a t i o n sfromWKY組 d9 comparedw i t hr e s u l t sfromWKYa o r t a e( P<0 . 0 5 ) .. 3 Noradrenaline収縮におよぽす初期伸展張力の影響固. F i g . 3は WKYおよび SHRSPの大動脈内皮除去標本における NAの濃度. 作用曲. 線を示している. WKY標本では NA による最大収縮が，初期伸展張力 30mNおよ. び 50m Nのとき 1 0 -6 M でみられ， 8mNのとき 3X 1 0 -6 M でみられた. SHRSP標本 0 -6M でみられた園 pD2 では最大収縮はすべての初期伸展張力下において NA濃度 3X 1. 値でみた NA に対する感受性は WKY 標本では初期伸展張力の増加によりわず、かに上昇したが， SHRSP標本では伸展張力に影響を受けなかった C T a b l e1 ) . 初期伸展張力と NA収縮の最大発生張力との関係を Fig.4に示した.自発性筋緊張を加えて測定した場合では， NAによる最大収縮は WKY，SHRSP標本においてそれ 6: t0. 36 ぞれ伸展張力 30mNと 40mNでみられ，このときの収縮力は羽茂Y 標本で1O.. mN，SHRSP標本で 1 1 . 6: t0 . 3 8mNであり有意な差はなかった C F i g .4 a ) . さらに伸. 展張力を増加させるとどちらの標本においても収縮力が低下する傾向がみられた. 自発性筋緊張を差し引いて測定した場合， NAによる最大収縮は WKY，SHRSP標本においてそれぞ、れ伸展張力 20mNと 30mNで観察されたが，この場合ではどの伸展張力下においても最大収縮は WKY標本に比べ SHRSP標本において有意に減弱して F i g .4 b ) . いた C. -7-.

(14) a. b. WKYtone( + ). 1 2. 1 2. 1 0. 1 0. z E 8. z E 8. L U O 由 L. 6 O A L B. 』. 4. ， . . -~ A 2J .. OJ. WKYt o n e( ー ). 9. c. Aノ. • 8mN( n=1 1 ) o30mN( n=1 0 ) 畠5 0mN( n=9). •. .. マー『~. 1 0. 6. 8. 7. 6. 5. O. 4. 1-'. 9. d. SHRSPt o n e( + ) 12~. 1 0. .8mN(n=11) o30mN( n=1 0 ) A5 0mN( n=9). 8. 7. 4. • . 8mN( n=1 3 ) O30m N ( ( n = 9 9 ) ) A50mN( n=. 1 1 1. 1 0. 5. SHRSPtone( ー ) 121. 望 .. 6. z E B. E B. t o L 8 6 4 2J _ _ _ _. ι 0 由 4 3 6 L. /ぐご. 」. 4. O ・5 四 0m m N N ( ( n n 9 = 9 ) } = :. 2. O. OJ 1 0. 9. 日. 6. 7. 5. 4. 1 0. 9. 8. 7. 6. 5. 4. I o g[ N A ]. l o g [ N A ]. a 1 ine (N A)-induced ω n 位協 uon i n t h e Figure3 Concentration-responsc curycs f o r noradien 皿denudeda o r t i cp r e p a r a t i o n sfrom¥ ¥ まY ( a，b )阻 dSHRSP( c，d)underv a r i o u sl e v e l sof endotheliu c :Activet o n ei sincluded( t o n e( 十 ) ) . b， d Aιtivetonei sexcluded passiveforce(8，30，50mN). a，ー ) ) . Th epassivef o r c ei snotincludedi nt h ef i g u r e . Datar e p r e s e n tt h emean: ts.e.meanof9-13 ( t o n e( 目. p r e p a r a t i o n s .. Table1. CalculatedpD 1 uesi nr a ta o r t a e . 2va 4. P a s s i v ef o r c e(mN) 2 0. 8. 30. 5 0. No r a d r e n a l i n e WKY. 8 .0 08士 0 . 0 4 4. 7 . 9 0 5士 O075. 8 . 2 2 9土 0 . 0 7 0. . 1 6 2 料 8 . 5 0 3士 0. 8. 4 6 2士 0 . 0 8 9料. SHRSP. 8 . 2 0 6土 0 . 0 9 3. 8 .0 5 9: ! :0 . 0 6 7. 8 .0 0 8 : : ! : :0 . 0 7 1. 7 . 8 5 8土 0 . 0 7 1. 8 . 0 0 0 : : ! : :0 . 0 7 5. A c e t y l c h o l i n e WKY. 7. 35 9土 O1 7 6. 6 . 5 9 1土 0 . 0 6 2. 5 . 6 1 3: ! :01 1 8 *. . 1 3 3料 5 . 4 9 3土 0. 5. 4 37土 0 . 1 1 6料. 7 . 4 9 9: ! :0 . 1 7 8. 7 . 0 9 2土 0 . 1 1 6. 6 . 3 2 4土 0 . 1 9 1料. 6 . 0 5 0土 0 . 1 2 9料. 5 . 9 0 6土 0. 12 6 帥. A c e t y l c h o l i n e+I n d o m e t h a c i n e . 1 4 5 WKY 7 . 0 3 8士 0. SHRSP. SHRSP Sodiumn i t r o p r u s s i d e WKY SHRSP. 目. 目. 司. 6. 41 8土 0 . 1 7 1. 6 . 0 8 6 : : ! : :0 . 2 5 1. 5 . 4 0 1土 0 . 1 2 8 * *. 5 . 4 3 5土 0. 12 8判. 7 . 1 0 2 : : ! : :0 . 1 2 7. 6 . 9 0 8 : : ! : :0 . 2 1 4. 6 . 0 0 2 : : ! : :0 . 1 2 7帥. 5 . 5 0 9: : ! : :0 . 1 3 6料. 5 . 3 7 3: : ! : :0 . 1 2 6料. . 1 2 2 8 . 5 0 6土 0. 8 . 2 0 1土 0 . 0 8 8. 7 . 8 5 0: : ! : :0 . 0 8 2. 7 .田 1士 0 . 1 2 6. 7 . 6 9 9 : : ! : :0 . 1 2 4 *. 8 . 3 6 7 : : ! : :0 . 0 5 6. . 0 1 9 8 . 2 4 7土 0. 81 0 4土 0 . 0 4 4. 8 . 0 1 9土 0 . 0 3デ. 8 . 1 3 6: ! :0 . 0 6 2. 目. ts .e.me祖 of8-15p r e p a r a t i o n s . * S i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tf r o 四 v a 1 uesa t8mN( * :Pく 0.05， Resultsa r ethemean: * * :P<0 . 0 1 ) .. -8-.

(15) a. b. t o n e(+). t o n e( ー ). 14. 14. 1 2. 1 2. 1 0. 10. E )8. 王8. b. U 巳 G 」 2 2. " ' ~. 6. D. ・. 4. SHRSP. O. ------.. 4. 20. 10. 30. 4 0. 羽信. 4. oWKY. 2. 6. l . L. OWKY. • SHRSP. 2. 。. 5 0. 4. 1 0. 20. 40. 30. 50. P a s s i v ef o r c e(mN). P a s s i v ef o r c e(mN). Figure4 R e l a t i o n s b i pbetween血ep a s s i v ef o r c eandt h emaximumt e n s i o ni n d u c e dbyn o r a d r e n a 1 i n e Th ec o n c e n t r a t i o no fn o r a d r e n a 1 ined i f f e r e da td i f f e r e n tp a s s i v ef o r c e sa sshowni nF ig .3 . a :A c t i v e t o n ei si n c 1 uded( t o n e( + ) ) . b :A c t i v et o n ei se x c 1 uded( t o n e( ー ) ) . Dataa r et h emean土 s . e . m e a no f8 伊i f i c 姐 t d i f f e r e n c e scomparedwi 也 WKYd a t a(Pく 0 . 0 1 ) 1 3p r e p a r a t i o n s . A s t e r i s k si n d i c a t es i. 4 . 高 K+収縮におよぽす初期伸展張力の影響. F i g .5 ) WKY，ラット大動脈標本は細胞外 K+濃度に依存した収縮反応を示した C 圃. SHRSP両標本ともにどの伸展張力下においても最大収縮は K+60m Mから 70mMで. みられた.自発性筋緊張を差し引き. K+による発生張力だけを測定したグラブから. 0m Mから 1 5m Mの間にあり， WKY，SHRSP標本間，得られた ED50はすべて K+ 1. あるいは初期伸展張力問で差はみられなかった C F i g s .5band5d). 初期伸展張力と K+収縮の最大発生張力の関係を F i g . 6 に示した.自発性筋緊張を加えて測定した場合. K+による最大収縮は WKY，SHRSP標本においてそれぞれ伸. 展張力 30m Nおよび 40mNでみられ，このときの最大収縮力は SHRSP標本におい a ) . 自発性筋緊張を差し引いた場合て有意に増大していた C F i g .6. K+による最大収. 縮はどちらの標本も伸展張力 30mNで観察されたが，この場合ではどの伸展張力下 F i g .6 b ) . においても SHRSP標本の最大収縮は WKY標本に比べ有意に減弱していた C. -9-.

(16) a. b. WKYt o n e( + ). 1 4 1 2. 1 2. 1 0. 1 0. 8. z. 6. gB. (. 至. B. ). Q). ~. o. 由. LL. LL. .8mN(n=10) 030mN( n=1 0 ) .50mN(内=1 0 ). 4 2. o. WKYt o n e( ・ ). 1 4. 5. 41 01 52 02 53 0. 4 0. 5 0. 6 0. 4. • 8mN( n' "1 0 ) 030mN( n" '1 0 ) 企 5 0mN(内'" 1 0 ). 2 O. 7 0. . 41 01 52 02 53 0 5. d. SHRSPt o n e(+). 1 4. 12. 10. 1 0. 86 b. L f .. •. • 8mN(円 =1 2 ) 030mN(n=11) • 5 0mN( n=1 0 ). : i グ安行?1. E8. 8mN(n=12). o3 0mN( n=1 1 ). 2. O. 7 0. SHRSPtone( ). 1 4. 12. 4. 6 0. [ K + ](mM). [ K + j(mM). c. 5 0. 40. A. 41 01 52 02 53 0 5.. 40. 5 0mN( n=1 0 ). 5 0. 6 0. 7 0. 5 . 41 01 52 02 53 0. [ K + l(mM). 40. 5 0. 6 0. 7 0. [ K + ](mM). Figure5 C o n c e n t r a t i o n r e s p o n s ec u r v e sf o rh i g hK+ーi n d u c e dc o n t r a c t i o ni n血eendothelium-denuded a o r t i cprep 紅白o nsfrom¥¥軍Y ( a，b )岨 dSHRSP( c，d )underv a r i o u sl e v e l so fp a s s i v ef o r c e( 8，30，50 mN). Datar e p r e s e n tt h emean: ts . e . m e 姐 o f1 0 1 2p r e p a r a t i o n s . Otherpo 血t sa r esamea st h o s ei n F i g . 3 .. a. b. t o n e(+) 1 4. 割 .. 1 2. 1 2. 1 0. z ε8. 1 0. z E 8 L 巳ロ由』 L 2. t o n e( ー ) 1 4. b. 6. 比由 (J. 4. o WKY • SHRSP. 2. 。. 4. 1 0. 2 0 3 0 P a s s i v ef o r c e( m N ). 4 0. 自. *. 4. oWKY • SHRSP. 2 O Jー甲『. 4. 5 0. 1 0. T. 2 0 3 0 P a s s i v el o r c e( m N ). 4 0. 5 0. 1a t i o n s h i p betweent h ep a s s i v ef o r c e andt h emaximum t e n s i o ninduced by h i g hK + . Figure6 Re ts . e . m e a no f10-12p r e p a r a t i o n s . Otherp o i n t sa r esamea st h o s ei nF ig .4 . Dataa r et h emean:. ー1 0 -.

(17) 5 .Acetylcholineによる内皮依存性弛緩におよぼす初期伸展張力の影響 NA ( 5x 1 0 -7 M) で前収縮させた WKYあるいは SHRSPの内皮正常標本は AChに. 対して濃度依存性の弛緩反応を示した.この弛緩は内皮依存性で，内皮を除去することでみられなくなった.また， WKY と SHRSPの標本で比較すると後者においてこの弛緩は減弱していた. 日g . 7 には異なった初期伸展張力下での ACh濃度一作用曲線を示す.この曲線は. 初期伸展張力の影響を受け， WKY，SHRSP標本ともに伸展張力の増加に伴い弛緩は減弱し，最大弛緩をもたらす ACh濃度も高濃度側に移動した.. SHRSP. WKY. 。. O. 20. 20. ポ 40. ポ 40. 道国 E60. T 道 D 百 Z 60. = =. z e 80. 80. A 仏T. phJM. 。。. 守. Bm. ﹃. EAH. 胆]. 圏内. 回[. Eg. ' マ，， ↓. a u. 宇. . . . . 10. F n匂. 100~. E qJ. n 1 7 ) • 8mN( 030mN(n=14) 企 50mN( n 9 ). 100・「 10. • 8mN(n=16) 030mN(n=10) 血 50mN( n 1 2 ). =. 9. 8. 7. 6. 5 4 3. u. I o g[ A C h ]. Figure7 C o n c e n t r a t i o n r e s p o n s e ι u r v e s f o r a c e t y 1 c h o l i n e ( A C h ) i n d u c e d r e l a x a t i o n i n t h e 血e l ilUlli n t a c tp r e p a r a t i o n sfromWKY( a )阻 dSHRSP( b )underv a r i o u sp a s s i v ef o r c e( 8，30，50 endo 7 mN). The p r e p 紅 a t i o n s were p r e c o n t r a c t e dby 5 X 1 0 M n o r a d r e n a 1 ine and t h er e l a x a t i o n was h emean: ts . e . m e a no f与 1 7p r e p a r a t i o n s e x p r e s s e da sp e r c e n t a g eo ft h i sc o n t r a ι t i o n . D a t a訂 et. F i g . 8 は初期伸展張力と ACh濃度一作用曲線における最大弛緩の関係を示したも. のである.両標本ともに初期伸展張力が 8mNのときに最大の弛緩がみられ，その値 .1: 1 :1 .70 ，も SHRSP標本で 6 5 . 0: 1 :2 . 1 %であり，後者は WKY標本で NA前収縮の 88. . 0 01 ).弛緩は初期伸展張力の増加とともに減弱において有意に減弱していた (pく 0. したが，これは WKY標本において著明で，伸展張力 20m N以上では両標本間の差はみられなくなった. pD2値の変化として示した ACh に対する感受性は WKY，SHRSP標本ともに伸展. 司. 1 1 -.

(18) 張力の増加によって著明に低下したが C T a b l e1)，その影響は SHRSP標本に比べ WKY 標本において顕著に観察された.. 40 50. 2 E I場レ. c. 60. o. E 7 0 石庄. ・. 80. oWKY SHRSP. 90 100 4. 10. 20. 30. 40. 50. P a s s i v ef o r c e(mN) Figure8 R e l a t i o n s h i p between t h ep a s s i v ef o r c e and 也e maximum r e l a x a t i o ni n d u c e d by a c e t y 1 c h o l i n e . Data a r et h emean: ts . e . m e a no f8 1 7p r e p a r a t i o n s . A s t e r i s k si n d i c a t es i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e scomparedw i t hva 1 u e sfromWKYp r e p a r a t i o n su n d e rc o r r e s p o n d i n gc o n d i t i o n so fp a s s i v e f o r c e(Pく 0 . 0 5 ) 目. 6 .Sodiumnitroprussideによる弛緩におよぽす初期伸展張力の影響 Sodiumn i t r o p r u s s i d eCSNP)による弛緩反応は内皮除去標本を用いて検討した.WKY， SHRSP標本とも SNPに対して濃度依存性の弛緩反応を示したが，その弛緩，特に最. 大弛緩は WKY，SHRSP標本間において差がなかった C F ig .9 ) . SNP に対する感受 T a b l e 1)，その最大弛緩は初期仲展張力の影性は伸展張力の増加に従い低下したが C F i g .9 ) . また，この感受性低下は ACh感受性の伸展張響をほとんど受けなかった C. 力増加による低下に比べわずかなものであった.. 四. 1 2 -.

(19) 40. ロa. 剖. 附 ⋮m. 0. w ・. a. )EO 一電話一世庄. ・・噌. ( ポ. 円U u 内 n u n u Rdnロヲ，。ロ. 90 100 4. 10. 20. 30. 40. 50. P a s s i v ef o r c e(mN) F i g u r e9 Themaximumr e l 日 a t i o ni n d u 印 db ys o d i u mn i t r o p r u s s i d ei nt h ee n d o t h e l i u m d e n u d e d n dSHRSPa tv a r i o u sl e v e l so fp a s s i v ef o r c e . Thema X I 1 l l umr e l a x a t i o n sw e r e p r e p a r a t i o n sf r o mWKYa o b t a i n e df r o mc o n c e n t r a t i o n r e s p o n s ee x p e r i m e n t sa tc o r r e s p o n d i n gl e v e l so fp a s s i v ef o r c e. 7. 各伸展張力下における acetylcholine 内皮依存性弛緩に対する NG-nitroL-arginineおよび indomethacinの効果. 本実験で検討したすべての伸展張力下において， ACh による内皮依存性弛緩反応は1 0 -4 M NG-nitro-L-arginine (L-NNA) によって完全に抑制された ( F i g .1 0 ) . SHRSP 標本では L-NNA存在下で ACh高濃度により若干収縮してくる傾向がみられた C F i g . 1 0 ).. 一方， indomethacin は本実験で検討したすべての初期伸展張力において， W K Y， SHRSP いずれの標本でも ACh による最大弛緩を増大させた ( F i g . 1 1 ). 圃. この. indomethacin の効果は SHRSP標本において顕著に観察され，そのため indomethacin. 存在下では両標本間の ACh最大弛緩の差は indomethacin非存在下の場合と比べ減少した ( F i g s .8and1 2 ).. 1 3 -.

(20) a. 3 0mNWKY. b. 8mNWKY. * " '. z 2 22 z. 。. キ* ~ 司~-事畠申_..~. o 2 0. 2 0. c : 40. ポ c : 40. 、，. 量、. 0. 0. i 百. 百. 60. 360 江. oC o n t r o l. oC o n t r o l ・レ NNA. 8 0. 1 0 0A. .. 100~. 9. 8. ・し NNA. 8 0. 7. 6. 5. 4. 3. 9. 8. 7. l o g[ A C h ]. c. 6 司. ・. d. 8mNSH円SP. 5. 4. 3. l o g[ A C h ]. 3 0mNSHRSP. O. O. 2 0. 2 0 H 爪 c :. A守白. nunu. 8 冊. ・. 1 0 0 .. 1 0 0 8. 7. oC o n t r o l L-NNA. 8 0. ー守. 9. ・. Q). 広. oC o n t r o l L-NNA. 8 0. 4 0. 歪 60. U. (4CC 口一苛選志庄. a. 6. 5. 4. 3. I o g[ A C h ]. 9 8 7 6 5 4 3 I o g[ A C h ]. Figure10 E f f e c tof~-ni仕o-L-arginine ( 10-4 M ，L-NNA)onACh-inducedr e l a x a t i o ni ut h ea o r t i c 宝 Y( a，b)阻 dSHRSP( c，d )underp a s s i v ef o r c e sof8m N( a，c )阻 d30m N(b，d ) . p r e p a r a t i o n sfrom" A s t e r i s k si u d i c a t es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sfromva 1 u e so fC o n t r o l( *Pく 0.05，* *Pく 0 . 0 1 ) . Otherpoiut~雪訂 es a 皿 ea st h o s ei uF i g .7 .. a. 4 0. 5 0 ー求. SHRSP. b. WKY. 4 0. I. oC o n t r o l • I n d o. 6 0. g 0 57. )目。 (. 5 0 6 0. 言喜切. 1<1. z 》 8 @ 0 9 0 1 0 0. XゃJ-42 口￨ oC o n t r • I n d o. 9 0. .. 4. 1 0. 40 3 0 2 0 P a s s i v ef o r c e( m N ). 1 0 0. 5 0. 4. 1 0. 3 0 4 0 2 0 P a s s i v ef o r c e( m N ). 5 0. n d o )ont h emaximu 皿 r e l a x a t i o nindu 印 db yAChi nt h e Figure1 1 E f f e c tofindomethacin( 1 05M ，I 紅 a t i o n sfromWKY( a )組 dSHRSP( b )underv a r i o u sp a s s i v ef o r c e s . Otherp o i n t sa r es 創出 a o r t i cprep a st h o s ei nF i g .1 0 .. 1 4 -.

(21) 40. ・. 50. OWKY SHRSP. 、 60. ν 三員. g70 EO 二. E G 3. 80 90 100~. 4. 10. 20. 40. 30. 50. P a s s i v ef o r c e(mN) Figure12 Th emaximmnr e l a x a t i o ni n d u c e dbyAChi nt h ep r e s e n c eo fi n d o m e t h a c i n( 1 05M)i n仕l e n d e rv a r i o u sp a s s i v ef o r c e s . O t h e rp o i n t sa r e samea s a o r t i cp r e p a r a t i o n sfromWKY組 dSHRSPu ig .4 . t h o s ei nF. IV. 考察. 張力実験において，血管標本に与える初期伸展張力が平滑筋および内皮の機能を変化させること，また血管収縮薬や拡張薬に対する反応性に大きな影響を及ぼすことはよく知られている以訊 28，4oーザ平滑筋原性の自発性筋緊張(第 2章，第 3章で詳細に述べる)もまた血管の反応性に著明に影響を与えることが知られている.収縮反応に対する伸展張力の影響は一般に標本長. 収縮力関係で検討されるが，本研. 究では輪状標本を使用したため標本長の測定は困難であった.したがって，本実験では初期伸展張力として，平滑筋機能と内皮機能に対する伸展の影響を検討した. なお， La p l u c eの式で計算すると，本実験で負荷した初期張力 ( 4-50mN) は WKY の大動脈で内圧 20-250mmHg，SHRSP大動脈で 1 7-215mmHgに相当し，この範囲内には両ラットの平均血圧が入っていた. 高血圧ラット血管平滑筋の作動物質に対する感受性は正常血圧動物とは異なっていることが報告されているが 43， 57-5 9 ) その結果は一致していない生張力を比較した研究においても一致しない報告が多い. ，. 52 61). ，，，. 58 59 61 6 2 ). NA収縮の発. 著者らは以前，. SHRSPの大動脈における NA収縮は WKY標本に比べ等しい，あるいは減少してい. ることを報告している. ，. 30 3 1 ). この収縮力の減少は NA を作用させる時点ですでに白. 1 5 -.

(22) 発性筋緊張が存在していることがその理由の 1っと考えられる. 一民的.. 22. 本研究において， SHRSP の大動脈内皮除去標本ではすべての伸展張力下で自発性筋緊張がみられ，これは伸展張力の増加に従い増大することが示された.この白発性筋緊張は細胞外 Ca2+ の除去や Ca2+ 阻害薬によつて消失することが報告されていることから叫叫ベ，電位依存性 Ca2+ チヤネルを介して流入した Ca と結論づけることができる.著者らはラット大動脈平滑筋を用いた実験において， 2 2 Ca + f r e eTyrode液に EGTA を加えると細胞内 Ca +レベルはさらに低下するが，張力. はそれ以上低下することがないことを確認している.また細胞外 Ca2+を除去したときの張力と， verapamil と papaverineで完全に弛緩させたときの張力が等しいことも確認していることから，細胞外 Ca2+ 除去下あるいは Ca2+ 阻害薬存在下で大動脈標本は完全に弛緩したレベルにあると考えられる.したがって， SHRSP標本においてみ依存性で，細胞外 Ca2+ 非依存性られた自発性の収縮(筋緊張)はすべて細胞外 Ca2+ の要素は関与していないと結論される. 高血圧ラットの平滑筋では非刺激条件下において細胞内 Ca2+レベルが上昇していることが報告されている. ，的.また血管平滑筋標本に対する伸展は細胞内 Ca2+上昇. 65. を引き起こすことも報告されている 67)このことに関し， SHR の血管平滑筋では膜電位が浅くなっている(脱分極)との報告もある. 6 8 ). これらのことから， SHRSP の. 大動脈平滑筋では非刺激時においても電位依存性 Ca2+チャネルの開口充進があり，細胞内 Ca2+濃度の上昇から自発性収縮が発生していると考えられる.また，血管平滑筋は伸展によって脱分極してくることが知られているが， WKY と SHR の血管で比較するとこの伸展の効果は後者で有意に大きくなっていることが報告されている倒.このことも SHRSP大動脈の自発性収縮(緊張)に対する伸展効果の増強を説明できる.つまり， SHRSP大動脈平滑筋では伸展によって強い脱分極が起こり，電位依存性 Ca2+チャネルの開口が冗進されていて，自発性収縮の増大となっていると考えられる.さらに，これらの異常は後述する SHRSP大動脈における種々の異常にも関与する可能性がある， NA収縮は伸展張力の増加に従い増大した.この結果は標本長一収縮力関係で伸展. の影響を検討した報告. ，，，と一致する. WKY標本でみられた伸展張力増加に. 45-485 1 707 1 ). よる NA感受性の増加は Coskinas&P r i c e52) によって報告された結果と一致するが，. 1 6 -.

(23) SHRSPの大動脈標本では自発性筋緊張を除いた NA収縮のみの収縮は初期伸展張力によって著明に影響されることはなかった.これは， S HRSP標本では高い初期伸展張力によって強い自発性収縮が発生したため， NAによる収縮に見かけ上の抑制的影響を与えることによると考えられる.. NA収縮における pD2値は伸展とともに増加したことから，伸展は平滑筋の NA感受性を増加するさせることが示された.伸展および NA はどちらも血管平滑筋を脱分極させることが報告されている臥均.本研究においてみられた伸展による NA感受性の増加も伸展による脱分極が関与している可能性が考えられる.しかし，本実験では WKY，S HRSP両標本で比較した場合， pD 2に対する仲展の効果は WKY標本において著明にみられたが. H a r d e re ta l .69) は伸展による脱分極は SHRの血管にお. いて著明であったことを示しており. p. これと矛盾する.本実験の pD 2 は自発性筋緊. 張を差し引いた NA収縮から求めた値であることから，自発性筋緊張が与える NA 収縮に対する見かけ上の抑制的影響を考慮していないことがこの矛盾の原因になっているかもしれない.. a2+チャネルが聞いて流入する高 K+による収縮は膜の脱分極によって電位依存性 C 2 C a +によるもので，この脱分極は膜の薬物受容体とは関係がないと考えられる縄本実. 験では高 K+による収縮も伸展の影響を受け. 9. その様式が NA収縮の場合と類似して. いるという結果が得られた.このことは，受容体感受性ばかりでなく，筋の収縮性も伸展の影響を受け，その影響は受容体を介する収縮の場合と類似することを意味する. NAによる収縮には膜の脱分極による部分があることが知られており. 72). この. 収縮も高 K+による収縮と同様の伸展による影響を受ける可能性がある.この電位依 2 存性 C a +チャネルに対する伸展の影響は，自発性筋緊張の場合とも共通するところ. である.このように， NA収縮に対する初期伸展の影響には受容体感受性の変化の他 2 に，電位依存性 C a +チャネルの変化，筋の収縮性そのものの変化などが関与してい. るものと考えられる.いずれにしても，ラット大動脈標本の最大収縮は初期伸展張力 20-30m Nでみられることが明らかとなった.. AChは内皮依存性の弛緩をもたらし，この弛緩は SHRSP標本で障害されていたが， N O ) や EDHFの遊離減少 8，時刻， 2 ) 同様の報告は他にもなされており， 1 ) EDRF ( 4 1 ) で説明されている.本実験では A Chによる内皮依存性弛緩 EDCFの遊離増加 35，38，. 回. 1 7 -.

(24) が初期伸展張力の影響を受け，伸展張力の増加とともに減弱してくることが示された.このことも，上記の三つの可能性で説明することができる.前者の可能性について，イヌの頚動脈を用いた実験で伸展によって EDRF (NO) 遊離が減少することが報告されている定した報告. 7 4 ). 7 3 ). モルモット冠動脈を用いた AChによる内皮依存性過分極を測. では，伸展によって NO遊離が減少するという結果は得られていない. が，仲展によって膜が脱分極するとともに， NOによって生じる過分極が増加することを示していることから， NO遊離が減少しても過分極電位は変わってこない可能性が考えられる.さらにラット大動脈の内皮依存性弛緩は L-NNAによって完全に消失したことも，伸展による弛緩の減弱が NO遊離の減少による可能性を示す.なお， SNP による弛緩反応は著明な伸展の影響を受けなかったことから，平滑筋の NO に対する感受性，あるいは平滑筋におけるサイクリック GMP産生機能は伸展によって大きな影響を受けないものと考えられる明. 仲展による EDCF遊離増加の可能性についても他の血管においていくかの報告が 7 3 ) ラット大動脈を用いた本実験においても， WKY，SHRSP両標本ともにあるお， 54，. n d o m e t h a c i n存在下で小さくなった. EDCF 伸展による内皮依存性弛緩反応の減弱が i. が i n d o m e t h a c i n で阻害されるアラキドン酸代謝産物であることが知られており，本結果は弛緩減弱に EDCF の遊離増加が関与している可能性を示すものである. I n d o m e t h a c i nの影響は SHRSP標本で顕著にみられ， i n d o m e t h a c i n存在下では WKY， SHRSP標本間での内皮依存性弛緩およびこの弛緩に対する伸展の影響に差がみられ. なくなったことも. この可能性を強く示唆するものである.. 伸展張力増加によって平滑筋の収縮活性が増加することが報告されており吹その結果として内皮依存性弛緩が減弱した可能性が考えられるが， NA収縮に対する伸展の影響は ACh の内皮依存性弛緩に比べ小さかったことからこの可能性は低いと思われる.したがって，伸展による内皮依存性弛緩の減弱には収縮反応の変化はほとんど関与しておらず， EDRF (NO) 遊離減少および EDCF遊離増加が寄与していると考えられる. 以上，本実験では WKY と SHRSPの大動脈平滑筋の自発性収縮(筋緊張)，高 K+ あるいは NAによる収縮および AChによる内皮依存性弛緩に対する初期伸展張力の影響について検討した.自発性筋緊張は初期伸展張力の増加とともに増加するが，. 1 8 -.

(25) 伸展の影響は SHRSP標本において著明であること，高 K+収縮や NA 収縮は初期伸. 0-30mN付近で最大となること，内皮依存性弛緩は初期伸展張力 8mNで展張力 2 最大となり，それ以上の伸展では減弱してくることが明らかとなった.. v .小. 括. 血管平滑筋の収縮は標本に対する伸展の影響を受けることが知られている.また，血管の収縮は血管内皮の影響を受けるが，この内皮機能も伸展による影響を受ける. WKY と SHRSPでは血圧が大きく異なり，血管壁が受ける伸展張力も大きく異なっ. ていると考えられる.したがって. WKY と SHRSP の血管平滑筋や内皮機能を検討. する実験を行う際にはこの伸展張力の影響を検討しておく必要がある. ラット大動脈輪状標本に対する初期伸展張力 4-50mNの影響を検討した結果，自発性筋緊張は伸展張力の増加とともに増大すること，高 K+収縮あるいは NA 収縮は伸展張力 20-30mNで最大となること， AChによる内皮依存性弛緩は伸展張力 8mN で最大となることが明らかとなった.血管平滑筋では伸展による電位依存性 Ca2+チャネルの変化が，血管内皮では伸展による EDRF (NO) の遊離減少と EDCFの遊離増加が原因と考えられる. これら結果から，第 2 章以下のラット大動脈を用いた実験において平滑筋の収縮と内皮の影響を同時に検討する至適伸展張力は 8mNであると結論するに至った.. ー. 1 9 -.

(26) 第 2章. 高血圧自然発症ラット大動脈における自発性筋緊張. I.緒. E司. 一般にラット動脈平滑筋は静止筋であり，通常，非刺激下で自発性の収縮(自発性筋緊張)を示すことはないが， SHR の動脈平滑筋は非刺激下において筋原性の自発性筋緊張を示すことが知られている崎叫. ，叫.この自発性筋緊張は細胞外 Ca2+. 21-24. 2 2 に感受性があり，細胞外 Ca +の除去叫 21-2 4 ) や電位依存性 C a +チャネル阻害薬 22，叫を. 作用させることによって消失することが報告されている.これらの結果は SHR動脈平滑筋において電位依存性 Ca2+チャネル開口克進とそれに伴う細胞外 Ca2+流入増加があり，張力が発生していることを示している‘ 著者らは SHRより高い血圧を示す脳卒中易発症性 SHR CSHRSP) の大動脈平滑筋が SHRの標本に比べ高い自発性筋緊張を示すことに注目し，血圧と自発性筋緊張の聞に何らかの相関がある可能性を推測した. 本実験では Okamotoe ta l .1， 5 5 .的によって開発された異なった血圧を示す各種系統の SHRを用い，これらラットから摘出した大動脈平滑筋の自発性筋緊張と収縮期血 2 圧の関係を検討した.さらに，血圧と平滑筋細胞内 Ca +レベルの関係についても検. 討を加えた.. II . 実験方法. 1.実験動物実験には雄性の SH ， R SHRSP，悪性 SHRSP CM-SHRSP) と対照正常血圧動物としてこれら高血圧ラットと同じ祖先を持つ WKYを用いた.これらラットは初め Dr . Okamoto1， 55， 5 めから譲り受け，我々の動物飼育室で継続交配により系統維持している. ものである.系統の維持にあたっては交配に細心の注意を払い，各系統ごとの血圧， 1 2h rの明暗サイクルの条を維持するようにした.飼育は室温 22土 2 C，湿度 60% 0. 件下で行い，固形飼料 C F u n a b a s h iS P ) と水は自由摂取させた. WKY，SHR，SHRSP. 2 0 -.

(27) は血圧が上昇し，その圧が一定になる 1 6週齢で実験に用いたが， M-SHRSPは 1 6週齢までに脳卒中を起こし死亡する率が高いため 12週齢で用いた.. 2 .血圧測定第 1章と同様の方法で行った.. 3 .標本ラットはエーテル麻酔下，頚動脈を切断して脱血死させ，胸部大動脈を描出した. o d i f i e dTyrode‘ s液中で結合組織および、脂肪を除去した.張胸部大動脈は冷却した m. 力測定には幅 1m m の輪状標本を作製し，内皮は標本の内腔をゴムで擦過することで除去した.内皮の完全な除去は n o r a d r e n a l i n e( NA) で前収縮させた標本に a c e t y l c h o l i n e (ACh) を作用させ弛緩反応がみられないことで確認した.細胞内 Ca2+ p. レベル測定には幅 1m m，長さ 7m mのラセン状標本を作製し，内皮は脱脂綿で内腔側を擦過することで除去した.. 4 .生理学的塩類溶液生理学的塩類溶液は第 1章と同様のものを使用した.. 5 .張力測定張力測定は第 1章と同様の方法で行った.標本には 8mNの初期伸展張力を与えた. この操作は自発性筋緊張の発生を抑えるため Ca2+ f r e eTyrode液中で行った.この初期伸展張力は次章の実験を考慮して内皮の効果が最大にみられる(内皮依存性弛緩が最大となる)伸展張力であったことから選択した(第 1章参照).その後， modified rインキューベートしてからK5 0T y r o d e 's液で 2回収 Tyrode液に交換し標本を 1h. 縮させた.自発性筋緊張は m o d i f i e dTyrode液から Ca2+ を除去したときにみられる弛 2 緩，あるいは Ca2+ f r e eTyrode液に 2 . 0m MCa + を再添加したときにみられる収縮とし. て測定した.その測定値は K50による収縮を 100%とし，その比率で表した.. 2 1 -.

(28) 6 . 細胞内 Ca2+レベル測定 2 +レベルの測定は蛍光 Ca2+ 指示薬 f u r a 2 を用いて行った.この測定方法細胞内 Ca. はS a t oe ta l .78) の報告しているものと同様の方法である.幅 1m m，長さ 7m mの内皮を除去したラセン状標本を f u r a 2の a c e t o x y m e t h y le s t e r体 ( f u r a 2 / A M ) 20μM， cremophorEL0 . 0 6%を含む Tyrode液中に入れ， 1 8o C，4h r，暗所でインキュベー卜. した.このインキュベートにより Fura-2/AM は細胞内に取り込まれ，細胞質中に存在する酵素 ( a c e t y le s t e r a s e ) によって加水分解されて f u 日目 2となり. 2 Ca + との結合が. u r a2を負荷した標本の一方をシリコンラパーにインセクトピンで固定可能となる. f 司. し，そのシリコンラバーを細胞内イオン測定装置 (CAF-ll0，日本分光)の測定槽(容積:約 10m!)に固定した.標本の他方は輪を作った絹糸でしばり，張力トランスジューサーに固定した.標本をその自然長の 1 5 0%に伸展し， n o r m a lTyrode液中で 1 5min 平衡にした.その後，標本に 340nmと 380nmの二波長を交互 ( 4 8Hz) に励起し， 500nmの測定波長でその蛍光を測定した.340nmの励起波長による蛍光 ( F 加)と 380 2 F R a t i o， F340/ F レベル変化とし nmの励起波長による蛍光 ( 380) の比 ( 3 S O) を細胞内 Ca+ 2 2 +レベルは K50のときの R a t i oを 1 0 0% ， Ca + f r e eTyrode液のときの R a t i o た.細胞内 Ca. 2 を 0 %として示した.等尺性張力変化は細胞内 Ca +レベル測定と同時に測定した.. 7 .試薬実験に用いた試薬は以下の通りである.F u r a 2 / a c e t o x y m e t h y le s t e r( f u r a 2 / A M，同仁，熊本)， cremophoreEL(ナカライテスク，京都)， n i f e d i p i n eh y d r o c h l o r i d e(和光，大阪)•. 8 . 統計処理得られた値は means土 s . e . m e a nで表し， one-waya n a l y s i so fv a r i a n c eで解析して P値 . 0 5未満を有意差有りとした. が0. ウ占，ゥ M.

(29) III . 実験結果. 1.用いたラットの血圧 WKY，SH ， R SHRSPは血圧が一定に達する 1 6週齢で実験に用いた 34， 77) M -SHRSP 2逓齢以降では 2週齢で実験に用いたが，この系統は高頻度で脳卒中を発症し， 1 は1. 血圧が徐々に低下するためこの週齢を選択した. 実験に用いたラットの収縮期血圧をFig .1 3に示した.実験に使用した週齢における収縮期血圧は WKYく SHRく SHRSP く. ， R SHRSP の系統間で有意な差がみら MδHRSP の順に高い値を示し， WKY， SH. れた. SHRSP と M-SHRSP の血圧には系統問に有意な差はみられなかった. これは以前 Okamotoらによって報告されたものと一致していた 55，拘 . M-SHRSPは他の系統のラットより若い週齢であるにもかかわらず，血圧は他の系統に比べ有意に高い値であった圃 16週齢の SHRSP はまれに脳卒中を発症するが，この週齢では血圧が低下する傾向はみられなかった.. 主1250 ε ε C I I. ω. 庄工凶. 区工. i i i. u 1. ι. : o. ， g 1 0 0 o. 口問. a . 3150. ω e玄. ω a. 目白. 円跡的庄工. 当200. 的. 〉、. r . n. F i g u r e13 S y s t o l i cbloodp r e s s 町' eo fv a r i o u ss t r a i n so fr a t s . AgeofWKY，SHR姐 d位置 SPwas16 w e e k s . Ageo fM-SHRSPwas12weeksa sd e s c r i b e di nt h em e t h o d s . Eachv a l u er e p r e s e n t smeans: t s . e . m e a n . Numberso fd a t af o rWKY， SHR， SHRSP姐 dM-SHRSPa r e12， 1 3， 15and20， r e s p e c t i v e l y Bloodp r e s s u r eo f位置 wass i g n i f i c a n t l yh i g h 紅白姐 WKY( pく 0 . 0 5 ) . B loodp r e s s 町 eo fS l 王 RSP姐 d M-位置SPwasn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t(Pく 0.05)，however，i twass i g n i f i c a n t l yh i g h 紅白組 SHR ( P く0 . 0 5 ). 2 3 -.

(30) 2 .血圧と自発性筋緊張の関係高血圧自然発症ラットの大動脈は非刺激下において細胞外 Ca2+除去により消失する自発性筋緊張Cin t r i n s i ca c t i v et o n e ) を示した.この自発性筋緊張は内皮によって抑制されるが，内皮による抑制効果に違いがある可能性を除去するため実験はすべて内皮除去標本を用いて行った. F i g .1 4 は各種系統のラットから摘出した大動脈内皮除去標本に対する細胞外 Ca2+除去の効果を示している.高血圧ラットの標本は細胞外 Ca2+除去により弛緩反応(自発性筋緊張)を示し，この反応は SHRく SHRSP< 2. M-SHRSPの順で大きかった C F i g .1 5 ) . WKY標本は細胞外 Ca+除去に対して全く弛. 緩反応を示さなかった C F i g s .14and1 5 ) . SHRSPおよび M-SHRSPの標本では自発性筋緊張とともに収縮振動や自発性の t w i t c h様収縮がしばしば観察された.. WKY. 「ぃ. S H R 7 1 j : : ; ; ; ; : 2 7 1 S H R S Pょ l. ケ. -t. てご一一一一-. M S H R S P ι土. Figure14 Th ee f f e c t so fCa2+remova 1i nn o n s t i m 叫a t e dp r e p a r a t i o n sfromWKYandd i f f e r e n ts t r a i n s o fs p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s . Lef t:団g h K +i n d u c e dc o n t r a c t i o n . K50o rWashi n d i c a t et h e a p p l i c a t i o no fT y r o d e ' ss o l u t i o nc o n t a i n i n g50m MK+ o rw a s h i n go u tt h es o l u t i o nw i t hT y r o d e ' s s o l u t i o n，r e s p e c t i v e l y . R igh t :S i x t ym i n u t e sa f t e rw a s h i n go u to fK50. Att h et i m ewhent h et e n s i o n r e c o v e r e dt ot h ei n i t i a 11 e v e l，Ca2+ f r e eT y r o d e ' ss o l u t i o nwasa p p l i e d( C a f r e e ) . Th et e n s i o nfromt h e r e 1 axedl e v e lt o血ei n i t ia 11 e v e li n d i c a t e dwi 也a r r o w swas往e a t e da s白 e m 住i n s i ca c t i v et o n e .. 2 4 -.

(31) 50. 0 . 8. .O 選L. 。 c. a ω g z ω '芝. C I I 〉. I T A 庄工ω. O . L .. E3 0. aω. 0 . 6. 一. g20 U I J ). E10. ﹀ V晶﹀﹀. 0 . 2. c. o. ﹀ V品﹀﹀. ω c ζ c ﹀二uou zε}@COFhw. . 10. O. Figure15 Th ea m p l i t u d eo ft h ea c t i v et o n eo ft h ea o r t i csm ∞ 白血 l Sι l e . Lef t :A b s o l u t eva 1 u e so ft h e : tR e l a t i v eva 1 u e st o血ea m p l i t u d eo fr e s p e c t i v eh i g h K +ーi n d u c e dc o n t r a c t i o n . Th e a c t i v et o n e . Righ a m p l i t u d eo fhigh-K 七i n d u c e dc o n t r a c t i o nwasmeasuredfromt h eb a s el i n eo b t a i n e di nt h ea b s e n c eo f Ca2+ . Ea chva 1 uei nt h el e f t姐 dr i g h tf i g u r e sr e p r e s e n t smeans: I :s . e . m e 姐ー Th enumbero fd a t af o r WKY，SHR， SHRSPandM-SI 眼 SPi s 12，1 3，15皿 d20， r e s p e c t i ve 1y . Eachva 1 uei ss i g n i f i c a n t 1y d i f f e r e n tfromt h eo t h e r s( P<0.05) ー. F i g . 16 は本実験で使用したすべてのラットの血圧とそのラットから作製した内皮. 除去大動脈標本における自発性筋緊張の関係を示している. 図に示したように，. 白. 発性筋緊張はラットの血圧の上昇に伴い増加し，これら 2 つのパラメータの間には . 0 01 ) . 正の相関関係がみられた (R値 :0.756，n=54， P<0. 6 0 ~. ま. Y=0.24X・3 0 . 9. ~ 40. 0 由〉. u. •. :20 凶亡 L . .. E. o. ' m附. 1 0 0. F圃圃圃圃圃圃圃圃圃圃 '. 200 250 丹時剖r e(mmHg). ヌ ) ( ). F i g u r e16 C o r r e l a t i o nbetweent h eb l o o dp r e s s u r eo fr e s p e c t i v er a t s姐 d血ei n t r i n s i ca c t i v et o n eo f ∞血 m u s c l e . 日 ep 紅a t i o n sfroma 11s t r a i 回 o fr a t swerei n c l u d e d . Th ea m p l i t u d e so ft h e a o r t i c sm i n t r i n s i ca c t i v et o n eweree x p r e s s e da sp e r c e n t a g e so fh i g h K +i n d u c e dc o n t r a c t i o n . R e g r e s s i o nl i n e(Y ニ 0 .25X -3 0 . 9 )a ndt h er a n g eo f99% r e l i a b i l i t ya r ei n d i c a t e d . C l o s e dc i r c l e s，s q u a r e s，t r i a n g l e s姐 d opent r i a n g 1 esr e p r e s e n tva 1u e sf o rp r e p a r a t i o n sfromWKY， SHR， SHRSP叩 dM-SHRSP ， r e s p e c t i ve 1y. 2 5 -.

(32) 3 . 細胞外 Ca2+濃度と自発性筋緊張の関係 Ca2+ーf r e eT y r o d e 's液で完全に弛緩させた高血圧自然発症ラットの大動脈内皮除去標. 本は細胞外 Ca2+の再投与により収縮反応を示した ( F i g .1 7 ) . 本研究では実験方法に 2 も述べたように細胞外 Ca +除去によって生じる弛緩，あるいは細胞外 C a2+再投与に. よって生じる収縮の大きさを自発性筋緊張として測定している.自発性筋緊張を起 2 こす Ca +濃度の闘値は SHR ，SHRSP ，M-SHRSPの大動脈においてそれぞれ 1 0 -4 M，. 2 3x1 05M，3x1 O -5M であり，最大収縮を起こす Ca +濃度はそれぞれ 3X 1 0 -3M，1 0 -2M ・. =. 1 O -2M であった.最大収縮力は SHRく SHRSP M-SHRSPの順に大きくなった. SHR. 大動脈標本では細胞外 Ca た. WKY標本では 1 0 -2M までの Ca2+濃度ではほとんどの標本が自発性筋緊張を示さず，したがって平均としても極めて微弱な緊張発生となった.. nu. E -. 4.. nU. ・可﹄，. 一ーと. *80 山. c. B 60 ω. • M-SHRSP OSHRSP ASHR I : : .WKY. 〉. U ω. g 40 勺L. n u. 亡-LHC. O. 3x1Q-5 1 0 4. σJ. 1 02 ・. Cac o n c e n t r a t i o n( M ) F i g u r e17 Th er e l a t i o n s h i pbetweenCa2+ c o n c e n 仕組o n姐 da m p l i t u d eo ft h ei n t r i n s i ca c t i v et o n ei n p r e p a r a t i o n sfromd i f f e r e n ts t r a i n so fr a t s . I n s e r t e dt r a c eshowsat y p i a c lexampleo ft h er e s u l to b t a i n e d 2 w i t h ap r e p a r a t i o n from SHRSP. Ca2+ c o n c e n t r a t i o n was i n c r e a s e d from3 x 1 0 -5 M t o1 0 M c u m u l a t i v e l ya teacha r r o w . Th ei n t r i n s i ca c t i v et o n ewase x p r e s s e da sp e r c e n t a g e so fr e s p e c t i v eh i g h K+i n d u c e dc o n t r a c t i o n . E a < ι hv a l u er e p r e s e n t smeans: ts . e . m e a n . Numberso fd a t af o rWKY，SHR， SHRSP姐 dM-SHRSPa r e9， 1 3， 1 5岨 d20， r e s p e c t i v e l y .. 2 6 -.

(33) SHRSPおよび M-SHRSPの大動脈標本では Fig. 陪 1 8に示したような白発性の張力振. 動が高頻度でみられるため 1 ゲ 0 一 2M の C a た.自発性の張力振動を示す標本は Ca2+濃度を 1 0 -2 M にまで増加すると持続性の発生張力は低下する傾向がみられた.. SHRSP e n d o t h e lH. I Ca-Ir田]ムi.....1. C a. h. _ 20min. F i g u r e18 A t y p i c a lexampleo ft h er e s p o n s et ot h er e m o v a landr e a d m i n i s t r a t i o no fe x t r a c e l l u l a rCa2+ i nt h ee n d o t h e l i u m r e m o v e dp r e p a r a t i o nfromSHRSPshowing s p o n t a n e o u st w i t c h l i k ec o n t r a c t i o n s 2 2 +w +Ca asremoveda tCa f r e eandr e a d m i n i s t r a t e di n c r e a s i n gt h ec o n c e n t r a t i o nbys t a g e sa st h ea r r o w s i n d i c a t e . Th ec o u ι e n t r a t i o no fr e a d n u n i s t r a t e dCa2+ a tt h ef i r s ta r r o wwas3x105M andt h a ta tt h el a s t a r r o wwas1 0 -2M.. 4圃自発性筋緊張におよぼす nifedipineの影響 2 2 SHRSP標本でみられた細胞外 Ca +の再投与による発生張力は電位依存性 L型 Ca+. チャネル阻害薬である. 6. nifedipine( 1 0 - M)存在下で著明に減弱した CFig.1 9 ).Nifedipine. 3 の有無いずれの場合も最大収縮は Ca2+濃度 1 0 -2 M でみられたが，収縮力は 2X 1 0 M. Ca2+ 存在下でみられた K+50m M収縮による収縮張力の 106.4土 11 .2% ( n=1 3 )か. ら1 0 . 5土 1 . 4% ( n=1 0 ) に低下した.. 2 7 -.

(34) a. b. SHRSPE( ー ). Co n t r o l. SHRSPE( ー ). 。 C o n0 1. ∞. f¥. 甘. 1. • N i f e d i p i n e. # .. 1 雨e i l w 一. E E. 言 50. N i f ，剖l 阿n e. 邑 .. ♀=:::::b. -=~. E. E. 。10-. 5. N陶. 3 1 0 -. 1 0 " 4. Ca∞n c e n 甘副o n(M). 1 0 ・ 2. 2 Figure19 Th ee f f e c to fn i f e d i p i n e( 1 06 恥1 )onCa +i n d u ι e dd e v e l o p m e n to ft e n s i o ni nendo 也e l i u m c e si nt h ea b s e n c e( C o n t r o l )o rp r e s 回目 o f1 06 M removedp r e p a r a t i o n sfromSHRSP. a :T y p i c a l回 . i f e . ) . S o l i db a r(N i f e . )i n d i c a t e st h ea p p l i c a t i o no fW 6M n i f e d i p i n e Ca2+ c o n ι e n 佐a t i o n n i f e d i p i n e(N 5 2 wasi n c r e a s e dfrom1 0 -M t o1 0 -M c u m u l a t i v e l ya te a c ha r r o w . O t h e rp o i n t sa r et h esamea st h o s e 2 d e s c r i b e di nF i g .1 2 . b :C o n c e n t r a t i o n r e s p o 回 c ιurvesf o re x t r a c e l l u I a rCa +i n d u c e dc o n t r a c t i o ni n t h ea b s e n c e( C o n t r o l，n=1 3 )o rp r e s e n c eo fn i f e d i p i n e(N i f e d i p i n e，n=1 0 )i np r e p a r a t i o n sfromSHRSP. Th ein 出n s i ca c t i v et o n ewase x p r e s s e da sp e r c e n t a g e so fh i g h K +i n d u c e dc o n t r a ι t i o n . Eachva 1 ue ts . e . m e a n . A s t e r i s k si n d i c a t es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sfromt h eva 1 u e so fC o n t r o l(Pく r e p r e s e n t smeans: 0 . 0 5 う . 目. 司. 5 . 細胞内 Ca2+レベルと自発性筋竪張の関係 F ig . 20aは WKYおよび M-SHRSPの内皮を除去した大動脈標本における F u r a 2法によって測定した細胞内 Ca2+レベル変化と同時測定した張力変化を示している.非刺激下において， M-SHRSP標本は細胞外 Ca2+除去により著明な細胞内 Ca2+レベルの低下とそれに伴う弛緩反応が観察された.この結果は，この標本では正常 Tyrode液 3 2 (Ca2+濃度 :2 X 1 0 M) 中で細胞内 Ca +レベルの上昇があり，収縮が生じていたこ. とを示している.一方， WKY標本は細胞外 Ca2+除去によってわずかな細胞内 Ca2+レベルの低下を示したが，張力変化はみられなかった. M-SHRSP標本では細胞内 Ca2+ レベルの振動が高頻度で観察され，同時にそれに伴う張力振動も観察された. i g . 各系統ラットの大動脈における非刺激下での細胞内 Ca2+レベルと血圧の関係を F. 20bに示した.細胞内 Ca2+レベルはラットの血圧上昇とともに増加し，両者には正の. 相関がみられた (R=0.884，n=45，Pく 0 . 0 01 )_. 2 8 -.

(35) 。 R a t同. J 1. b. WKY 0 . 3 8. fL. 民主. T e n s i o n. f C a t r e e. f KI W. 5 0. 。夏お. M S H R S P 1 ・司L R a l i D I. 山岨I U四目 0.65 0". 竺じ. T e n s i o n. . 1 ¥ ¥. 100. . . 2∞. 150. .. 250. .. ∞. 3. S y s l o l i cb l ∞d p r 田 s u r e( m m H g ). 一一. I C a t r e e. I K↓W. 2 +l e v e lmeasuredbyf u r a 2me 血od姐 di nt e n s i o ni n d u c e dby Figure20 a :Changesi ni n t r a c e l l u l a rCa 2 1o fe x t r a ι e l l u l a rCa+i np r e p 紅 a t i o n sfromWKY姐 dM-SHRSP. W andC a f r e ei n d i c a t e t h eremova 血T y r o d e ' ss o l u t i o n姐 dt h eremova 1o fe x t r a ι e l l u l a rCa2+w i t hCa2 washingo u to fh i g h K +s o l u t i o nwi f r e eT y r o d e ' ss o l u t i o n，r e s p e c t i v e l y b :Th er e l a t i o nbetweens y s t o l i cbloodp r e s s u r eandt h ec h a n g e so f 2 e v e li n d u c e dbyt h er e m o v a lo fe x t r a ι e l l u l a rCa + . Th eCa2+l e v e l sa r ee x p r e s s e da s i n t r a c e l l u l a rCa2+l p e r c e n t a g e so fh i g h K +ーi n d u ι e di n ι r e a s e . Th e s el e v e l sa r e measured from t h el e v e lo b s e r v e d by r e m o v l l l gex 住a ι e l l u l a rCa2+ . 十一. 目. I V .考察. 一般にラットの動脈平滑筋，特に大動脈の平滑筋は非刺激下で自発性の収縮(緊張)を示すことはない.しかし， SHR の大動脈平滑筋は自発性の筋緊張を持ち，非，叫.この自. 刺激下においても自発性に収縮していることが報告されている民叫. 2 1-24. 2 発性筋緊張は細胞外 Ca2+感受性で細胞外 Ca +除去によって消失する以 21-24) さらに，. Ca2+桔抗薬. ，叫によっても消失することから，電位依存性 Ca2+チャネルを介して細. 22. 2 +によって発生していると考えられている眠胞外から流入する Ca. 一科的.本実験で. 21. は血圧の異なる種々の系統の高血圧自然発症ラットを用いて，自発性筋緊張の性質および、自発性筋緊張と血圧との関係を検討した. 本実験では血圧の高い系統のラットにおいて強い自発性筋緊張がみられ，さらに血圧と自発性筋緊張の聞には高い相関があることも明らかとなった.本実験で用いたすべての系統のラット大動脈でみられた白発性筋緊張は細胞外 Ca2+除去によって. 2 9 -.

(36) 消失した.同様の結果は SHRの大動脈を用いた他の研究でも報告されており，細胞 2 +の流入による収縮であると考えられている眠 2 外 Ca 1-拘.本実験では SHR以外の系. 統の高血圧白然発症ラツト大動脈における自発性筋緊張も細胞外 Ca ることが示された. 2 2 自発性筋緊張が細胞外 Ca +によるものであれば，細胞外 C a +濃度の変化はこの緊. 張に大きな影響を与えると考えられる.実際に，本実験では自発性筋緊張が細胞外 2 Ca +濃度に依存して上昇することが示された.また，その濃度一作用曲線から血圧が. 高いラットほど細胞外 Ca2+感受性が高く，収縮も大きくなることが明らかとなった. WKYと SHRあるいは SHRSPの血管平滑筋収縮タンパクの Ca2+感受性には差がない. という報告があることから吹細胞外 Ca2+感受性の差は収縮タンパクの Ca2+感受性 2 +流入の差によると結論できる.血圧が高いラットの大動の差ではなく，細胞外 Ca. 脈平滑筋ではこの過程が克進しており，その程度と血圧の聞には相闘があると考えられるが，このことについては後述する. 3 2 SHRSPおよび M-SHRSPの標本では 1 0 -3 M あるいは 3 X 1 0 M の Ca +で自発性の. 張力振動がみられたが，これは Ca このことは，この自発性の張力振動に平滑筋の細胞膜興奮，おそらく活動電位様膜電位振動が関与している可能性を示唆する.細胞外 Ca2+濃度上昇による自発性張力 2 振動の消失は Ca +による膜安定化作用 79 ，納で説明できると思われる.高血圧自然発. 症ラットの血管平滑筋における膜興奮性の異常は腸間膜動脈においても報告されているめ.通常，正常血圧ラットの大動脈平滑筋は膜の自発性電気活動を示さないが，これらの高血圧ラット大動脈平滑筋細胞膜では自発性電気活動があると考えられる. 2 +チャネルを開口させ，細胞外 C a2+ 細胞膜の電気的活動(脱分極)は電位依存性 Ca 2 2 2 の流入をもたらす. Ca +桔抗薬はこの電位依存性 C a +チャネル C L t y p eCa +c h a n n e l ). を阻害することが知られている.本実験において， SHRSP大動脈平滑筋の自発性筋 2 緊張は Ca +桔抗薬で抑制された.他の系統の SHR大動脈における自発性筋緊張も C a2+. 措抗薬で抑制される結果が得られていることから，これらラット大動脈における自発性筋緊張がこのチャネルを介して流入する Ca2+によってもたらされたものであったことを意味する.同様の結果は SHRの頚動脈においても報告されている 2の.高血圧自然発症ラットの大動脈平滑筋では電位依存性 Ca2+チャネルの開口克進があり，. 3 0 -.