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三出』tcsトfr胴

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Figure 28 The effect  of nifedipine  on Ca²+ ‑induced contraction in血epresence  of L‑NNA in  the  endothelium‑intact preparations of SHRSP aorta.  a:  Typical traces in也eabsence (Control) or presence  of 10‑⁶ M nifedipineο‑Jife) in the presence of 10‑4 M L‑NNA.  Ca²+ was added each arrow from 10⁵ M  to  10‑² M cumulativery.  Other points are the same as  those described in Fig. 24.  b:  Concentration‑ response curves for ex佐acellularCa^2¥induced contraction of L‑NNA‑treated preparations in the ahsence  (Control， n 

= 

15) or presence of nifedipine (Nifedipine， n 

= 

14).  Asterisks in正licatethe  signifiιant  differences from the values of Control (Pく 0.05)

によるゆっくりとした収縮は他の高血圧 SHRSP内皮正常標本でみられた L‑NNA

最大収縮に達するまでの M‑SHRSP) においても観察されP

(SHR，  自然発症ラット

時間も SHRSP標本と同様に3時間から5時間を要したCFigs.29 and 30a) .このL‑NNA つのパラメータの間 この 2

による収縮はラットの血圧が上昇するのに伴い増大し，

また， 本 実 P < 0.001)  (Fig.  30b).  n = 70， 

にはよい相関がみられた (R値 :0.866， 

同じ系統の高血圧自然発症 による収縮力は，

験 で 得 ら れ た 内 皮 正 常 標 本 の しNNA

より ラット大動脈の内皮除去標本において得られた自発性筋緊張(第 2章 参照)

‑41‑ 強かった.

WKY 

J 二 ト し

^NNA

^{四 回}

^1h

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^r

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  ³

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^h

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^{‑ ‑ 君 事 = =}

⁵

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^{一 一 一 一 ‑ い ﹂ 叩}

SHR  l  ¥ 

・ム♂}一一一一ー

14mN  オK5ö1W~~一一...---._-一一一一一一一一

同日

SHRSP 

f¥/‑J:L  ^L 

f ¥ / 1 h r  3hr 

;')~"

い 一

川

M‑SHRSP 

同 ﹂ 叩

Figure 29  L‑NNA‑induιed tension development in血eendotheliu皿‑intactprep紅ationsfrom various  strains of rats.  One，也氏eand five hr indicate the time after the application of L‑NNA.  Other pαnts  are same as those in Fig. 24. 

a  ^b 

51 Y=0.023X・2.94，r = 0.866  (n = 70， P < ^0.001) 

o 

•

1001  0 WKY 

. .  SHR  ま .SHRSP  g  ・ 跡SHRSP B さ~50

E O 

壱

帽

δ E 

A﹃mAM円'h

(Z E} zg KM gH E0 0 

•

o o  100  2

∞ 

³

∞ 

¹

∞ 

^{却0 300} 

TIme(min)  Systolic blood pressure (mmHg) 

Figure 30  a:  Time co町seof the tension development induced by L‑NNA (10‑4附inthe endothe1ium‑

intact prep紅 白onsfrom various strains of rats.  b: The re1ationship between the systolic blood pressure 

姐 d血edeveloped tension at  3

∞

^{mins.  The developed tension in} b was measured at  5 hr after the  application ofL‑NNA.  Regression 1ine (y 

= 

^{O.023X】 2.94)and range of 95} % re1iabi1ity are indicated. 

4.内 皮 に よ る 自 発 性 筋 緊 張 調 節 に お け る 内 皮 由 来 収 縮 因 子 お よ び 過 分 極 因 子 の 関 与

アラキドン酸カスケードの cyc100xygenase阻害薬である indomethacinはL‑NNAに よる SHRSP内皮正常標本の収縮反応を抑制した.Indomethacinによる L‑NNA収縮 に対する抑制効果は弛緩反応として観察したが，その弛緩率は indomethacin 10‑⁶ M 

および1O‑⁵M でそれぞれしNNA収縮の 15.4:t3.1 %，  25.5:t 5.2 %であった.(Fig. 31). 

，

、 旨、

30 

c::::  20 

0 

ー悶‑

M 

S 1 O   Z 

o 

国 indomethacin10・6M

• indomethacin 10・5M

Figure 31  Relaxing effect of indomethacin on the L‑NNA‑induced contraction血 theendothelium  intact preparations from SHRSP.  The re1a^"l¥.ation by indomethacin was ex戸essedas percentage of the  L‑NNA‑induιed contraction. 

Fig.32はSHRSP標本に対する Ca²+活性化K+チャネル阻害薬の apamin (10‑⁷ M) と

charybdotoxin (10‑⁷ M) を同時に作用させたときの反応を示している.内皮正常標本 にこれら試薬を作用させると，多くの標本で張力振動を伴う持続的な収縮がみられ た.同様の張力発生は内皮除去標本でもみられたが，この場合は張力振動を伴うこ

とはまれであった.同様の効果は1O‑⁴M のtetraethylammoniumによってもみられた.

この収縮反応は内皮正常，内皮除去どちらの標本においてもみられ，また WKY標 本においても観察された (datanot shown). 

同43‑

SHRSP 

E { ) Q ^{士記平副;」}

E(+)  ¥  4 圃 圃 園 田 園 ー 1^4mN 

お ^{‑ f J J h τ ; i : i L i} 瓦 j L i i : J ‑ i z z i n

Figure 32  Effects  of treatment with apa皿in^岨 dcharybdotoxin on endothelium‑intact^祖 d‑denuded  preparations from Sl虫SP. Apa皿in(10.7 M)姐 dcharybdotoxin (10⁷附 wereapplied simultaneously  Dotted lines indicate也ecompletely relaxed 1evel observed by the application of veraparnil (10^5恥1)阻d papaverine (10^‑4 M). 

IV. 考 察

正常血圧ラットの大動脈平滑筋は非刺激下において静止状態にあるが，高血圧ラツ トの平滑筋は自発性筋緊張(匂acαti児vetωo即ne)を持つていることはよく知られている ²¹口，2幻3，^μ 時 叫この自発性筋緊張は平滑筋原性で細胞外Ca吋こ感受性があり，細胞外Ca^Z+除去 や Ca²⁺阻害薬によって消失することから，電位依存性 L型 Ca²⁺チャネルから流入し たCa²⁺によるものと考えられている ²¹，ぉ，24，ω また，これはラットの血圧と相関があ り，血圧が高いラットの血管ほど自発性筋緊張も高い.これらのことは本論文の第2 章においても確認している.

高血圧ラット大動脈の自発性筋緊張は血管内皮によって抑制されることが報告さ れている払⁶³，89) 本実験においても実験に使用したすべての系統の高血圧自然発症 ラット大動脈標本において，細胞外 Ca²⁺依存性の自発性筋緊張が血管内皮によって 抑制されていることが確認された.血管内皮は種々の内皮由来因子を遊離して血管 の収縮を調節していることが知られているが ^29‑31， 43) 自発性筋緊張の抑制に主に関 与しているものは内皮由来弛緩因子 (EDRF)¹⁰⁵⁾であると考えられている.この EDRF は 一 酸 化 窒 素 (nitric oxide:  NO) であるとされ ⁹⁰，91) この因子の自発性の遊離

(spontaneous release，あるいは basal release)が自発性筋緊張を抑制していると考え られる.

N Oは血管内皮において N O合成酵素 (NOS) の働きによってしargmmeから合成

され胤，107)  L‑NMMAや L‑NNAはこの酵素を阻害することが知られている印刷.

本実験に用いた L‑NMMAとL‑NNAの濃度 (10‑⁴ M)はWKYや SHRSPの大動脈に おける内皮依存性弛緩を完全に消失させるのに充分な濃度であることが確認されて いる.本実験では内皮正常標本においてこの濃度の L‑NMMAや L‑NNAが収縮作用 を示した.また，この収縮は内皮依存性であり，内皮除去標本ではみられなかった.

このことは，内皮における NO合成がこの収縮の抑制に関与していたことを意味す る.内皮正常標本では細胞外 Ca吋こ依存した自発性の筋緊張が弱いことと考え合わ せて，内皮由来の N Oが大動脈平滑筋の白発性筋緊張を抑制しており， L‑NMMAや L‑NNAによつてこの抑制が取れたため収縮(筋緊張)が現れたものと考えられる.

また， L‑NMMA や しL鴫.咽号.判.

薬投与で消失したことから，第 2章で述べた電位依存性 Ca²+チャネルを介した細胞 外 Ca²+の流入によってもたらされる自発性筋緊張と同じものであると結論すること ができる.これら NOS阻害薬による収縮は血圧の高い系統のラットから摘出した標 本において大きく，血圧と収縮の間に相関がみられた.この関係は第 2章で述べた 自発性筋緊張と血圧との関係と類似する^ω この結果も NOS阻害薬によって発生した 収縮が平滑筋の自発性筋緊張によるもので，内皮由来の N Oによる抑制が取れた結 果であるという考えを支持する.

NOは NOSによって L‑arginineから合成されるが， D^四argmmeは NOSの基質とな らないことが知られている踊， 107) 本実験においても， L‑NMMAや L‑NNAによる収 縮(筋緊張)は L‑arginineによって抑制されるが， D‑arginineでは抑制されないこと が確認された.この結果もこの収縮が NO合成抑制の結果であることを裏付ける.

非刺激条件下で血管内皮によって平滑筋の筋緊張が抑制されていた結果から，血管 内皮では N Oが自発性に遊離されていると考えられる.このような EDRF (NO) の 自発性遊離はbasalreleaseとして平滑筋刺激薬による収縮の内皮による抑制において も報告されている 92，93)

L‑NMMAや L‑NNAによる張力発生は非常に緩やかで，最大に達するのに数時間 を要した.この原因として，これら NOS阻害薬の作用に時間を要することが考えら れるが，ブタ大動脈内皮細胞においてしNNAは作用後 10minで充分にNOSを阻害 することが報告されていることから ¹⁰⁸⁾ この可能性は否定される.血管平滑筋にお

‑45‑

ける自発性筋緊張の発生に時間を要する可能性も考えられるが，細胞外 Ca²+除去後 に Ca²+を再添加したときにみられる張力発生の時間経過からみて， この可能性は低 い.

NOS

阻害薬による非常に穏やかな張力発生については今後さらに検討する必要 がある.

本実験において，高血圧ラットの大動脈平滑筋でみられる自発性筋緊張が内皮由 来の

NO

によって抑制されていることが示されたが，高血圧ラットの血管では内皮 依存性弛緩の障害(減弱)があることが知られており 32，叫羽 101) 内皮による自発性 筋緊張の抑制効果も低下していると考えられる.ラット大動脈における内皮依存性 弛緩は主として

NO

によってもたらされるが，

SHR

大動脈の内皮依存性弛緩の障害 には

NO

遊離減少の他に，内皮由来収縮因子 (EDCF)の遊離増加が関与しているこ とを示唆する報告がある ^40‑42) この EDCFの反応は indomethacinω， ¹¹⁰⁾ によって阻 害されることからアラキドン酸カスケードのcyclooxygenaseの代謝産物(prostaglandin H2あるいはthromboxaneA₂) と考えられている ω，95，96) 本実験では軽度であるが， L‑

NNA

による収縮が indomethacinによって抑制された.このことは，高血圧自然発症 ラット大動脈において EDCFが自発性に遊離されており，平滑筋の収縮に寄与して いる可能性を示す.しかし，高血圧ラットの大動脈では内皮除去標本においても白 発性筋緊張がみられることから， EDCFが自発性筋緊張発生の主な原因になってい

るとは考えられない.

高血圧自然発症ラットの血管における内皮依存性弛緩の障害には内皮由来過分極 因子 (EDHF)の遊離減少が関与している可能性も報告されている 8，36一 期 . EDHFは 平滑筋の Ca吋舌性化 K+チャネルを活性化させ，平滑筋を過分極させることで電位依 存性 Ca²+チャネルを抑制し収縮を抑制するので，この因子の効果はこの K+チャネル を阻害する試薬で抑制することができる.本実験ではapammとcharybdotoxinを併用 したがめ，この処置は収縮をもたらした.この収縮は内皮正常 内皮除去どちらの標 本においても観察され，内皮に依存した反応ではないことが示された.K+チャネル 阻害による平滑筋細胞膜の脱分極がこの収縮の原因である可能性が高い.一般的な K+チャネル阻害薬である tetraethylammoniumが同様の収縮反応を示したことも，

apammとcharybdotoxin併用による収縮が平滑筋の脱分極によるものであるという考 えを支持する.内皮正常標本ではapaminとcharybdotoxinによって張力振動がみられ

た.張力振動のなかには内皮依存性のものもあることが報告されており山この張 力振動はこのことと関連があるのかもしれない.K+チャネル抑制は細胞膜を脱分極 させるとともに，静止状態の血管平滑筋においてもスパイク様活動電位を発生させ ることが知られているので，張力振動もこの電位によって発生している可能性が高 い.いずれにしても， EDHFは内皮による自発性筋緊張の抑制に大きく関与してい るとは考えられない.

以上，高血圧自然発症ラット大動脈平滑筋における自発性筋緊張は内皮によって 抑制されていることが示された.この抑制には主として内皮由来の NO (EDRF)が 関与していることが明らかとなった.EDCFは自発性筋緊張の増大に寄与している 可能性が示唆されたが，筋緊張の発生には寄与していないと考えられる. EDHF遊 離の関与はほとんどないと考えられる.

V. 小 括

高血圧自然発症ラット大動脈平滑筋における自発性筋緊張は内皮によって抑制さ れている.この抑制は NOS阻害薬で遮断されたことから，主として自発性に遊離さ れている NOが内皮の抑制効果に寄与していることが明らかとなった.lndomethacin  感受性の EDCFが自発性筋緊張の調節に関与している可能性が示されたが，その程 度はわずかであった.また，自発性筋緊張の調節における EDHF関与の可能性はほ

とんどないことも明らかとなった.

‑47‑

ドキュメント内 高血圧自然発症ラット導管系血管平滑筋における収縮反応亢進とカルシウム動態異常に関する研究 (ページ 47-54)