ジャマイカ産シソ科植物 からのATL細胞に対する 抗腫瘍活性物質の探索

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薬剤耐性を克服する新規抗がん剤

hyptoside の有用性

鹿児島大学大学院医歯学総合研究科附属 難治ウィルス病態制御研究センター 血液・免疫疾患研究分野 有馬 直道 ヨハン ホワイト 鹿児島大学大学院理工学研究科生命化学専攻 濵田 季之

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要約

目的：

成人Ｔ細胞白血病（Adult T-cell Leukemia: ATL）は、従来の抗がん剤が効 きにくく、再発率も非常に高いという、きわめて難治性の白血病である。 本発明は、ジャマイカ産シソ科植物 Hyptis verticillata 由来の新規有機化 合物が、ATL 患者由来の白血病細胞株 S1T 細胞に対して極めて高い抗腫 瘍活性を示す性質を利用し、ATL およびその他のがんに対する治療に利用 することを目的とする。 ポイント： これまで ATL に対する有効な薬剤は見つかっていない。本化合物またはそ の誘導化物質から ATL 治療薬が開発される可能性は高い。 効果： 本新規化合物は、ATL 患者由来の白血病細胞株 S1T 細胞に対して、極め て高い抗腫瘍活性を示す。 用途： ATL およびその他のがん（特に造血器腫瘍）に対する治療等に利用する。

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Ｈｙｐｔｉｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ

• 界：植物界 • 門：被子植物門 • 綱：双子葉植物綱 • 目：シソ目 • 科：シソ科 • 属：イガニガクサ属 http://fm2.fieldmuseum.org/plantguides/view.asp?chkbox=4764 H.verticillataはメキシコで一般的に『hierba martina』などと 呼ばれ、アメリカの熱帯地域で薬用植物として広く用いられて いる。 頭痛・胃痛・歯痛 消化器疾患 リウマチ・皮膚感染・虫さされ 駆虫薬

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ATL (adult T-cell leukemia)

• ATLとは細胞性免疫であるT細胞がHTLV-1というウイ

ルスに侵されてがん化する白血病。

• 日本でのHTLV-1感染者は特に九州・沖縄地方に多い。

• 潜伏期間：約40~60年

• 感染経路：性交、母乳、輸血

• 症状：リンパ節腫脹、肝脾腫大、皮膚紅斑、消化器疾患、

高カルシウム血症、日和見感染

ATLは抗がん剤が 効きにくく、再発率も 非常に高いので、き わめて難治性であ る

有効な治療薬の探索

!!

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単離スキーム

Hyptis vert icillata, dried leaves (ca. 500 g)

Ether layer (1.80 g) H2O layer

Hexanelayer (0.56 g) 90%MeOHaq.layer (1.10 g) n-BuOHlayer (0.40 g) H2Olayer (0.41 g) Partition (Ether / H2O) ODS-HPLC (MeOH / H2O)

Extracted with MeOH x 2

MeOH extract （2.45 g）

0.22 µg / mL

SiO2Column Chromatography

Fr. 9 (53 mg) A (1.7 mg) Non-polar _Polar Partition (n-Hexane / 90%MeOH) Partition (n-BuOH / H2O) 0.13 µg / mL > 100 µg / mL > 100 µg / mL > 100 µg / mL 0.03 µg / mL 6.50 µg / mL 0.003 µg / mL 0.0025 µg / mL D (2.2 mg) 0.002 µg / mL B (1.6 mg) 2.00 x 10-6µg / mL C (0.5 mg) 0.015 µg / mL E (1.3 mg) 0.02 µg / mL ATL細胞株S1Tに対する 増殖抑制活性をWST法 で測定し、IC50を求めた 最終的に５つの活性分画 を分離した

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compound Aの構造決定

・分子式： C₂₃H₂₂O₈ ・分子量： m/z 426.16 [M+_] ・S1T細胞に対する抗腫瘍活性 IC₅₀値 2.5 ng/ mL HMBC correlation No. d_C d_H (mult., J = Hz) 1 42.7 4.76 (d, 6.0) 2 158.0 3 127.6 4 24.3 3.60 (dd, 22.5, 4.1) 3.64 (dd, 22.5, 4.5) 4a 130.5 5 140.1 6 148.8 7 134.5 8 103.3 6.34 (s) 8a 116.2 9 71.1 4.76 (dd, 17.2, 2.3) 4.86 (d, 17.2) 10 172.2 11 100.9 5.89 (brs) 1’ 138.2 2’ 105.5 6.34 (brs) 3’ 153.2 4’ 137.9 5-OMe 59.3 4.07 (s) 3’-OMe 56.1 3.76 (s) 4’-OMe 60.7 3.76 (s)

O

O

O

OCH

₃

CH

₃

O

OCH

₃

O

OCH

₃ 10 9 2 3 4 4a 8a 1 1' 2' 6' 3' 4' 5' 5 8 6 7 11

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Compound A

O O O H3CO OCH3 OCH3 OCH3 O

IUPAC名称：

4-methoxy-9-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-8,9- dihydrofuro[3’,4’:6,7]naphtho[2,3-d][1,3]dioxol-6(5H)-one ＳＴＮ-レジストファイル（ＣＡＳのデータベース）にて、構造検索の結果、 同化合物は新規化合物と判断。

Hyptosideと命名した。

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compound Bの構造決定

O O O OCH₃ OCH₃ O OH H₃CO 5.96 6.24 6.36 6.36 3.76 _3.76 3.81 2.7 2.7 4.61 3.96 4.48 2.5 3.22 化合物(B)の構造と1_{H NMRケミカルシフト値(ppm)} ・ β-peltatin ・不定形無色の固体 ・分子式 ： C₂₂H₂₂O₈ ・分子量 ： m/z 414.16 [M+_] ・S1T細胞に対する抗腫瘍活性 IC₅₀値 _{2.0 x 10}-3 _{ng / mL} B.Konuklugil,Chem.Nat.Compd.,2005, 41,306-307.との比較によって構造を決定。

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compound Cの構造決定

O O O O H₃CO OH OCH₃ 5.96 5.93 6.67 6.52 3.07 2.73 _3.924.45 2.73 2.73 4.60 6.35 6.35 3.79 3.79 5.04 化合物（C）の化学構造と1_{H NMRケミカルシフト値(ppm)}

D.E.Jackson and P.M.Dewick,

Phytochemistry,1984,23,1147-1152. との比較により構造を決定。 ・4’-demethyldesoxypodophyllotoxin ・不定形で黄色がかった固体 ・分子式： C_2１H₂₀O₇ ・分子量： m/z 384.12 [M+_] ・S1T細胞に対する抗腫瘍活性 IC₅₀値 _{15 ng/mL}

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compound Dの構造決定

O O O H₃CO OCH₃ OCH₃ 1 2 3 4 4a 6 7 8 8a 9 10 11 1' 4' 2' 3' 5' 6' 5 O 5.95 6.72 3.87_3.63 4.81 4.87 4.81 6.63 3.78 3.79 3.78 6.37 6.37 ・Hyptinin ・不定形無色の固体 ・分子式： C₂₂H₂₀O₇ ・S1T細胞に対する抗腫瘍活性 IC₅₀値 _{2.0 ng/mL}

M. Kuhnt et al, Phytochemistry,

1994,36,485-489.

との比較により構造を決定。 化合物（D）の化学構造と

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compound Eの構造決定

δH (ppm) δC (ppm) 1 4.38 45.2 2 3.32 46.3 3 3.02 32.9 4 2.46 2.84 31.9 4a - 130.4 5 6.69 108.7 6 - 146.8 7 - 146.8 8 6.58 109.8 8a - 128.2 9 - 178.3 10 3.96 4.48 72.6 11 5.92 5.95 100.9 1' - 138.2 2' 6.33 104.9 3' - 153.3 3'-OMe 3.78 56.1 4' - 136.8 4'-OMe 3.82 60.8 5' - 153.3 5'-OMe 3.78 56.1 6' 6.33 104.9 O O O O H₃CO OCH₃ OCH₃ 1 2 3 4 4a 6 7 8 8a 9 10 11 1' 4' 2' 3' 5' 6' 5 ・Deoxypicropodophyllin ・分子式： C₂₂H₂₂O₇ ・分子量： m/z 398.24 [M+_] ・S1T細胞に対する抗腫瘍活性 IC₅₀値 _{20 ng / mL}

Y. Inamori et al. Chem. Pharm. Bull., 1985, 33, 704-709.との比較によって構造を決定。

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類縁の抗がん剤

etoposide

O O O OH OCH₃ O H₃CO O O O H₃C H HO OH ・本研究で単離した化合物の類縁体。 ・現在抗ガン剤として利用されている。 （例）肺小細胞ガン、悪性リンパ腫 子宮頚ガン、急性白血病 精巣腫瘍、膀胱ガン 日本化薬（ラステット注） ブリストル・マイヤーズ（ベプシドカプセル） etoposideの化学構造 O O O H3CO OCH₃ OCH3 OCH3 O Hyptoside

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Cytotoxicities of hyptoside on Cancer Cell Lines

100 50 0 Gr owt h Ra te (%) 0 0.0001 0.001 0.01 0.1 1µg/mL HL60 K562 K3T S1T Jurkat ATL cells ALL cells

Myeloid leukemia cell A549

SW480

Lung Cancer cell Colon Cancer cell

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IC50 of hyptoside on Cancer cell lines

S1T 7.0

K3T

9.4

Jurkat

4.7

K562 94.0

HL60

70.0

A549

11.8

SW480 23.6

Cell lines

_{IC 50}

(nM)

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Cytotoxicities of hyptoside on activated normal T cells

100 50 0 G row th R at e (% ) 0 0.0001 0.001 0.01 0.1 1mg/mL S1T Act T cell IC50 (nM) S1T 7.0 Act T 211(x30)

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Apotosis Induction by hyptoside on S1T Cell

形態的にはapototic body ( ) が誘導されている

P53増加、BAX増加 Cleaved PARP増加、 Cleaved casp3, casp9

など、アポトーシス関連 蛋白の増加が認められる

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G2/M Arrest of S1T Cell Induced by Hyptoside

none etoposide 0.25µM hyptoside 0.001µg/mL hyptoside 0.01µg/mL hyptoside 0.1µg/mL hyptoside 1µg/mL 24 culture hyptosideは etoposide と同様 G2 arrestを誘導

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 1E-06 0.0001 0.01 1 ％ 濃度(_μg/m) hyptoside S1T KB3-1 KBMRP1 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 1E-06 0.0001 0.01 1 ％ 濃度_(μg/m) etoposide S1T KB3-1 KBMRP1

Comparison of hyptoside and etoposide on KBMRP1 Cells

Does hyptoside overcome multi-drug resistancy?

濃度(nM)

0.235 23.5 2350

濃度(nM)

0.235 23.5 2350

MRP1 = ABCC1 hyptosideは _{etoposideに耐性}

となったABCC1移入 KB細胞に対しても 変わらず殺細胞作用を 示す G row th ra te G row th ra te

A _{IC50 (nM)}

hyptoside etoposide S1T 4.7 30.6 KB-3・1 7.0 118.9

KBABCC1 8.2 (x1.17) 3397.8(x28.6)

Hyptoside Overcomes Multi-drug Resistancy.

B _{IC50 (nM)} hyptoside etoposide S1T 6.3 7.7 K562 4.2 15.3 K562/ABCG2 8.2(x1.95) 229.7(x29.8) IC50 (nM) hyptoside etoposide S1T 4.7 29 KB-3・1 7.7 36 KBG2 7.7(x1.0) 850(x23.6) C MRP1 (ABCC1) BCRP (ABCG2) MDR1 (P-glycoprotein) (ABCB1)

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天然植物由来の新規化合物 hyptosideを分離同定した

リンパ系腫瘍細胞株および骨髄系腫瘍細胞株に対して

抗腫瘍作用を持つ

固形がん細胞株に対しても抗腫瘍作用を示す

抗腫瘍作用は、G2 arrest 誘導を介している

いわゆる多剤耐性株に対しても抗腫瘍作用を示す

以上より、難治性悪性腫瘍、再発性悪性腫瘍に有効性が

示唆される

まとめ

検討中の課題

• 天然のHyptosideと同一の構造を持つ化合物の合成

– Hyptosideの生物活性の確認。腫瘍細胞と正常細胞に対す

る毒性の確認

• 置換基の異なるHyptoside類縁体の合成

– Hyptosideよりも強い抗腫瘍性を示す化合物を作る。

– 置換基の種類と位置が生物活性にどのような影響を与える

か。

Hyptosideの期待される用途

難治性悪性腫瘍、再発性悪性腫瘍に有効性が

期待される

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実用化に向けた課題

モデルマウスでの有効性の確認

前臨床試験における動物での耐用性、副作用

の確認

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特許出願情報

PCT出願番号： PCT/JP2012/083379

PCT出願日： 2012年12月25日

発明の名称： 抗腫瘍剤及びその製造法

指定国：全指定（日本含む）

出願人：国立大学法人 鹿児島大学

お問い合わせ先

鹿児島大学

産学官連携推進センター 知的財産部門

ＴＥＬ:０９９－２８５－３８８１

ＦＡＸ:０９９－２８５－３８８６

e-mail:

tizai@kuas.kagoshima-u.ac.jp