制癌に関する実験的研究

278 金沢大学十全医学会雑誌 第63巻 第2号 278−285 （1959）

制癌に関する実験的研究

第9報 異処的投与法によるBis（2−hydroxy−3，5−dibromophenylazo）

    一n−propylphloro91ucino1〔Azo−106〕の抗腫瘍性の検討米

金沢大学医学部薬理学教室（主任 岡本 肇教授）

金沢大学結核研究所化学部（主任 越村三郎教授）

    宮  地  民  子

     （昭和34年8月18日受付）

＊本研究費の一部は文部省科学研究費癌綜合研究の補助金によった．

 2，2 一Dihydroxyazobenzene系諸誘導体を指向し た癌化学療法の実験的研究において，さきに平田1）

によってBis（2−hydroxy−3，5−dibromophenylazo）一n−

propylphloroglucino1〔Azo−106〕がエールリッヒ腹水 癌移植マウスに対し顕著な抗腫瘍性効果を呈する物質 であることが見出され，次いで聞もなく本物質は又吉 息肉腫，サルコーマ1802）及び白血病SN 363）に対 しても効果的であるという実証＊＊がもたらされた．

 ところで今，これら研究における実験方法について 見ると，そのいずれにあっても腫瘍細胞を腹腔内移植 した動物に対し被検物質の腹腔内投与を行なうという 方式が適用されているのであるが，このことと，現在 悪性腫蕩に対する実験化学療法研究の分野では決定的 なスクリーニング法なるものがなく，効果判定の手段 として各人により各様の方式が提案，採用されている 状態で4）一9）あることに鑑みるとき，Azo−106にあっ ても亦その制癌物質としての性格に関する諸他の実験 方式による検討が要請されていることは申すまでもな いところである，

 即ち私は前記平田等の研究に続行し，ここに腫瘍細 胞（エールリッヒ癌並びにサルコーマ180）の移植止 処に対しAzo−106の投与部位を異にせしめるという 方式による吟味実験（即ち換言すればAzo−106には 流血を介しての効果性があるか否かの考査）に着手し

たわけである．

以下その成績を報告する．

工．腹水腫瘍における実験

 吉田肉腫，エールリッヒ癌及びサルコーマ180等の 腹水腫瘍細胞を腹腔内移植した動物に対し，移植24時 間後からAzo−106を直接腹腔内に投与するという方 式の実験で，宿主動物における生命の著しき延長或い は完全治癒の成績が得られたことについては既に報告 されたところである．

 しからばかかる腫瘍移植動物に対し，Azo−106を直 接腹腔内に投与せずに，腫瘍細胞移植の場所とは蕪関 係な遠隔の部位に投与したらばどうであろうか？

 本問題に対する吟味検：討の第一着手として，エール リッヒ癌及びサルコーマ180を対象とし，まずマウス に対しそれぞれの腫瘍細胞の腹腔内移植を行ない，次 いでAzo−106を皮下投与或いは西明投与して治療す る実験を行なった．

 A．腫瘍細胞の腹腔内移植マウスに対するAzo−106    皮下投与の治療実験

  実験方法

 1．使用動物：体重17〜219の純系マウス（ddN，

δ）を使用し，1群10匹宛とし，10群を用意する．

 2．Azo−106溶液の調製：Azo−106の12．Omg

＊＊エールリッヒ腹水癌移植動物を対象とするAzo−106， Thio−TEPA， BCM，6−Mercaptopurine， Carzinophyllin，

Mitomycin C，及びActinomycin J等の制癌実験の成績については文献2）を参照のこと．

 Experimental Anticancer Studies． Part 9 Test for Tumor−inhibitory Action of Bis（2−

hydroxy−3，5−dibromophenylazo）一n−propylphloroglucion1（Azo−106）Administered in a Part of Body Remote from the Site of Tumor Implantation in Mice． Tamiko Miyaji Department of Pharmacology（Director：Prof． H． Okamoto）， School of Medicine， Kanazawa University；

Departnlent of Chemistry（Director：Prof． S Koshimura）， Researcb Institute of Tuberculosis，

Kanazawa University

を秤取し，これを：NNaOH 2〜3滴の添加のもとに 滅菌生理的食塩：水15ccに溶解せしめた（0．2mg／0．25

cc）．

 3．腫蕩細胞懸濁液の調製3

 i）エールリッヒ癌細胞懸濁液＝約1，500万個の エールリッヒ癌細胞を腹腔内移植した純系マウスか ら，移植10日目に腹腔穿刺により潴溜腹水を採取し，

これを約2倍量の滅菌食塩水（少量のペニシリン添加）

中に混和す．この混液についてまずcell countを行な い，次いでその腫瘍細胞数に応じて4，000万／ccとな るように滅菌食塩水を追加した．即ち本懸濁液0．2cc は癌細胞800万個を含有す．

 ii）サルコーマ180細胞懸濁液：サルコーマ180 細胞の約2，000万個を純系マウスの腹腔内に移植し てから14日目に腹水を採集し，これをエールリッヒ癌 細胞懸濁液調製の場合と同様に処理して5，000万／cc 懸濁液とした．即ち本懸濁液0．2ccはサルコーマ180 の細胞1，000万個を含有す，

 4．実験術式：

 i）移植： 5群の動物に対し一斉にエールリッヒ 癌の細胞懸濁液0．2cc（移植細胞数は800万個）宛の 腹腔内移植を行ない，他の5群の動物に対しては一斉 にサルコーマ180の細胞懸濁液0．2cc（移植細胞数は 1，000万個）宛の腹腔内移植を行なう．

 ii）Azo−106の投与：

 a）エールリッヒ癌細胞移植動物群のうち1群（V）

を対照とし，この群の各動物には移植1時間後に滅菌 食塩水0．25cc宛の第1回背部皮下注射を行ない，翌

日より1日1回宛6日間に亘って同様の注射を行な う．而して他の4群1，皿，皿及びW）は治療実験用 とし，腫蕩細胞を移植してから工群では1時間後に，

皿群では24時間後に，皿群では48時間後に，又W群で は72時間後に．それぞれの動物に対しAzo−1060．2mg／

o．25cc（即ちMTD≒o．8mg／20g mouse， sb．の砥量：）

をもってする第1回の皮下注射を行ない，以後1日1 回宛6日間連続して同様の処置を行なう．

 なお注射は背部皮下の左右に対し隔日交互せしめて 行なった．

 b）サルコーマ180細胞の移植動物群における治療 実験も亦前記a）の方式に準じて行なった．

 5．判定：全実験動物は最後（第7回目）の注射を 行なってから以後何らの処置をも施さずに正常の飼育 管理下に置き，その生存状況を一途中発死したマウ スは剖検：によって腫瘍死（腹水潴溜並びに腫瘍浸潤の 有無及びその程度）か否かを確かめながら一逐日観 察した．而して最後に晶群についてその動物の平均生

存旧数（及び50％生存日数）を求めた．

  実験成績

 Fig． Iaはエールリッヒ癌の腹腔内移植マウスに対 するAzo−106（0．2mg／day／mouse）の皮下投与にお ける実験の成績を生存曲線をもつて示したものであ

る．

 即ち本図では

 1）対照群（V）マウスは癌細胞移植後18日以内に 全部腫瘍死しており，その平均生存日数は14・9日

（50％生存日数は15日）であるに対し，

 2）移植1時間後及び24時間後からAzo−106を皮 下投与した実験群1及び皿にあっては動物の平均生存 日数はそれぞれ19．7日及び22・2日（50％生存日数 はそれぞれ18日及び22日）であって，軽度ながら平均 生存期間の延長が現われている．

 3）しかし移植48時間後及び72時間後から治療を開 始した実験群皿及びIVでは，そのいずれにあっても生 存日数の関係においては対照群のそれに対比して全く 差異するところがないという所見である．

 而してFig． Ibはサルコーマ180の腹腔内移植マ ウスに対するAzo−106の皮下投与における実験成績 を示したものであって，この場合は前記工一ルリッヒ 癌細胞における程ではないが，サルコーマ180移植1 時間後並びに24時間後にAzo−106による治療を開始

した実験群1及び皿において平均生存期間が僅かに延 長しているを見る．

 B．腫瘍細胞の腹腔内移植マウスに対するAzo−106    の経ロ投与の治療実験

  実験方法

 1．使用動物：ddNマウス（17〜20g，δ）を使用，

1群10匹宛とし治療並びに対照の2群を用意する．

 2．Azo−106内服液の調製＝Azo−106はトラガン ト漿をもつて乳剤となして経口的に投与す．即ちま ずAzo−106の45mgを乳鉢にとり2〜3滴の95％ア ルコールをもつて研磨細粉化す．次いで，これに0．5

％トラガント漿の少量宛を加えつつ研磨の操作を続 け，最後にトラガント漿をもつて全量15ccとす．本 乳剤0．5ccはAzo−1061．5mgを含有す．

 本乳剤はこれを1ccの注射筒に吸引し，その0．5cc 宛を特製の高富細管を介して直接試獣の胃中に注入せ しめた．対照群動物には0．5％トラガント漿0．5cc宛 を投与す．

 3．腫瘍細胞懸濁液の調製：前項Aにおけると同 様にしてエールリッヒ癌細胞2，500万／cc及びサルコ

ーマ180細胞4，000万／ccの懸濁液を調製す．

 4．実験術式：

280 _宮

 i）まず2群の全動物に対し一斉にエールリッヒ癌 細胞懸濁液0．2cc宛の腹腔内移植を行なう．移植6 時間後に治療群に，あってはAzo−106懸濁液0．5cc

（L51ng Azo−106／0．5cc／1uouse）をもってする第i回 の経論投与を行ない，以後同様の処置を1日1回宛2 日聞連続せしめ，4日目に1日の休止日を置き，第5 日目から3日間に亘り1日1回Azo−106懸濁液0．5 cc宛の投与を行なう．

 対照群に．対しては同様の方式で0．5％1トラガント漿 0．5cc宛の経口投与を行なう．

 ii）サルコーマ180細胞移植動物群に．おける治療実 験も亦上記i）の方式に準じて行なった．

 5．判定：前述の1−A項実験と同様．

  実験成績

 Fig．五a及びII：bに示したように，エールリッヒ癌 における実験では治療動物群の平均生存臼数は対照動 物群のそれに対比して2日間延長しており，又サルコ ーマ180における実験では治療群の平均生存日数は 対照群のそれに対比して4日間程延長しているを見

る．

 而してこの実験ではAzo−106それ自体を直接トラ ガント喪中に1．5mg／0．5ccに懸濁せしめたものを内 服せしめたのであるが，他方，Azo、106を一旦脳a一 塩の濃厚水溶液とし，次いでこれを0．5％トラガント 漿に1．2mg Azo−106／0．3cc（即ちMTD≒4mg／209 mouse， pef os，の％量）の濃度としたものを内服せし めた実験でもFig．∬a及び皿bに類似した成績が得

られた．

皿．結節型腫塩における実験

 前項工のAzo−106による治療実験は，それが皮下 投与法によったものたると北画的投与法によったもの とを問わず，いずれも腹腔内に腫瘍移植を行なった動 物を対象として行なわれたのであるが，しからば皮下 結節腫瘍の動物を対象とした場合は如何。即ちこのこ とに対する検討とし七，腫瘍細胞の鼠隈部皮下移植に よって起る腫瘤形成に及ぼすAzo−106の影響をその 腹腔内投与と背部皮下投与の両場合について考査し

た．

 A．腫瘍細胞の皮下移植マウスに対するAzo−106    腹腔内投与の治療実験

  実験方法

 L実験材料＝体重18〜2igの純系マウス（d己：N）

を使用す．而して注射用Azo−106溶液（0．2mg／0．25 cc），及び腫瘍細胞懸濁液（エールリッヒ癌細胞では 4，800万ノcc，サルコーマ180細胞では5，400万／cc）

地

は前項i−Aにおけると同様にして調製す．

 2．・実験術式；

 i）エールリッヒ癌における実験：まず5群（1群 10匹宛）の動物に．対し一斉にその左鼠隈部皮下に960 万細胞／0．2㏄／mouseの移植を行なう．次いで1群 では1時間後に，皿群では24時間後に，皿群では48 時間後に，F群では72時間後に， Azo−106の0・21ng／

0．25君cγ加σuse〈LD50二〇．8m君／2091箪ouse2」・P・の％

量）をもってする第i回目の腹腔内投与を行ない，以 後各群に対しそれぞれ1肩1回宛Azo−106の0．2m9

／0．25cc／mouseの腹腔内投与を6日間に亘って連続

せしめた．

 なお腹腔内注射は毎常右側腹部より行なった．

 ii）サルコーマ180における実験： i群が12匹宛 であり，サルコーマ180の移植細胞数が810万／0・15 cc／mouseである点が異なっているだけで，その他の 方式は前記i）と同様．

 3．判定；エールリッヒ癌における実験では12日 目に，又サルコーマ180における実験では移植後14日 目にそれぞれにおける全群の動物をクロロフォルムで 殺して，腫瘤の摘出を行なう．而して各摘出腫瘤につ いては，まずその重量を測定し，各群における平均重 量を求む．：最後に各腫瘤の大きさの相対的関係を示す べく摘出腫瘤を魚群毎に整列せしめて撮影す（Fig．

皿a及び皿bに示した腫瘤の大きさはこの写真像に

基づいたもの）．

 因に結節型腫瘍（solid tumor）を対象とする薬物の 抗腫瘍試験では各研究者によってそれぞれの実験方式 なり或いは効果判定の基準としている点で異なってい るところがあるが，一般に効果判定には腫瘍の直径を caliperで測定し4），実験群平均値／対照群平均値の百 分率が求められていた場合が多い．しかしながら最近 腫瘤の平均重量比をもつて効果の有無を表示せんとす る傾向もあるので，本研究ではこの表示法を採用する ことにした訳である10）・11）．

  実験成績

 Fig．皿aはエールリッヒ癌の結節型腫瘍形成に対す るAzo−106の腹腔内投与による治療実験の成績を展 示したものである．

 まず本座を一目して腫瘤像（size）の大きさの関係 では大体

 V群（対照）≧IV群〉皿群〉皿山≧1群

の順であることが感知されよう．而して同様の関係が 又各自における腫瘤の平均重量の方からも看取され る．即ち対照群における平均重量が0．679であるに 対し，治療開始が移植1時間後に行なわれた1群にあ

つては，対照群の約駈即ち0．169であるに過ぎず，

しかも24時間後治療開始の国論においても亦大体これ に類する成績が得られている．しかし治療開始が移植 48時間後に行なわれた晶群では成績が劣り，平均重量 は0・29g（即ち対照群の約施）の値を示し，更に72時 間後からの治療群（IV）では，平均重量は0．619で 対照群における値との間に殆んど差異がないといった 所見である．

 他方，サルコーマ180の結節型腫瘍形成に対する Azo−106の腹腔内投与における実験成績はFig．皿b に示した．即ち本図では移植1時間後から治療を開始

した1群では対照に較べて明らかに成績良好であり，

平均重量では前者が0．339で，後者の0．929に対し て約％に過ぎないこと，及び治療開始が移植24時間 後，48時問後，及び72時間後に行なわれた皿，皿及び IV群では，それぞれの成績間に大した差異はないが，

それでも対照群に比すればよい成績（平均重量比は約

％）が得られていることに注目すべきであろう．

 B．腫瘍細胞の皮下移植マウスに対するAzo−106    皮下投与の治療実験

  実験方法

 1．使用動物3体重17〜199の純系マウス（ddN）

を使用，1群8画面とする．

 2．Azo−106溶液の調製3前項1−Aにおけると 同様にして調製する．

 3．腫瘍細胞懸濁液の調製：前項1−Aに準じて，

エールリッヒ癌では1，200万／0、2cc／mouse，又サルコ ーマ180では900万／0・2cc／mouseなる如くした．

 4．実験術式3第皿一A項の実験方式に準じて行 なう．即ち腫島細胞懸濁液0．2ccをマウスの密婦隈 部皮下に移植．Azo−106の1回の投与量は0．2mg／

0．25ccとし，注射部位は背部皮下．移植後から第1 回のAzo−106注射までの時間がそれぞれ1，24，48 及び72時間なる4群を置き，いずれも以後1日1回宛 6回のAzo−106注射（背部皮下の左右へ各回交互に）

を行なう．

 5．判定3前項皿一Aに準ず．但し腫瘤重量の測 定はエールリッヒ癌及びサルコーマ180のいずれの場 合にあっても移植後3週間目に行なった，

  実験成績

 Fig． IVaはエールリッヒ癌細胞の皮下移植マウスに 対し，Azo−106を皮下投与した実験の成績である．

 即ち対照群（V）における腫瘤の平均重量が2．349 であるに対し，Azo−106の投与が移植1時間後より行 なわれた1群にあっては約施の0．839，又治療開始が 24時間後（11群），48時間後（皿群），及び72時間後

（IV群〉のものではいずれも％程度（それぞれ1．069，

LO19及び1．079）という成績であることを見る．

 しかもこれと大体同様関係の成績がFig、 VI b提示 の如く，サルコーマ180における実験でも得られてい た（腫瘤の平均重量は1群で0・639，∬群で0．889，

皿群で1．15g， IV群でL10gであるに対し，対照の V群では1．999）．

総括並びに考按

 Table Iは以上各項に亘って述べてきた成績につい て，それらの相互関係の理解に便ならしめるために総 括したものである．

 今本表を一瞥すると，今回行なわれた異処的投与法 によるAzo−106の七一ルリッヒ癌並びにサルコーマ 180に対する抗腫瘍性の検討では

 1）腫瘍細胞の腹腔内移植マウスに対するAzo−106 の皮下投与による治療実験（工一A）

 2）腫瘍細胞の皮下移植マウスに対するAzo−106 の腹腔内投与による治療実験（皿一A），並びに  3）腫瘍細胞の皮下移植マウスに対するAzo−106 の皮下投与による治療実験（皿一B）

 のいずれにおいてもAzo−106（投与量は0．2mg／

day／mouse，7回）による治療開始の時間が早期であ るもの程治療成績が良好であるという点で一致してい るのであるが，これはまさにAzo−106の抗腫瘍性の 顕現であること，換言すれば即処的に投与されたAzo

−106が流血を介して腫瘍細胞の増殖に対し抑制の効 を示したためであることの証左といえよう．

 他方，実験1−BのAzo−106の経口的投与による 治療実験にあっては，

 1）治療開始が腫瘍細胞の腹腔内移植後6時間目で ある場合についての考査のみであること，及び  2）治療動物群の対照動物群に対する平均延命日数 が2〜3日（Table工では士）であること

 に想到するならば，もしこの実験のみが単独に行な われたような時は，或いはこの成績は実験誤差の範囲 内にあるともいえよう．しかし，｝A，∬一A及び 丑一Bの各抗腫瘍実験の成績から推して，この経口投 与の実験成績も亦Azo−106の抗腫瘍性の現われであ ると解しても支障がないところであろう．

 ところで，ここに注記すべきことは，さきに平田及 び岡本等はエールリッヒ癌細胞を腹腔内に移植した後 24時間を経てからAzσ一106の腹腔内投与による治療 を行なった制癌実験で生存率に．おいて60〜90％にも 及ぶという顕著な抗腫瘍成績を得ているに対し，今回 のAzo−106の異処的投与による制癌実験ではその抗

282 _{宮 地}

腫瘍成績が甚だしく劣っていることであろう．しかし

今，

 1）前者のような腹腔内移植に対する腹腔内投与の 実験方式では，たとえ24時間内に腫瘍細胞の一部が既 に組織内へ侵入したものがあろうとはいえ，大部分の 腫瘍細胞は高濃度のAzo−106の直接的影響を蒙るで

あろうこと，しかるに

 2）後者のようなAzo−106の異言的投与による制 癌実験では，Azo−106が一旦投与箇処から血流に吸 収され，しかる後遠隔部位にある腫瘍細胞に作用する のであるから，Azo−106の作用濃度は甚だしく稀薄 であろうこと，

 に思いを致すならば，両者間で抗腫蕩物質の効果が 懸絶して現われることはむしろ当然のことと理解し得 るところであろう．

結 語

 本研究ではBis（2−hydroxy−3，5−dibromophenyi−

azo）一n−propylphlofoglucinol〔Azo−106〕について，

これを腫瘍細胞（エールリッヒ癌並びにサルコーマ 180）の移植部位から遠隔した体部に適用する時，果 して抗腫瘍効果を期待し得るであろうかについて次の ような諸方式での考査が行なわれた：

1．腹水腫瘍を対象とし，延命効果で判断する実験  A．腫蕩細胞の腹腔内移植マウスに対するAzo−106    の皮下投与の影響

 B．腫瘍細胞の腹腔内移植マウスに対するAzo−106    の経口投与の影響

皿．結節型腫瘍を対象とし，腫瘤増大に対する抑制効   果で判断する実験  ．

 A．腫瘍細胞の鼠隈部皮下移植マウスに対する    Azo−106の腹腔内投与の：影響

 B．腫瘍細胞の鼠隈部皮下移植マウスに対する

   Azo−106の背部皮下投与の：影響

 そして，以上の各検討実験を通じて，Azo−106によ る治療開始が早期である場合に生存日数の延長，或い は腫瘤増大の軽少が招来されるという点で一致してい

る成績が得られ，こ、こにこれらの成績に対する多角的 判断の結果としてAzo−106には流血を介してもエー ルリッヒ癌並びにサルコーマ180に対し抗腫瘍効果を 呈する性能があると論結されるに至った訳である．

丈 献

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Suppl。1，53 （1953）．

       Abstract

 Using Ehrlich ascites carcinoma， and Sarcoma 180， as the implantation material to mice，

followig series of anticancer experiments were designed：

 1．Experiments on animals implanted with tumor cells intraperitoneally．

 a）Ef〔ect of subcutaneous administration of Azo−1060n the life−span of the animals．

 b）Effect of oral administration of Azo−1060n the life−span of the animals．

 2．Experiments on animals implanted with tumor cells subcutaneously in the left groin．

 a）Effect of illtraperitoneal administration of Azo−1060n the growth of tumor．

 b）Effect of subcutaneous administration of Azo−1060n the growth of tumor．

 Summing up the results obtained in all these experiments（cf． Table I）， it was concluded that Azo−106， even when it is administered at a place distant from the tumor， exerts an inhibitory activity against the tumors．

Table I･ Summary ^of Results

Exp. No.

I

I[

A

B

A

B

Kind of  tumor

implanted

 Ehrlich    .carcmoma

Sarcoma   180

 Ehrlich    .carclnoma

Sarcoma   180

 Ehrlich carcinoma

Sarcoma   180

 Ehrlich carcinoma

Sarcoma   180

Experimental ^conditions   Site of

 tumor cells implantation

=>as

oqo

‑

‑T‑tuO

A_N

‑:

,!a

‑^en₅>

oqoN

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Place of administ‑

ration of Azo"‑ 106

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‑so

A₅

en

Results of anticancer experiments The time of begining of

treaement with Azo‑106 tumor‑cells implantation

after

1 hr

+

±

.

.

'i‑l'

+ + +

6 hrs

.

.

±

±

.

.

,

.

24 hrs

+

±

.

.

+

±

+ +

48 hrs

.

.

+

±

+

± 72 hrs

pt

.

.

pt

±

+

±

Control

.

‑

Remarks

  O.

veal'SgS"g/g;/ts/ti'an‑..111"s, o 1

i･9k.i,g,kvg

U o.

/g,g,,/L.zlk/lg,1'

･,g･.viliiiglZiti,

Fig.la Effect cif Subcutaneous Adminislrrcition of Azo‑106     ofi AscMc Tumor df Ehrtich thrcinopmq in SVIice

 lnotatatioft : Eignt miUioft tumor ceUs vvere imptartted to each. ntotLse        }rttrtLperitoneatly.

 Tretrtmeptt : Each animat of the tnded groups receJved a daity smbctitineous        dose di' o.2mg AEe‑106 (,n o 2scc) fer 'T saccessive days.

       :ach opritrot antmat received a datty sul)cutafteous iqjectibn        of o.2S cc tif' satme for Y successive days.

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        LatroperitoneaUy

 TreatmefrtJ : Each attiptaL ofVie treetea crours receivedi a daity subcntaneeus         dese uf o2 mg A2o ‑I06 (in o2Scc ) forV successive days,         Each coftrroL aftinat received a daily subcutafteous injeetion         of olgcc df sahne fbr Y suceessive dqys

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