Title "Pseudochoricystis
ellipsoidea"の窒素栄養欠乏下における窒素安定同位体を用いたタンパク質分解物の代謝解析 Sub Title
Author 田中, 美穂(Tanaka, Miho) Publisher 慶應義塾大学湘南藤沢学会 Publication year 2012
Jtitle 生命と情報 No.19 (2012. ) ,p.41- 44
Abstract オートファジーは飢餓時に細胞質のオルガネラやタンパク質を液胞で低分子へとバルク分解する 機構であり, 細胞は分解されたアミノ酸をタンパク質合成に再利用することで飢餓に応答すると考 えられている。緑藻"Pseudochoricystis ellipsoidea"は,
窒素栄養欠乏(-N)下で中性脂質の一種であるトリアシルグリセロールを蓄積する。また, 真核生物では飢餓時にオートファジーが誘導されることから, "P. ellipsoidea"の- N下においてもオートファジーによるタンパク質分解がおこり,
分解されたアミノ酸はタンパク質合成に再利用されている可能性がある。一方で, この際にタンパク質量とアミノ酸プールが顕著に減少することから,
分解されたアミノ酸はタンパク質合成以外にも代謝されていることが考えられるが, 利用先については知見が乏しい。
本研究では"P. ellipsoidea"の-N下におけるタンパク質分解の仮説を検証し, さらに分解物がどの代 謝物へ再利用されているのか明らかにすることを目的とした。唯一の硝酸源である15N03を用い てタンパク質を窒素安定同位体標識させた細胞を作出し, -N下に移行後,
経時的にタンパク質と遊離アミノ酸のラベル率を測定したところ,
遊離アミノ酸のラベル率が増加し, タンパク質分解が確認された。さらに、アミノ酸以外に同位体 が検出された窒素代謝物を網羅的に解析したところ,
ArgやLysの分解経路上の物質から標識が検出された。このことから, 窒素がない状態においていくつかのアミノ酸は,
アンモニアとして窒素源を排出するかアミノ基転移をすることで, 炭素骨格へ分解されると推測された。
Notes 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2012年度学生論文集 修士論文ダイジェスト
Genre Technical Report
URL http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000019 -0041
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"Pseudochoricystis ellipsoidea"の窒素栄養欠乏下における窒素安定同位体 を用いたタンパク質分解物の代謝解析
政 策 •メ デ ィ ア 研 究 科 修 士 課 程 2年 田 中 美 穂
要旨
オ ー ト フ ァ ジ ー は 飢 餓 時 に 細 胞 質 の オ ル ガ ネ ラ や タ ン パ ク 質 を 液 胞 で 低 分 子 へ と バ ル ク 分 解 す る 機 構 で あ り ， 細 胞 は 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 を タ ン パ ク 質 合 成 に 再 利 用 す る こ と で 飢 餓 に 応 答 す る と 考 え ら れ て い る . 緑 藻 “/*
sew
ゴoc
/ioWc
ァ池ど//扣o
/Je
ゴ’は， 室 素 栄 養 欠 乏 （-N
) 下 で 中 性 脂 質 の 一 種 で あ る ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル を 蓄 積 す る .ま た ， 真 核 生 物 で は 飢 餓 時 に オ ー ト フ ァ ジ ー が 誘 導 さ れ る こ と か ら， “P
の-N
下 に お い て も オ ー ト フ ァ ジ ー に よ る タ ン パ ク 質 分 解 が お こり， 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 は タ ン パ ク 質 合 成 に 再 利 用 さ れ て い る 可 能 性 が あ る .一 方 で ， この際に タ ン パ ク 質 量 と ア ミ ノ 酸 プ ー ル が 顕 著 に 減 少 す る こ と か ら ， 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 は タ ン パ ク 質 合 成 以 外 に も 代 謝 さ れ て い る こ と が 考 え ら れ る が ， 利 用 先 に つ い て は 知 見 が 乏 し い .
本 研 究 で は ”户
e
//抑 ゐ ゴ ’の-N
下 に お け る タ ン パ ク 質 分 解 の 仮 説 を 検 証 し ， さ ら に 分 解 物 が ど の 代 謝 物 へ 再 利 用 さ れているの か 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た .唯 一 の 硝 酸 源 で あ る15N 0
3を用 いてタ ン パ ク 質 を 窒 素 安 定 同 位 体 標 識 さ せ た 細 胞 を 作 出 し ， -N
下 に 移 行 後 、 経 時 的 に タ ン パ ク 質 と 遊 離 ア ミ ノ 酸 の ラ ベ ル 率 を 測 定 し た と こ ろ ， 遊 離 ア ミ ノ 酸 の ラ ベ ル 率 が 増 加 し ， タ ン パ ク 質 分 解 が 確 認 さ れ た . さ ら に 、 ア ミ ノ 酸 以 外 に 同 位 体 が 検 出 さ れ た 窒 素 代 謝 物 を 網 羅 的 に 解 析 し た ところ，
Arg
やLys
の 分 解 経 路 上 の 物 質 か ら 標 識 が 検 出 さ れ た .こ の こ と か ら ， 窒 素 が な い 状 態 に お いていくつ か の ア ミ ノ 酸 は ，ア ン モ ニ アと し て 窒 素 源 を 排 出 す る か ア ミ ノ 基 転 移 を す る こ と で ， 炭 素 骨 格 へ 分 解 さ れ る と 推 測 さ れ た .キ ー ワ ー ド ：
1•オ イ ル 生 産 微 細 藻 ， 2 .窒 素 栄 養 欠 乏 ，3 . オ ー ト フ ァ ジ ー ， 4.窒 素 安 定 同 位 体 ， 5. メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析
略 語 ：2-0 G : a -ケ ト グ ル タ ル 酸 ，Ac-CoA :ア セ チ ルCoA， Ala : ア ラ ニ ン， Arg :ア ル ギ ニ ン ，
Asp : ア ス パ ラ ギ ン 酸， Asn : ア ス パ ラ ギ ン， Cys ••シ ス テ イ ン， Gin : グ ル 夕 ミ ン， Glu : グ ル タ ミ ン 酸， GW :グリ シン， His : ヒ ス チ ジ ン， lie : イ ソ ロ イ シ ン， Leu : ロ イ シ ン， Lys : リジン， Met : メ チ オ ニ ン， Ox : オ キ サ ロ 酢 酸， Phe : フ エ ニ ル ア ラ ニ ン， PI : ホ ス フ ア チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル， Pro : プ ロ リ ン， Ser :セ リ ン， Su : コ ハ ク 酸 ， S u - C o A :ス ク シ ニ ルCoA, T h r :ス レ 才 ニ ン ，T r p :トリプトフアン，T y r :チ ロ シ ン ，VaJ: パ リ ン
1
. 序 論緑 藻 “/ ^
w
ゴ 沿e
//z
>so
/ぬゴ，は ， 窒 素 栄 養 欠 乏 （-N
) 下 で ト リ ア シ ル グ リ セ ロ 一 ル (TAG
) を 蓄 積 す る （Satoh
が < 2010) . しかし，-N
下 で の ス ト レ ス 応 答 やTAG
蓄 積 の 代 謝 制 御 機 構 は 不 明 で あ る . -N
下 でTAG
を 蓄 積 す る い く つ か の オ イ ル 生 産 微 細 藻 に お い て ， -N
下 で は 新 規 の ア ミ ノ 酸 合 成 の 低 下 （Msanne
がa
/., 2 0 1 2 ) ， ま た ア ミ ノ 酸 プ ー ル や タ ン パ ク 質 量 の 減 少 が 調 べ ら れ て い る（ Ito ef a
/.，2012;B
6lling and Fiehn
, 2005;Hu and Gao
, 2006) .オ ー ト フ ァ ジ ー は 飢 餓 時 に 細 胞 質 の オ ル ガ ネ ラ や タ ン パ ク 質 を 液 胞 で 低 分 子 へ と バ ル ク 分 解 す る 真 核 生 物 で 広 く 保 存 さ れ た 機 構 で あ り （
M izushim a
, 2 0 0 7 ) ， 緑 藻 の モ デ ル 生 物 で あ る C h lam ydom onas rein h ardtiiの - で も オ 一 ト フ ァ ジ 一 が 誘 導 さ れ る （P
6rez
-P
さrez W a
/.，2 0 1 0 ) . 酵 母 で は -N
下 で ア ミ ノ 酸 プ ー ル が 一 時 的 に 増 加 す る と タ ン パ ク 質 合 成 が 促 進 し た こ と か ら ， 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 が タ ン パ ク 質 合 成 に 再 利 用 さ れ る こ と が 示 さ れ て い る（ Onodera and Ohsumi
,2 0 0 5 ) . こ の こ と か ら ， 飢 餓 時 に 誘 導 さ れ る オ ー ト フ ァ ジ ー は ， タ ン パ ク 質 合 成 の ア ミ ノ 酸 を 供 給 す る こ と で ， 飢 餓 に 適 応 す る 役 割 が あ る と 考 え ら れ て い る . “/ 從 ”の -
N
下 に お い て も オ ー ト フ ァ ジ ー に よ る タ ン パ ク 質 分 解 が お こ り ， 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 は タ ン パ ク 質 合 成 に 再 利 用 さ れ て い る 可 能 性 が あ る . 一 方 で タ ン パ ク 質 量 と ア ミ ノ 酸 プ ー ル が 顕 著 に 減 少 し た こ と か ら（ Ito W a
/., 2 0 1 2 ) ， タ ン パ ク 質 分 解 に よ り 供 給 さ れ た ア ミ ノ 酸 は タ ン パ ク 質 合 成 以 外 に も 代 謝 さ れ て い る こ と が 考 え ら れ る . し か し ， 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 の 利 用 先 に つ い て は ， タ ン パ ク 質 合 成 以 外 に 調 べ ら れ て い な い . オ ー ト フ ァ ジ ー の モ ニ タ ー 方 法 に は ， オ ー ト フ ァ ジ ー に 必 須 で あ る オ ー ト フ ァ ジ ー関 連タ ン パ ク 質 8 (ATG
8 ) の 脂 質 修 飾 を 検 出 す る 方 法 が 利 用 さ れ て い る が （M izushima
,2 0 0 4 ) , 物 質 分 解 を 物 質 レ ベ ル で 直 接 的 に モ ニ タ ー す る 長 寿 命 タ ン パ ク 質 分 解 ア ッ セ イ 法 も あ る
(Klionsky d d
20〇7 ;U eno
がa
/. 2 0 0 8 ).
例 え ば ， [14C
]Val
の 放 射 性 同 位 体 で 長 時 間 培 養 す る こ と で 細 胞 内 の タ ン パ ク 質 を 標 識 し た 後 ， 非 標 識 のVal
で 短 時 間 培 養 す る こ と で ， 置 換 に 時 間 の か か る タ ン パ ク 質 は 標 識 さ れ た ま ま ， 遊 離 のVal
は 非 標 識 さ れ た 細 胞 が で き る . こ れ に 飢 餓 や 薬 剤 添 加 と い っ た 処 理 を 施 し ， そ の 後 ， 細 胞 質 や 培 地 中 に 放 出 さ れ た 物 質 の 放 射 線 量 を 測 定 す る こ と で ， 夕 ン パ ク 質 分 解 率 を 定 量 す る こ と が で き る . こ の 手 法 は ほ 乳 類 や 酵 母 で 古 く か ら 利 用 さ れ て い る が ， 単 一 の ア ミ ノ 酸 で タ ン パ ク 質 を 標 識 し て い る た め ， タ ン パ ク 質 か ら 分 解 さ れ た 全 て の ア ミ ノ 酸 の 代 謝 を 追 跡 す る こ と が で き な い .本 研 究 で は
e
//如 〇/ふゴ’の -N
下 に お け る タ ン パ ク 質 分 解 の 仮 説 を 検 証 し ， さ ら に 分 解 物 が ど の 代 謝 物 へ 再 利 用 さ れ て い る の か 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た . そ の た め に ， 長 寿 命 タ ン パ ク 質 分 解 ア ッ セ イ 法 を 参 考 に 安 定 同 位 体 に よ り 標 識 さ れ た 化 合 物 を 細 胞 内 に 取 り 込 ま せ て メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析 を 行 う . 本 手 法 で は ， 唯 一 の 硝 酸 源 で あ るi
5N
〇3を 用 い て タ ン パ ク 質 を 窒 素 安 定 同 位 体( 15N) ，遊 離 ア ミ ノ 酸 を ， と な る よ う に 標 識 さ せ た 細 胞 を 作 り 出 し ， そ の 後 _ N 下 で 培 養 し た 細
胞 に お け る タ ン パ ク 質 と 遊 離 ア ミ ノ 酸 の 丨 4
N
と15N
の 割 合 を 測 定 す る こ と で タ ン パ ク 質 分 解 を 検 証 す る . ま た ， 分 解 さ れ た ァ ミ ノ 酸 は 同 位 体 標 識 さ れ て お り ， 同 位 体 が 検 出 さ れ た 窒 素 代 謝 物 を 網 羅 的 に 解 析 す る こ と に よ り ， 同 時 に -N
下 に お け る 窒 素 代 謝 物 の 分 配 を 明 ら か に す る こ と が で き る と 考 え て い る .2
. 材 料 と 手 法 論 文 投 稿 の た め 非 公 開3 . 結 果 と _ 論 論 文 投 稿 の た め 非 公 開
4 . 結 論
本 研 究 で は ，
i
5N
〇3を用いて， タ ン パ ク 質 が 1 % , 遊 離 ア ミ ノ 酸 がmn と な る よ う に 標 識 し ，_N
後42
の 標 識 率 の 変 化 を 測 定 す る こ と で ， タ ン パ ク 質 由 来 と み な さ れ る 高 度 に
i
5N
標 識 さ れ た 遊 離 ア ミ ノ 酸 か 龙 出 さ れ ， ”户e
//扣 〇流ゴ’の-N
下 に お い て オ ー ト フ ァ ジ ー に よ る タ ン パ ク 質 分 解 が 起 こ る 事 を 検 証 し た .タ ン パ ク 質 由 来 の ア ミ ノ 酸 か ら 代 謝 さ れ た と 考 え ら れ る 高 度 に 15N
標 識 さ れ た 代 謝 物 が 2 8 物 質 検 出 さ れ た . そ の 中 に は ，Arg
やLys
の 分 解 経 路 上 の 物 質 が 検 出 さ れ ， 窒 素 が な い 状 態 に お い て 一 部 の ア ミ ノ 酸 は 分 解 さ れ て い る こ と が 分 か っ た .ま た タ ン パ ク 質 分 解 に よ る ア ミ ノ 酸 供 給 が あ る に も 関 わ ら ず 遊 離 ア ミ ノ 酸 と タ ン パ ク 質 の 量 が 顕 著 に 減 少 し た こ と か ら も ， 他 の ア ミ ノ 酸 も 積 極 的 に 分 解 し て い る と 考 え ら れ る .こ れ ま で は 他 の 真 核 生 物 に お い て ， オ ー ト フ ァ ジ ー に よ り 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 は タ ン パ ク 質 合 成 に 再 利 用 さ れ て い る と 言 わ れ て き た が ， 本 研 究 に よ り ， そ の 他 に ア ミ ノ 酸 を 積 極 的 に 分 解 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た .こ れ に よ り 生 産 さ れ た 炭 素 骨 格 はTAG
の 炭 素 源 と な っ て い る 可 能 性 が あ る .ま た ， 本 研 究 で 述 べ た 手 法 は ， タ ン パ ク 質 分 解 を 証 明 す る 際 に 一 般 的 に 用 い ら れ る プ ロ テ ア ー ゼ 活 性 測 定 法 や オ ー ト フ ァ ジ ー 検 出 方 法 と は 異 な り ， 夕 ン パ ク 質 分 解 の 検 証 だ け で な く ， 分 解 物 か ら 生 産 さ れ た 代 謝 物 も 検 出 す る こ と に 成 功 し た .本 手 法 を 用 い る こ と で オ ー ト フ ァ ジ ー に よ る 分 解 物 の リ サ イ ク ル と そ の 意 義 の 解 明 が 進 む と 期 待 し て いる.
謝辞
アドノ
s
'イ ザ 一 の 伊 藤 卓 朗 博 士 に は 研 究 の 方 向 性 か ら 実 験 ま で 昼 夜 問 わ ず 御 指 導 と 御 助 言 をいた だ き ま し た . 中 東 憲 治 博 士 ， 仲 田 崇 志 博 士 に は 多 く の 実 り あ る 議 論 を し て く だ さ り ， 親 身 に な っ て お 力 添 え い た だ い た 事 に 感 謝 致 し ま す .ま た ， 冨 田 勝 教 授 を は じ め ， こ の よ う な 研 究 活 動 を 行 え る 環 境 と 機 会 を 設 け て く だ さ っ た 先 端 生 命 科 学 研 究 会 の 皆 様 に ， こ の 場 を 借 り て 深 く 感 謝 申 し 上げます.引用文献
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