酸 化還元反応 代 共 役 謝 れ ト 酸 ド キ ト赤 球 け

ヒト赤^血球 に おける ³⁻ ヒ ド^ロ キ シア ン トラ ^{ニ ル}酸^の 代謝と それに共役し た ^{ヘ モ} グ^ロ ビ ^ン の酸化還 元反 応

金沢大 学医 学 部生化 学 第^一 講 座 く主 任^二米山艮 昌 教授1

白 沢 栄

く昭和^{6 2}年² 月^{1 3}日受付I

ト リ プ ト^ファ ン代 謝 物 質で あ る 3^−ヒド^ロキシ ア ントラ ^ニル酸 く3^．H A T う は^と卜赤血球で速や かに代 謝さ れ， その最 終 代 謝産 物^は， ス ペク トロフ ォト^メリ^ー ， ペ ^ー パ ^ー クロ マ ト グラ フ ィ ^ーおよ び薄層ク^{ロ マ}

ト グ ラフ ィ ^ー によ る分析か らシ ンナ^バリン酸 くC B Alと同 定さ れ た．

一 九 3⁻H A T によ り， 赤血球 中^のオ キ シヘモグ^ロ ビンは半 分 酸化型^ヘモグロ ビ ンお よ びメト^ヘモ グ^ロ ビ ン に酸 化さ れ た^． その代 謝 速 度が C B A 生 成と同 様^に非 常に速い ことから， 3⁻H A T の代 謝と赤血球 中の ^ヘモグ^ロ ビ ン の酸 化 還元 反応が共 役し て いること が 示唆さ れ た． さ らに，3⁻H A T が オ キシあ る^いはメト^{ヘ モ}グロ ビン の いずれによっても代 謝さ れ る^こと， ま た， オ キシあ るいはメト^ヘ モグ^{ロ ビ ン}がこ の化 合物^によ り各々酸 化お よ び還元 を受 け ること が 明らかと な り，3⁻H A T と^{ヘ モ}グ^ロ ビ ン の ^一 見 矛 盾し た共 役反応が 示 さ れ た． な お， デ オ キ^シヘモグ^{ロ ビ ン} は 3^．H A T によ り酸化さ れ な か ^った^． オ キシヘモグ^ロ ビ ンの 3⁻H A T によ る酸 化^反応は イノ シ ト^ール^ー6^．リ ン酸 くP6−^{in o sitoll は あ るい はスー パ ー} オ キ サ イ ド デ^{ス ム}タ ^ー ゼ くS O Dう^によ り促 進さ れ， カ タ ラ ^ー ゼによ り抑制さ れ た． ま た，3⁻H A T は好気 的，嫌 気 的な^いずれ の条件の も と で もメト^ヘモグ^ロ ビ ンを還元 し た が，

好 気的 条 件 下^での反応が よ り速^{い こ}と が 示 さ れ た． この 3^一日 A T によ る^メト^{ヘ モ}グ^ロ ビ ン の還元 反応は P6⁻

in o sitol によって促 進さ れ た が， S O D によ る 反応の促 進は好 気 的 条件 下^{に お い て}も わ ず^{か で}あ^った^． これ

らの結 果を も と^に， 赤 血 球での3⁻H A T の ^一 見矛 盾し た代 謝反応と^{ヘ モ}グ^ロ ビ ン の酸 化還元 反応の機 序に つ いて考 察し た． そ し て， 糖 尿 病 ある^いは膀胱 癌 患 者^{に お い て}ト リ プ ト^フ ァン代 謝物 質が増加す る との報 告を踏ま え， こ こ に示 し た^ヘモグロ ビ ン酸 化還元 反応^に共役^{し た 3−}H A T の赤血 球 内 代謝の病理学 的 意 義

を推論し た．

K ey ^{w o r}ds he m oglob in ， try p t^Opha n m etaboli_te_， 3⁻h_ydro xy^{a n}tra nilic a cid，

OXido r edu ctiv e r e a ctio n，ery thr o cy t^{e s}

ト リ プ ト^ファン およ び そ の代 謝物 質は肝， 脳な ど を 代 表と す る多く^の臓 器， 組織で代 謝さ れ る． この ト リ プ トファンの主 要 代 謝物^{の 一 つ で}あ る 3^−ヒド^ロ キシ アント ラ ^{ニ ル}酸 く3⁻hydr o xya nthr a nilic a ci d， 3⁻ E A Tう は^こ コナンア ミ ド ア デ^{ニ ン}ジヌク^レオ チ ド くN A Dうの前 駆体^にな る な ど重 要な生理活 性 物 質で あ る が， そ の主 要代謝 経 路と し て． これ らの臓 器^{に お い} て まず庇^．ア ミノ^一月⁻カルポ キ^{シ ムコ ン}酸^一石^一セ ミア^ルデ ヒ ドくq ^．a mi n o⁻P^{−C a r}bo xym u c o nic−^{e−S e mialdehyde} l^へ変換さ れ ること が よ く知ら れ る て^いる^1J． ま た^一 方

A b bre viatio n s 二3⁻H A T ，3⁻h_yd ro xy^{a n}thr anilic

に お いて， こ の3⁻H A T は， M n^{十 十} の存 在 下^で， ヘム タ ン パク質であ るカタラ^ー ゼ あ る^いは^ヘモグ^ロ ビ ン によ りシ ンナ^バリ^ン酸 くcin n aba rinic a cid，C B AJ に変換 さ れ ること が報 告さ れ て^いる^{2 刷．} しか し， こ のC 王ヨA ^へ の代 謝経 路は現 在のところ十分^に分^{か っ}ておら ず， そ の生 理的意 義も明ら^{か に}さ れていない．

一 方，

ヘモ グ^ロ ビンを酸化す る多く^の物 質が知ら れ

ている が， ト リ プ ト^フ ァン等のアミ ノ酸^およ び その代 謝物^によ る オ キシ^ーあ る^いはメト^ヘモグ^ロ ビ ン の酸化 還元^{につ い}て は， 現在のところ ま だ よ く 分^{か っ}ていな

a cidニC B A ， Cin n ab a rinic a cid_三P₆⁻i_{n o s}i tol，

my^oqin o sitol he x akispho sphateニS O D

， S up^{erO X}ide dis m uta s e 三A C D_， a Cid ci_tr ate dextro s ei T L C

，thin lay^{e r c}hr o m atog^raph_{y ニ}O XyH b， O Xyhe m oglobin e 三^{m e}tH b ， m et he m ogl ^obin．

3^．H A Tの代 謝と^{へモ ブロ} ビンの酸化還 元 反応

い．W ^{e s}t phal らは³−H A T が オ キ^{シヘ モ}グロ ビ ンを^メ ト^{ヘモ グロ ビ ン に}酸化す る事を報 告し た^{4 1．} ま た，

Goda ら は 5^−ヒド ^ロ オ キ シ ア ン ト ラ ^{ニ ル} 酸く5−

hyd^{r o x}ya nthr a nilic a ci dl が^メト^ヘモグ^ロビ ンを還元 する^こと を 示 し た^{5 J．} しかし， ニかノ ン刀研 究では， こ の

詳細な 反応様 式を充 分明らか にす ること は で き ず， い

ま な^お， ト^{リ プ}ト^ファ ン代 謝 物質と^ヘモグ^ロ ビ ン の酸 化還元 反応は不明 な点が多い．

著 者は， 本研 究^{に おい て}，3−^{H A T をと卜赤血球と と}

い^ニイ^ンキ^{エペ ー} ト し た時， その細 胞 内で共 役^{し た 3}．⁻

H A T の C B A ^への代 謝と^ヘモグロ ビ ン の酸 化お よ び 還元 反応が 生 ず る^こと を初^{め て}明^{ら か に}し た． さ ら^に，

こ の結果を も とに_， こ の3⁻H A T によ る^ヘモ グ^ロ ビ ン の酸 化お よ び還元 と^いう一^{一見矛盾し た 反応の詳 細を明}

ら^{か に}す ること を目 的と し て， 種々条 件下での ^ヘモ グ

ロビ ン の酸 化^{還 元 反}応を 調^べた． こ の結 果^から， 赤 血 球^{に お}け る ト リ^プト^ファン代 謝と^ヘモ グロ ビ ン の酸 化 還元 反応の機序^{につ いて}考 察を加え， その生理的 意 義

を論じ た．

ヰオ料およ び 方 法

工． 材 料

ビ ス^ート リスE^2−くbis−^{く2−hydr o xyethyり ami n o ト}

2^一くhydr o xym ethyl トpr opa n e⁻1．3−^{d iol}コ^およ び イ^ノ シl^{l − ルー6−}リン酸 く^my^t7−in o sitol he x ak ispho sphate，

P6^．in o sitoり は， シグ^マ社 くSt． Lo uis， M is s o u ri^， 米 国う 製を， ト リ^プト^ファン

， 3−^{H A T， 3}−^{ヒドロ キシキ}

ヌレ ^ニ ン， キ^{ヌレ ニ ン}， ア ント^{ラ ニル}酸な どの ト リ^プ ト^ファン代 謝物は 和光純 薬 く東 京I 製を使用 し た^{． カ} タラ ^ー ゼ はべ ⁻ リ^ンガ^一 社 伸1a fl rlhein l，西ド イツプ製 を， ス ^ーパ ^ー オ キサイ ド デ ^{ス ム} タ ^ー ゼ くs tlpe r O Xide

dis m uta s e， S O D l は ^マ イ ^ル ス ラ ポ ラ ト リ^ー 社

りⁿd ia n a，う机即 製を使用 し た^． C B A は B ute n a ndt ら の方 法^のによ り合 成し た も^のを使用 し た．

赤血球 中^ヘモ グロ ビンの メト^{ヘモ グロ} ビ ン^への変頼 はす で に ^rl^lo m oda ら によ^り幸ほf与さ れている ノブ法^{7 1}に

準じて行 ^った． ま た， 分 離 精 製^ヘモ グ^ロ ビ ン溶 液は To n l Oda ら^の方法^出で調 製し た．

反 応潜 濾^とし て，赤血球^の反応^では^{クレ ブ ス}ー^リンゲ

ル溶 液を， ヘ モ グロ ビ ン の反^J芯^では， 0．05 M t^l リス 0．1 M NaC l緩 衝液 くpH 7^．Ol を使用 し た． ト リ^プト フ_ァ ン代 謝 物は0．1 M NaO H 溶蔀如^こ溶解し た後， O．1 M H C l で巾和 し使用 し た^．

工工． 赤血 球^{で の}3⁻H A T ^の反 応

日本赤 卜字 社^から供 与さ れ た^ヒt^l A C D 保 存血 ほ采 血後3 H う を 7 倍^の水 冷生 理食塩 水で 4 回遠心洗 浄し，

ヘノマトクリ^ッ ト1亡1 ％^にな る よ う赤 血 球を リ^ンゲル溶

3 3 9

液^に浮 遊し た^． こ の血球 浮遊 液^に， 最終 濃度3m M の 3⁻H A T 溶 液を加え， pH 7．0_， 37⁰C で 2 時 間反応さ せ た． 反応 後， 1 ml の反応 液を 3 回凍結融 解す る^ことに より溶血 し た^． こ の溶血 液を，予 め 1 0 m M リン酸緩 衝 液 くpH 7^．01 で平 衡 化し た Sephade x G⁻25 ほn e g^{r a}del カラ ム によ り^ヘモグ^ロ ビ ン画 分^およ び^{ヘ モ}グ

ロ ビ ンを含ま な^い画分に分離し た^．

H L 分離精 製L た^ヘモグ^ロ ビ^ンで の3^一正 A T の反応 3⁻H A T く最 終 濃度5 0 0_ノノM l を オ キ^シーあ る^いは^メト

■1 モグ^ロ ビ ン溶 液く最 終 濃度， ヘ ム量と して 10 0_メ^イM う に加え， 好 気 的あ るいは嫌気 的な条件 下，2 5⁰C で 反応 さ せ た． 嫌 気 的な反応は 空気をQ ガス く^ヘリウ ム ニイ ソ ブタン こ9 9^．0 5^ニ0^．9 5うで置換し たツ ンベルグ 型 石 英 セ ル中で行^った． 反応用 量 は 2^．2 mlで行^い， ト リ プ ト

フ ァン代 謝 物の最 終濃 度^{は 2．3 m M であった．} 使用 し た P6−^{in o sitol， カタラ ー ゼ，S O D の濃 度は各々 1 m M ，}

2 9 u nits，1 3 0 0u nits であ^った． なお，3⁻H A T の光^によ る分 解を防ぐ た^め反応は す^べて遮 光下で行^った． 反応 終了嵐 赤 血球での場 合と同様^に，反応液を Sephade x

G⁻2 5 tfin e gr adel カ ラ ム によ り^ヘモグ^ロ ビ ン両分 お よ び^ヘ モグ^ロ ビ ンを含ま な^い画分に分離し た．

I V．

ヘ モグ^ロ ビン の測定^およ び 同定

反応 中あ る^いは 反応 後の ^ヘモグ^ロ ビン の酸 化， 還元 は^ヘモグ^ロ ビン画分^{の スペ ク}ト^ロ フ ォト^メリ ^ー によ る 45 0^ノ1650Tl m の範 囲での吸光度^を測定す ることによ り 行^った^． ま た， 既^に To moda らによ り報告さ れ て^いる 方法^射で， 平板 等電 点電 気泳 動 くL K B P A G プレ ^ー ト，

pH 3^．5^へ9^．5 う ^によ る 分析を行った．

V ， ト リ プ ト^ファ ン代 謝物^の同定と 測 定

反応 後^の ト^リプ ト^ファン代 謝物^の同定は^ヘモグ^{ロ ビ} ンを含ま な^い画分^{の シ}リ カ ゲル薄 層^{クロ マ} ト グ^ラ

フィ ^ー くT L C プ^およ び^{ペ ー パ ー} クロ マト グラ フ ィ ^ー に より行^っ た^．展 開溶媒は ブ タ^{ノ ー ル}ノ酢酸ノ蒸 留 水，4 ニ 1 こ 1 圧⁰り^であ^っ た．C B A の測 定はスぺクト^ロ フ ォ ト^メト^{リ ー} により行^い， 35 仁ト55 くjn Ill で の吸光 度^を測 定し た^．

成 績

I ． 3^．H A T による赤血球 中^ヘモグ^ロ ビンの酸化 ヒト 赤 血球をこi^．H A T と と もに37⁰c で反応し た時，

血球 内^{ヘ モ}ブロ ビンは直^{ち に}半分酸 化型^{ヘ モ}グロ ビン

亡く丑 2＋

が^十う2 あ るいは く仔 3十

月^{2 ＋}プ2コ^およ びメト^ヘモ グ

ロビ ン に酸 化さ れ た^． 図1亡^aJ^{に 3}−^{H A T と 反応 後の反} 応 溶血液 中^{ヘモ グロ ビ ン}画 分^の等電 点電 気泳動 像を示 し た． 図に示 す よ う^に， 4 本の泳動^パタ^{ー ン}が認^めら れ た． こ の泳 動^{パタ ー ン}は各^々オ キ^シヘモグロ ビ ン_，

く甜2 ＋

月^{3 ＋}12， く^ぼ3十月^2＋う2 およ びメt^{l ヘ}モグ^ロ ビ ンを 示