技術論文
CLEIA 法を原理とする抗核抗体測定試薬の評価
古村菜穂子
1)小松 和典
1)河野 肇
2)古川 泰司
3) 1) 帝京大学医学部附属病院中央検査部（〒 173-8606 東京都板橋区加賀 2-11-1） 2) 帝京大学医学部内科 3) 帝京大学医学部臨床検査医学 要 旨 抗核抗体の検出は膠原病のスクリーニング検査に用いられ，間接蛍光抗体法が広く用いられてきたが特異性や迅速性に 欠けていた。今回化学発光酵素免疫測定法を原理とする全自動臨床検査システム STACIA 搭載試薬ステイシア MEBLuxTM テスト ANA の基礎的検討を行った。基本性能は概ね良好であり，従来法である間接蛍光抗体法と比較して感度・特異度 ともに良好な結果が得られた。本法は従来法と比較して測定時間が大幅に短縮されるため，膠原病のスクリーニング検査 として有用であると考えられる。 キーワード 抗核抗体，化学発光酵素免疫測定法，迅速検査 I はじめに 抗 核 抗 体 の 測 定 は 古 く か ら 間 接 蛍 光 抗 体 法 （indirect immunofluorescence；以下 IIF 法）が用いら れ，HEp-2 細胞が核材として用いられるようになっ てからは感度が飛躍的に上昇した。反面，健常人で の陽性率が高い，手技が煩雑である，施設間差が無 視できない，などの問題点もあげられている1)～5)。 こうした問題点を解決すべく各種 enzyme immuno assay（EIA）法が開発され，IIF 法と同等またはそれ 以上の性能を有することが報告されている6),7)。 今回，自動分析機での測定が可能で測定時間が 大 幅 に 短 縮 さ れ た 化 学 発 光 酵 素 免 疫 測 定 法 （chemiluminescent enzyme immunoassay；以下 CLEIA 法）を原理とする抗核抗体スクリーニング試薬が上 市され，臨床検体を用いた検討の機会を得たので報 告する。 II 材料および方法 1．対象 本研究は，当院中央検査部で試薬基本性能評価を 行い以下に示す臨床検体に対して病歴情報調査を 行った，単一施設後ろ向き横断研究である。本研究 は帝京大学医学部倫理委員会による承認（帝倫 14-018号）を得て実施した。 2012年 6 月より 2013 年 4 月の期間に，当検査部 に抗核抗体の検査依頼があった検体を用いた。組み 入れ基準に適合する検体を 199 例選別し，以下に述 べる IIF 法と CLEIA 法両方の測定を施行した。特異 抗体の検出は必要に応じて医学生物学研究所に CLEIA法による測定を依頼した。検体の組み入れ基 準は，1）観察期間内での同一症例初回検査，2）以 下に述べる病名が診断されている，3）溶血等検査結 果に影響する検査前プロセスでの障害がない，であ る。目的疾患，関連疾患および両者に分類されない 対照例の検体を選び，3 群間で結果を比較した。目 的疾患，関連疾患が複数重複して診断されている例 （平成 28 年 4 月 4 日受付・平成 28 年 9 月 13 日受理）は除外した。当試薬の目的疾患である全身性エリテ マトーデス（SLE），混合結合組織病（MCTD）， シェーグレン症候群（SjS），強皮症（SSc）および多 発性筋炎／皮膚筋炎（PM/DM）を目的疾患，関節リ ウマチ（RA），原発性胆汁性肝硬変（PBC），ANCA （anti-neutrophil cytoplasmic antibody）関連血管炎およ
びベーチェット病を関連疾患とした。 2．測定機器 全自動臨床検査システム STACIA（LSI メディエ ンス） 3．測定試薬 検討試薬としてステイシア MEBLuxTMテスト ANA（医学生物学研究所）を，対照試薬としてフル オロ HEPANA テスト（医学生物学研究所）を使用し た。 4．測定原理 1）CLEIA 法 核抗原を結合した磁性粒子と検体中の抗核抗体を 反応させ集磁して洗浄後，酵素標識抗体（アルカリ ホスファターゼ標識抗ヒトイムノグロブリンポリク ローナル抗体）を反応させると，核抗原結合磁性粒 子－抗核抗体－アルカリホスファターゼ標識抗ヒト イムノグロブリンポリクローナル抗体の免疫複合物 を生じる。これを再度集磁して洗浄後，基質液［2- クロロ-5-(4-メトキシスピロ{1,2-ジオキセタン-3,2'-〈5'-クロロ〉-トリシクロデカン}-4 イル)-1-フェニル ホスフェート・二ナトリウム（CDP-Star）］を加える と，CDP-Star は複合体中のアルカリホスファターゼ により加水分解され発光する。この発光カウントを 測定することにより，あらかじめ作成した標準曲線 をもとに検体中の抗核抗体の有無を検出する。結果 は Index 値として算出される。使用抗原については Table 1に示す通りである。 2）IIF 法 核材としてヒト咽頭癌由来 HEp-2 細胞，標識抗体 として蛍光色素（fluorescein isothiocyanate; FITC）標 識抗ヒトイムノグロブリンを用いる。スライド上の 核材と希釈した検体を反応させ，PBS で洗浄後，標 識抗体を反応させ再度 PBS で洗浄，封入後蛍光顕微 鏡で鏡検し判定する。カットオフ値は当院の基準値 である 80 倍とした。 III 結 果 Table 2に，組み入れ対象となった検体数，性別， 年齢を群ごと，疾患ごとに示す。また，多変量解析 により目的疾患の有無について性別，年齢の優位性 を確認したところ，性別で p = 0.284，年齢で p = 0.410 であり交絡現象は認められないことを確認した。 1．再現性・試薬安定性 添付文書に記載されているカットオフ Index 値 10.0を基準とし低濃度，中濃度，高濃度の検体につ いて検討した時，Index 値の同時再現性は，CV 5.81 ～8.19%（n = 10），日差再現性は，CV 5.30～10.64% （n = 5）であった（Table 3）。また，同一ボトルの試 薬を用いてキャリブレーションをせずに測定し，測 定機器内での試薬安定性を検討したところ，30 日間 は安定した結果が得られた。
STACIA MEBLuxTM test ANA
Principle of
measurement CLEIA
The measurement
time required 19 minutes
Recognized antigens (relevant diseases)
dsDNA (SLE, MCTD) U1RNP (MCTD,SSc) U1, U2, U4/U6, U5 RNP (SLE, MCTD)
hY1～hY5 RNP (SjS, SLE) RNA polymerase III transcription
termination factor (SjS, SLE) DNA topoisomerase I (SSc)
Centromere (CREST) histidyl-tRNA synthetase (PM/DM) Table 1
Test sample
Disease Case (male/female) Age
All 199 (49/150) 15～87
Purpose disease 106 (12/94) 15～85
Systemic lupus erythematosis 33 (3/30) 15～78 Mixed connective tissue disease 13 (2/11) 18～73
Sjogren’s syndrome 26 (2/24) 32～81
Scleroderma 23 (3/20) 37～85
Polymyositis/dermatomyositis 11 (2/9) 52～83
Related disease 41 (10/31) 23～87
Rheumatoid arthritis 17 (3/14) 23～86
Primary biliary cirrhosis 6 (0/6) 46～86 ANCA-associated vasculitis 14 (6/8) 35～87
Behcet’s disease 4 (1/3) 48～66
Control 52 (27/25) 17～85
2．検出限界 標準液を段階希釈したものをおのおの 20 回測定し た時，0 濃度の Count 値の平均値+2SD が平均値−2SD と重ならない Index 値は 0.313 であった。 3．IIF 法との比較 199 例 に つ い て IIF 法 の 定 量 値 と CLEIA 法 の Index値を比較したところ，相関係数 r = 0.735（p ≤ 0.001）となった（Figure 1）。添付文書に従いカッ トオフ Index 値を 10.0 とした時の両法の判定一致率 は 88.4%であり，不一致例 23 例の内訳は CLEIA 法 陽性，IIF 法陰性が 10 例，CLEIA 法陰性，IIF 法陽 性が 13 例であった（Table 4）。 4．臨床的感度・特異度 II-1.で述べた検体を対象とし，添付文書に従って カットオフ値を Index 値 10.0 とした時の臨床的感度 は 91.5%，特異度は 74.2%であった（Table 5）。対象 Reproducibility Within-run variation (N = 10) Between-Day variation (N = 5) Low Middle High Low Middle High Mean 4.87 19.06 63.02 4.88 16.72 55.70
SD 0.28 1.21 5.16 0.26 1.78 5.53
CV (%) 5.81 6.33 8.19 5.30 10.64 9.64
Index
Table 3 とした 199 例についての ROC 分析を行うと ROC 曲
線下面積（area under the curve; AUC）は IIF 法で 0.846 （95%信頼区間：0.788～0.904），CLEIA 法で 0.901 （95%信頼区間：0.860～0.942）となった（Figure 2）。 5．各疾患の陽性率と Index 値の分布 各疾患の陽性率は SLE，MCTD で 100.0%，SjS で 96.2%，SSc で 95.7%，PM/DM で 36.4%であった。 また，目的疾患と関連疾患，対照群の Index 値には 有意差が認められた（Figure 3）。 6．カットオフ値の検討 199例を対象とした時の感度特異度曲線において， 感度×特異度が最大になる Index 値は 16.0 であっ た。また，偽陰性（False Negative; FN），偽陽性（False Positive; FP）のコスト比を考慮したコスト曲線を作 成すると8)，コスト比 0.25 と 0.50 において期待コス トが最小になる Index 値はいずれも 13.0～15.0 と なった（Figure 4）。 IV 考 察 基本性能において，再現性と試薬安定性に問題は なかった。2SD 法による検出限界は Index 値 0.313 であり，カットオフ値よりも十分高感度のため，定 性検査として問題ないと思われる。IIF 法との比較に 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 <40 40 80 160 320 640 1,280 2,560 5,120 10,240 Ho: Homogeneous（N = 25） Sp: Speckled（N = 73） Nu: Nucleolar（N = 8）
Ce: Centromere/Discrete speckled（N = 31） Nm: Nuclear membrane（N = 2） Negative（N = 60） CLEIA（Index） IIF（Titer） N =199 r p= 0.735≤ 0.001
Cut off value
Correlation between CLEIA and IIF Figure 1
Comparison between CLEIA and IIF (N = 199)
CLEIA (+) CLEIA (−)
IIF (+) 111 13
IIF (−) 10 65
Cut off value CLEIA: 10.0 (Index) IIF: 80 (Titer)
Concordance rate: 88.4%
CLEIA (+), IIF (−)
No. CLEIA
Index IIF (Pattern)
Specific autoantibody (CLEIA) Disease 1. 56.2 40 (Sp + Ho) dsDNA, RNP, SS-A SLE 2. 61.5 <40 RNP, SS-A SLE 3. 15.5 <40 dsDNA, RNP SLE 4. 77.9 40 (Sp) SS-A SLE 5. 37.5 40 (Sp) RNP MCTD 6. 16.0 <40 SS-A, SS-B SjS 7. 37.8 <40 Jo-1 PM/DM 8. 55.3 <40 Jo-1 PM/DM 9. 29.7 <40 Jo-1 PM/DM 10. 12.7 <40 — Bronchus malacia CLEIA (−), IIF (+) No. CLEIA
Index IIF (Pattern)
Specific autoantibody (CLEIA) Disease 1. 2.0 640 (Nu) — SSc 2. 2.9 1,280 (Sp) — PM/DM 3. 2.4 640 (Nm + Ho) — PM/DM 4. 2.6 1,280 (Sp + Nu) — PM/DM 5. 6.7 80 (Ho) — RA 6. 1.5 80 (Ho) — ANCA-associated vasculitis 7. 1.8 80 (Ho) — RA 8. 7.2 80 (Ho) — RA 9. 1.4 80 (Sp + Ho) — ANCA-associated vasculitis 10. 4.3 80 (Sp) Sm※ Malignant melanoma 11. 3.5 80 (Ho) — DM
12. 8.2 80 (Sp + Ho) — Parotid gland
cancer
13. 0.7 160 (Nm) — Alcoholic liver
damage
※Ouchterlony double immunodiffusion method (−)
Table 4
おいて，IIF 法の力価と CLEIA 法の Index 値には相 関関係が認められたが，本法は定性試薬として開発 されており標準物質が 2 濃度のため，Index 値を定 量検査として用いることはできないと考えられる。 定性検査としての CLEIA 法と IIF 法との判定一致率 は 88.4%であり，概ね良好な結果が得られた。不一 致例の詳細をみると CLEIA 法陽性，IIF 法陰性 10 例 のうち 9 例は目的疾患であり，特異自己抗体が検出 された。IIF 法で使用している HEp-2 細胞表面上に は多くの抗原が存在しているのに対し，CLEIA 法で は抗原を限定して使用することで IIF 法と比較して 高感度に目的疾患に対応する自己抗体を検出するこ とが可能になったと考えられる。さらに IIF 法では Jo-1抗体が検出されなかったのに対し CLEIA 法では 検出が可能であり，多発性筋炎／皮膚筋炎の診断へ の貢献が期待される。一方 CLEIA 法陰性，IIF 法陽 性 13 例のうち目的疾患は 4 例で，疾患特異自己抗体 が検出されたのは 1 例のみであった。この 1 例の抗 Sm抗体について 2 重免疫拡散法を行ったところ陰 性となり，非特異反応が疑われた。これらの結果か Sensitivity and specificity
IIF (80 Titer) CLEIA (10.0 Index)
Sensitivity 86.8% 91.5%
Specificity 65.6% 74.2%
(Cut off value) Table 5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1−Specificity S en sit iv it y
AUC（95% confidence interval） 0.901（0.860∼0.942）
0.846（0.788∼0.904） CLEIA
IIF
Receiver operating characteristic curves of antinuclear antibody measured by CLEIA and IIF Figure 2
ら IIF 法と本法は異なった性質の検出系として評価 する必要があることがわかる。IIF 法は抗核抗体を包 括的に捉える検査法として用いられ，2009 年のアメ リカリウマチ学会において診断目的での使用が推奨
されているが9)，CLEIA 法は ROC 分析において IIF
法より優れた結果が得られ，診断能力には遜色がな いと考えられる。疾患別にみても SLE，MCTD， SjS，SSc で高い陽性率が得られ，その Index 値は関 連疾患群，対照群と比較して有意に高値傾向が認め られた。このことより定量検査として用いることは できないものの Index 値が高値であれば目的疾患で ある可能性が高いと考えられる。一方，現行法で用 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 CLEIA（Index） SLE MCTD SjS SSc PM/DM RA PBC ANCA-associated vasculitis Behcet's disease Control 100.0 100.0 96.2 95.7 36.4 45.2 100.0 7.1 75.0 7.7 Positive rate（%） （N = 33）（N =13）（N = 26）（N = 23）（N =11） （N =17）（N = 6）（N =14）（N = 4） （N = 52） p < 0.001 p < 0.001
Cut off value
Distribution according to the diseases of index value by CLEIA Figure 3 Cost curve Prospective cost 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 Sensitivity Specificity Sensitivity × Specificity/100 % 16.0 Index 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 Sensitivity and specificity curve
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 Cost（FP）: Cost（FN）= 0.25 Cost（FP）: Cost（FN）= 0.50 FP: False Positive FN: False Negative Index 13.0∼15.0
Examination of cut off value Figure 4
いられているような経過観察指標としての有用性に ついては，現時点では不明であり，今後の評価を待 つ必要があると考える。カットオフ値の検討では添 付文書に記載されているカットオフ値より高めの設 定となった。メーカーがカットオフ値を設定した際 の母集団は健常者を約 40%含むのに対し，今回の検 討では臨床検体を用いて行われたため，この結果は 当院の臨床現場を反映したものであると思われる。 医療機関により対象患者が異なることから，カット オフ値の設定は各施設での臨床側との合意が必要で あると考えられる。 V 結 語 抗核抗体は膠原病のスクリーニングに有用な検査 である。IIF 法は染色パターンから特異自己抗体の推 定ができるものの，混在型も多くその臨床的意義に は問題点も多い2)。今回検討した CLEIA 法による測 定は SLE，MCTD，SjS，SSc における陽性率が 95% 以上と高く，感度・特異度ともに IIF 法より優れた 結果が得られた。本法は IIF 法で問題視されていた 手技的な問題や施設間差の解消を期待できる。パ ターン報告ができないため病態の絞り込みに関する 有用性は低いが，測定時間が 19 分と短く，陽性であ れば専門家への紹介，特異自己抗体検索等次のス テップに迅速に進むことができる。膠原病を疑う場 合の除外診断としても有用であると考えられ，診断 ツールの一つとして期待される。 謝辞 本検討に御協力いただきました株式会社医学生物学研究所に対 し深謝申し上げます。 ■文献
1) Tan EM et al.: “Range of antinuclear antibodies in ‘healthy’ individuals,” Arthritis Rheum, 1997; 40: 1601–1611.
2) 宮脇 昌二：「自己抗体測定の現状と問題点―抗核抗体―」，臨
床病理，2001; 49: 575–579.
3) Kumagai S et al.: “Immunofluorscense-still the ‘gold standard’ in ANA testing?,” Scand J Clin Lab Invest, 2001; 61: 77–83. 4) 熊谷 俊一，他：「抗核抗体」，日本臨牀，2010; 68 Suppl 6: 502–505. 5) 熊谷 俊一，他：「自己抗体検査のサーベイとそれに基づく標 準化の検討」，臨床病理，2009; 57: 31–41. 6) 林 伸英，熊谷 俊一：「抗核抗体検査の EIA の自動化法」，検 査と技術，2001; 29: 1412–1415. 7) 渡邉 奈緒美，他：「蛍光酵素免疫測定法による抗核抗体スク リーニングの基礎および臨床性能評価」，臨床病理，2014; 62: 315–323. 8) 日本臨床検査自動化学会科学技術委員会：「臨床検査の診断 的有用性評価マニュアル 4）カットオフ値の設定法」，日本 臨床検査自動化学会誌，2004; 29 Suppl 1: 15–19.
9) Meroni PL, Schur PH: “ANA screening: An old test with new recommendations,” Ann Rheum Dis, 2010; 69: 1420–1422. 本論文に関連し，開示すべき COI 状態にある企業等はありません。
Technical Article
Evaluation of antinuclear antibody test by chemiluminescent enzyme
immunoassay (CLEIA)
Naoko KOMURA1) Kazunori KOMATSU1) Hajime KONO2) Taiji FURUKAWA3)
1)Division of Laboratory Medicine, Teikyo University Hospital (2-11-1, Kaga, Itabashi-ku, Tokyo 173-8606, Japan) 2)Department of Medicine, Teikyo University School of Medicine
3)Department of Laboratory Medicine, Teikyo University School of Medicine
Summary
Detection of the antinuclear antibody (ANA) is widely used for the screening of collagen diseases. Although indirect immunofluorescence (IIF) assay is considered as a standard test, it has disadvantages in terms of its specificity and rapidity. We performed basic and clinical evaluation of a new ANA assay by chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA). The basic performance of the assay was within acceptable level. Its clinical sensitivity was 91.5% and its specificity was 74.2%, which are higher than those of the IIF assay. The measurement time of CLEIA was 19 minutes, which was shorter than that of the conventional method. On the basis of these results, it is considered that this method is useful for the screening of connective tissue diseases.
Key words: ANA, CLEIA, Rapid test
