博士（農学）高山智光 学位論文題名

     博士（農学）高山智光 学位論文題名

ホウ レンソウ根腐病菌 (AphaTz07nyces coc カ lioides) 遊 走 子 の 走 化 性 に 関 す る 生 態 化 学 的 研 究

学 位 論 文 内 容 の要 旨

  本 論文 は 、 ホ ウレ ン ソ ウ根 腐 病 菌(Aphanomyces cochlioides)の 生 活 環展 開 およ び宿主 植 物 と の 相 互 関 係 の 生 態 化 学 的 研 究 の 一 環 と し て 、 遊 走 子 の 走 化 性 に 注 目 し て進 め た 研究 の 成 果 を 取 り ま と め た も の で あ る 。 そ の 内 容 は 、(a)宿 主 特 異 的 遊 走 子 誘 引 物 質 で あ る cochliophilinA(1)を用 い た 遊 走子 の 走 化性 検 定 法の 検 討 、(b)ホウ レ ン ソウ 地 上 部 に含 ま れ る 新 規 遊 走 子 誘 引 物 質 の 単 離 ・ 同 定 、 な ら び に 関 連 化 合 物 の 調 製 と 遊 走 子誘 引 試 験の 実 施 、(c)遊 走 子 の 走 化 性 に 関 わ る 受 容 体 を 想 定し 、 調 製し たcochliophilinA類 似 化 合 物 や 関 連 化 合 物 な ら び に 天 然 誘 引 活 性 物 質 に 対 す る 遊 走 子 の 誘 引 応 答 の 解 析 、(d)化 合 物 1の 構 造 類 似 フ ォ ト ア フ イ ニ テ イ ー ラ ベ ル 化 剤 の 調製 と そ れを 用 い た受 容 体 の化 学 修 飾、

よりなり、結果は以下のように要約される。

  ホ ウ レ ン ソ ウ 根 腐病 菌(Aphanomj′ces cocM〇j〔 蝴 は卵 菌 類 に属 す る 植物 病 原 菌 で、 土 壌 水 中 を 遊 泳 す る 遊 走 子 を 生 成 す る 。 こ の 遊 走 子 は 宿 主 植 物 か ら 滲 出 す る 化学 物 質 に誘 引 さ れ るこ と が 知 られ て お り、 こ れ まで に ホ ウレ ン ソ ウ地 下 部 よりcochliophilinA（1）、

またシロザの根からはN−frans・feruloyl‐4―〇methyldopamine（2）が宿主特異的な誘引物質と し て 確 認 さ れ て い る 。 植 物 病 原 菌 の 遊 走 子 は 化 学 物 質 や 外 的 刺 激 に 対 し て 最も 感 受 性が 大 き く 、 遊 走 子 の 挙 動 に 顕 著 な 効 果 を 与 え る 化 合 物 の 探 索 や そ の 効 果 の 機 構を 探 る こと は、難防除土壌病原菌の生物合理的な制御の面でも重要なことである。

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(a)植 物 の 化 学 成 分 と 植 物 病 原 菌 遊 走 子 の 相 互 作 用 の 解 析 に 先 だ っ て 、A. cochlioi〔 畑 遊 走 子 の 走 化 性 検 定 法 の 検 討 を 行 っ た 。 以 前 に 藻 類 配 偶 子 の 性 フ ェ ロ モ ン 検 定 用 に 開 発 さ れ た 液 滴 法 を 遊 走 子 誘 引 試 験 に 応 用 、 定 量 的 な 試 験 法 を 確 立 し 、cochliophilinA（1） の 最 低 活 性 濃 度 を 求 め た 。 液 滴 を 遊 走 子 懸 濁 液 ヘ 注 入 す る と 、 液 滴 上 に 誘 引 さ れ る 遊 走 子 数 は 約90秒 後 に は 安 定 し た 。 誘 引 さ れ た 遊 走 子 数 を 指 標 に 、 遊 走 子 が 誘 引 さ れ る に 必 要 な1の 最 低 濃 度 は 、3． OxlO Mで あ る と 結 論 し た 。 一 方 、 試 料 を 塗 布 し た 担 体 粒 子 を 遊 走 子 懸 濁 液 に 加 え 遊 走 子 の 挙 動 を 観 察 す る 担 体 法 は 、 こ れ ま で に 簡 便 な 定 性 的 検 定 法 と し て よ く 用 い ら れ て き た が 、 量 的 な 検 討 は な さ れ て い な か っ た 。 今 回 、 放 射 性 同 位 元 素 標識化合物の［2一l4C］‐carbendazim（3）、［5−014CH3］ー5−methoxy−6，7‐methylenedioxynavone

（4）、［14C（U）］−sucrose、L一［14C（U）］―prolineおよび溶媒として酢酸エチル、アセトン、メタ ノ ー ル を 用 い て 、 担 体 に 付 着 す る 化 合 物 量 を 測 定 し た 。60ー80meshChromosorbWAW

（ 担 体 ） 粒 子 を 各 試 料 溶 液 に 浸 し 、 余 分 の 液 を 濾 紙 片 に 吸 収 さ せ た 後 風 乾 し た 場 合 、 担 体 に 保 持 さ れ た 標 識 化 合 物 の 量 は 、 溶 媒 の 種 類 に 関 係 な く 、 試 料 濃 度108Mか ら10・3M の 範 囲 で 溶 液 の 濃 度 に 比 例 し 、1粒 子 当 り 平 均 試 料 溶 液 約 4nl分 に 相 当 す る も の で あ っ た 。 溶 質 の 極 性 が 大 き く 違 っ て も 、 担 体 に 保 持 さ れ る 溶 質 の 量 的 な 違 い は 、 通 常 の 検 定 濃 度の較差からすれば、無視で きる程度であった。

  (b)ホ ウ レ ン ソ ウ 地 上 部 に 含 ま れ る 遊 走 子 誘 引 物 質 を 単 離 、 構 造 決 定 し 、 そ の 配 糖 体 や 類 似 化 合 物 の 誘 引 活 性 も 検 討 し た 。 地 上 部 に 含 ま れ る 遊 走 子 誘 引 物 質 と し て 新 た に 、 5，4 ーdihydroxy‑3，3．‑dimethoxy‑6，7−methylenedioxyflavone (5)を単離した。化合物5はホウ レ ン ソ ウ か ら 配 糖 体 と し て 分 離 さ れ て い た が 、 遊 離 状 態 で は 得 ら れ て い な か っ た 。5は 10‑5M［cochliophilinA（1） に 比 較 し て1/100 ‑ 1/1000の 活 性 強 度 ］ で 遊 走 子 誘 引 活 性 を 示 し た。別の 配糖体の加水分解産物3−methoxy―5，3｜，4 ‑trihydroxy―6，7−methylenedioxyflavoneく6） は そ れ 自 身 誘 引 活 性 は 示 さ な い が 、1の1041105倍 濃 度 あ る い は5の10倍 濃 度 で 、 そ れ ぞれ1と5の誘引活性を抑制することを 見い出した。

  (c)A．cochlioides遊 走 子 の 走 化 性 に 関 わ る 受 容 体 を 想 定 し 、 骨 格 の 異 な る 誘 引 物 質 の 共 存 下 で の 遊 走 子 の 挙 動 に つ い て 検 討 し た 。CochliophilinA（1） の 飽 和 溶 液 中 で 遊 出 さ せ た 遊 走 子 は 、 骨 格 構 造 を 異 に す る 誘 引 物 質 で あ るN‑trans‑feruloyl一4一O‑methyldopamine

（2） に 正 常 な 誘 引 応 答 を 示 し た 。 さ ら に 、1類 似 の フ ラ ボ ン や ク ロ モ ン 類 を106Mで 遊 走 子 懸 濁 液 に 共 存 さ せ て も 、2の 誘 引 活 性 は 影 響 さ れ な か っ た 。r方 、 顕 著 な 誘 引 活 性 を 有 す る1の 構 造 類 似 フ ラ ボ ン 類 を 共 存 さ せ る と1の 誘 引 活 性 は 失 わ れ た こ と か ら 、 そ れ ら の 構 造 類 似 体 が1の 受 容 体 を 飽 和 さ せ た 状 態 に し て い る と 考 え ら れ た 。 こ れ ら の 結 果 か らA． cochlioidesの 遊 走 子 に は 、 少 な く と も1と2に 対 す る 別 々 の 受 容 体 が 存 在 す る と 判 断 さ れ た 。 化 合 物8や9は 、 2に 匹 敵 す る 誘 引 活 性 を 示 す が 、 1と2の い ず れ の 誘 引 活 性 も 抑 制 し な か っ た の で 、 さ ら に 他 の タ イ プ の 誘 引 物 質 に 対 す る 受 容 体 が 存 在 す る 可 能 性 も 示 唆 さ れ た 。 こ れ ら の 実 験 に は 、 天 然 お よ び 合 成 化 合 物50種 類 を 使 用 し て 、 1や 2の 誘 引 活 性 に 対 す る 効 果 に つ い て 、 比 較 検 討 し て い る 。

(d)宿 主 特 異 的 遊 走 子 誘 引 化 合 物 で あ るcochliophilinA（1） と 類 似 し た 部 分 構 造 を 有 す る フ ォ ト ア フ イ ニ テ イ ー 化 剤 と し て4．‑azidoflavone (7)を 調 製 し 、1の 受 容 部 位 に 結 合 さ せ る こ と を 試 み た 。 7そ の も の は 、 遊 走 子 誘 引 活 性 は そ れ 程 大 き く は な く 、1の 受 容 部 位 に 対 し 弱 い 相 互 作 用 し か 示 さ な い と 思 わ れ た が 、7を 含 む 遊 走 子 懸 濁 液 をUV照 射 し

た後では、遊走子の1 に対する誘引応答の低下が観察された。しかしその影響は2 の

誘引活性には及ばなかった。このことから1 の受容部位あるいはその近傍に7 のニト

レ ン が 反 応 し て 、 1 と そ の 受容 体 の 親 和 性 を 低 下 さ せ た もの と 推 測 さ れ た 。

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立 し 、cochliophilinA（1） の 最 低 活 性 濃 度 を 求 め た 。 液 滴 を 遊 走 子 懸 濁 液 ヘ 注 入 す る と 、 液 滴 上 に 誘 引 さ れ る 遊 走 子 数 は 約 90秒 後 に は 安 定 し た 。 誘 引 さ れ た 遊 走 子 数 を 指 標 に 、 遊 走 子 が 誘 引 さ れ る に 必 要 な1の 最 低 濃 度 は 、 3.Oxl08Mと 結 論 し た 。 一 方 、 試 料 を 塗 布 し た 担 体 粒 子 を 遊 走 子 懸 濁 液 に 加 え 遊 走 子 の 挙 動 を 観 察 す る 担 体 法 は 、 簡 便 な 定 性 的 検 定 法 と し て 用 い ら れ て き た が 、 量 的 な 検 討 は な さ れ て い な か っ た 。 今 回 、 標 識 化 合 物 の［2−14C］ ―carbendazim (3)、［5−0'4CH3]―5一methoxy−6，7−methylenedioxyflavone（4）、［14C（U）］ー sucrose、L― ［I C(U)】 −prolineお よ び 溶 媒 と し て 酢 酸 エ チ ル 、 ア セ ト ン 、 メ タ ノ ー ル を 用 い て 、 担 体 に 付 着 す る 化 合 物 量 を 測 定 し た 。 60―80 mesh ChromosorbWAW(担 体 ） 粒 子 を 各 試 料 溶 液 に 浸 し 、 余 分 の 液 を 濾 紙 片 に 吸 収 さ せ た 後 風 乾 し た 場 合 、 担 体 に 保 持 さ れ た 標 識化 合物の 量は 溶媒の 種類に 関係な く、試 料濃 度10BMか ら10‑Mの範 囲で 溶液の 濃

度 に 比 例 し 、1粒 平 均 溶 液 約 4nlに 相 当 し た 。 溶 質 の 極 性 が 違 っ て も 、 担 体 に 保 持 さ れ る 溶 質 の 量 的 な 違 い は 、 通 常 の 検 定 濃 度 の 較 差 か ら す れ ば 、 無 視 で き る 程 度 で あ っ た 。

2） ホ ウ レ ン ソ ウ 地 上 部 に 含 ま れ る 遊 走 子 誘 引 物 質 を 単 離 、 構 造 決 定 し 、 そ の 配 糖 体 や 類 似 化 合 物 の誘 引 活 性 も 検討 し た 。 地 上部 に 含 ま れ る遊 走 子 誘 引 物 質と し て

5，4｜‑dihydroxy−3，3．‑dimethoxy‑6，7‑methylenedioxyflavone (5)を 単 離 し た 。 化 合 物5は ホ ウ レ ン ソ ウ か ら 配 糖 体 と し て 分 離 さ れ て い た が 、 遊 離 状 態 で は 得 ら れ て い な か っ た 。5は 10゜M[cochliophilinA（1） に 比 較 し て1/100 ‑ 1/1000の 活 性 強 度 ］ で 遊 走 子 誘 引 活 性 を 示 し た 。 別 の 配 糖 体の 加 水 分 解 産物3−methoxy‑5，3． ，4． ―trihydroxy−6，7−methylenedioxyflavone（6） は そ れ 自 身 誘 引 活 性 は 示 さ な い が 、 1の 1041105倍 濃 度 あ る い は5の10倍 濃 度 で 、 そ れ ぞ れ1と5の誘 引 活 性 を 抑制 し た 。

  3 ）A ． cochlioides 遊走子の走化性に関わる受容体を想定し、骨格の異なる誘引物質の 共 存下での遊 走子の挙 動につい て検討し た。1 の飽 和溶液中 で遊出させ た遊走子 は、骨 格構造を異にする誘引物質であるN‑trans ―feruloyl‑4‑O‑methyldopamine (2) に正常な誘引 応 答 を示 し た 。さ ら に、 1 類 似のフ ラボンや クロモン 類を10 石M で 遊走子懸濁 液に共存 さ せ ても 、 2 の 誘 引活 性 は影 響され なかった 。一方、 顕著な誘 引活性を有 する1 の構 造 類 似 体 を 共 存 さ せ る と 1 の 誘 引 活 性は 失 われ た こ とか ら 、1 の構 造 類 似体 が 1 の 受容 体 を飽和させ た状態に している と考えら れた。こ れらの結果からA. cochlioides の遊走 子 に は 、 少 な く と も 1 と 2 に 対 す る 別 々の 受 容体 が 存 在す る と判 断 さ れた 。 化合 物 8 や 9 は、 2 に 匹 敵 する 誘 引活 性 を 示す が 、1 と2 のい ず れ の誘 引 活性 も 抑 制し な かっ た の で 、さ ら に 他の タ イプ の 誘引物 質に対す る受容体 が存在す る可能性も 示唆され た。

4 ） フォトアフ イニテイ ー化合物として4 ‑azidoflavone （7 ）を調製し、 1 の受容部位に

結 合 させ る こ とを 試 みた 。7 そのも のは、遊 走子誘引 活性はそ れ程大き くはなく、 1 の

受 容 部位 に 対 し弱 い 相互 作 用 しか 示 さ ない と 思わ れ たが、 7 を含む遊 走子懸濁液 をUV

照 射 した 後 で は、 遊 走子 の 1 に 対 する 誘 引応 答 の 低下 が観察 された。 しかしその 影響

は 2 の 誘 引 活 性 に は 及 ば な か っ た 。こ の こと か ら 1 の 受容 部 位あ る い はそ の 近 傍に 7

の ニ ト レ ン が 反 応 し て 、 1 と そ の 受容 体 の親 和 性 を低 下 さ せた も のと 推 測 され た 。

以 上 のよ う に 、本 研 究はホウ レンソウ 根腐病菌 遊走子の 生態化学 的特性を追 究するた

めの 生物検定 の定量化 ならびに ホウレン ソウ地上 部の遊走子誘引物質の単離・同定を行

う とと もに、宿主特異的誘引物質及び類似化合物、フォトアフイニテイーラベル化剤を 用 いて 遊走子の走化性に関わる受容体の特性を探り、学術的に貴重な知見を得ている。

   よって審査員一同は、高山智光が博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有するも

のと認めた。