実験糖尿病マウスにおける糖尿病腎症への      エラスターゼの効果検討

     博 士 （ 医 学 ） 藤 井 学 位 論 文 題 名

実験糖尿病マウスにおける糖尿病腎症への      エラスターゼの効果検討

学位論文内容の要旨

渉

    I．緒言

  糖尿病のような高血糖状態の中ではグルコースと蛋白が非酵素的に結合し終末糖化産物(AGE)が産生 され，細胞外基質などに蓄積し，組織の機能や構築に障害をきたし糖尿病慢性合併症の発症進展に関与す るとされている．AGEは多様な物質の総称であるが，最近ではカルポキシメチルルジン(CML)構造を持つ CML型AGEと， 同構 造を 持た ないnon‑CML型AGEに 大別されており，糖尿病患者の血中や腎組織では 両者の蓄積が認められている．AGE産生や蓄積の阻害は合併症の治療に有用であると考えられ，現在まで にアミノグアニジン，PTB，OPB‑9195などがAGE阻害剤として開発されているが，これらの薬剤は長期投 与での生体への安全性が確立されていない．プタの膵臓から抽出されたエラスターゼは脂質代謝改善薬と して長く用いられているが，糖尿病モデル動物の腎糸球体の基底膜の肥厚を抑えることが報告されており，

また糖尿病患者に対する投与では尿アルプミン排出量を減少させるという報告がある．本研究では膵エラ スタ ーゼ （以 下エ ラス ターゼ）の糖尿病腎症に対する効果を，AGE阻害の関与の点から検討した．

    II．材料と方法

1．エラスターゼのAGE阻害効果の評価

  マウスIV型コラー ゲンをコーテイングしたELISA用プレートにAGE化ウシ血清アルブミンくAGE‑BSA) を入れ，インキュベーションしてコラーゲンと結合させた．各wellにエラスターゼを添加しさらにインキ ユベーションした後wellを洗浄し，プレートのコラーゲンに結合しているAGE‑BSAをELISAにて測定し た。コラーゲンに結合できずに除去されたAGE‑BSAの比率をエラスターゼ非添加のwellを基準として算 出し，エラスターゼのAGE阻害率とした。

2．糖尿病モデル動物の作成と薬剤の投与

  8週齢の雌性Balb/cマウスにストレプトゾトシンを腹腔内投与し，2週後の血糖値が300mg′dl以上のもの を糖尿病とした．未処置正常マウスをコントロール群とした．糖尿病を発症したマウスのうちエラスター ゼ投与群にはエラスターゼを，プラセポ群には生理食塩水を連日筋注した．投与期間は12週間とした，

3． 血 糖 値 お よ び 尿 ア ル プ ミ ン 排 出 量 （UAE； unnaヴ mburninexcI矧 on） の 測 定   マウスの随時血糖は2週毎にグルコースオキシダーゼ法により測定した．また薬剤投与後4週と12週で 24時 間 蓄 尿 を 行 い ，UAEを マ ウ ス ア ル プ ミ ン に 対 す る 抗 体 を 用 い たEuSA法 に て 測 定 し た ．

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4．腎の組織学的評価およびAGEの測定

  投与後12週後でマウスを犠牲死させ腎を採取した．腎のPAS染色標本の光頭像を，画像情報をデジタル 処理するMCIDシステムに取り込み，糸球体の断面積を計測し，形態計測の理論式(Wibelの式）から糸 球体体積を求めた．また同システムを用いて糸球体の断面積に占めるメサンギウム領域の比率を計測した．

  AGEの測定は腎皮質を酸加水分解してコラーゲン分画を抽出し，ヒドロキシプロリン量の測定からコラ ー ゲン 量 を 算出 ， さ ら にコ ラ ー ゲン 分 画 中のnon＿CML型AGE量およびCML型AGE量を ，抗AGE抗体 を用いた競合ELISAで測定した・

    皿．結果

1．In vitroにおけるエラスターゼの効果

  0.5yg/mlのエラスターゼはコラーゲンとAGE ‑BSAとの結合を時間依存性に阻害し，8時間での阻害率は 43%であった．5yg/mlのエラスターゼの結合阻害率は8時間で65%であった．50llg/mlのエラスターゼの結 合阻害率は5 yg/mlと有意差はなかった．

2．糖尿病モデル動物におけるエラスターゼの効果

  エラスターゼ投与群とプ、ラセポ群では血糖値は400mg/dlを越えていたが，各時点における両群間の差は なかった．投与後4週ではプラセポ群とエラスターゼ投与群の間にUAEの差はなかった．12週ではプラセ ポ群のUAEは正常群の5.7倍に増加していたが，エラスターゼ投与群では1.5倍で有意に抑制されていた．

組織学的評価ではプラセポ群の糸球体体積は正常群の1.5倍に増大していたが，エラスターゼ投与群では1.2 倍と有意に抑制された．また糸球体面積に対するメサンギウム領域比はプラセポ群では正常群の213倍に拡 大していたが，エラスターゼ投与群では1．3倍と有意に抑制された．腎皮質のnon‑CML型AGE量はプラ セポ群が正常群の3．4．倍であったが，エラスターゼ投与群では1.3倍と有意に低かった．またCML型AGE 量もプラセポ群が正常群の2.9倍であったのに対し，エラスターゼ投与群では正常群の1.5倍と抑制されて いた．

    IV．考察

  糖尿病腎症の病理学的特徴は糸球体の肥大，基底膜の肥厚，メサンギウム領域の拡大であり，臨床的に は微量アルプミン尿から顕性蛋白尿へと進展する，これらの変化の要因としてAGEの関与が知られており，

AGEの蓄積により糸球体の．size barrierおよびcMge barrierの破綻をきたし，アルブミン尿が出現する．ま た細胞外マトリックスにAGEが蓄積すると，プロテアーゼによる分解を受けずらくなり，メサンギウム領 域が拡大，糸球体憾肥大し，腎症の病理学的変化が進行する．今回の結果よルエラスターゼはストレプト ゾトシン誘発糖尿病マウスの糸球体の肥大，メサンギウムの拡大を抑制し，尿アルブミン排出量を減少さ せることが示された．エラスターゼが尿アルプミン排出量を減少させるという報告は以前より散見される が，その作用機序はこれまで不明であった．今回の検討では，工ラスターゼが訊vitroでAGE化蛋白とコ ラーゲンの結合を阻止し，加vivoでは腎におけるAGEの蓄積を阻害し，糖尿病腎症の発症と進展を阻止で きることを示唆している．エラスターゼがAGEの蓄積を抑制する機序についてはコラーゲンの水解作用な どが推察されるが，詳細なメカニズムについてはさらに検討が必要である．現在まで，報告されているア ミノグアニジン，PTB，OPB‑9195などのAGE阻害剤は実験動物における有効性は確認されているが，長期 投与時の生体への安全性は確立されていない．工ラスターゼは脂質代謝改善剤として長年用いられてきた

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薬剤であり，現在まで重大な副作用の報告ない．したがって，エラスターゼは現在使用できるAGE阻害剤 と し て 有 望 で あ る 可 能 性 が あ り ， 今 後 の 臨 床 的 な 有 用 性 の 検 討 が 必 要 と 考 え ら れ た ．     V．結語

  エラスターゼはin vitr。におぃてコラーゲンのAGE化を阻害した．またストレプトゾトシン糖尿病マウ スヘの投与により腎でのAGEの蓄積を阻害し，糸球体肥大やメサンギウム領域の拡大を阻止し，尿アルプ ミン排出量の増加を抑制した．以上の結果より，エラスターゼはAGE阻害剤として糖尿病腎症の治療に有 用である可能性が示唆された，

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

実験糖尿病マウスにおける糖尿病腎症への      エラスターゼの効果検討

糖 尿病 のよ うな 高血 糖状 態の中 では グル コー スと 蛋白 が非 酵素 的に結合し、終末糖化物 質 (AGE) が 組 織 に 蓄 積 し 、 糖 尿 病 慢 性合 併 症 の 発 症 と 進 展 に 関 与 す る 。 AGE は 多 様 な 物 質 で あ る が 、 最 近 で は カ ル ポ キ シ メ チ ル リ ジ ン (CML) 構 造 を 持つ CML 型 AGE と 、 同 構 造 を 持 た な い non‑CML 型 AGE に 大 別 さ れ て い る 。 AGE を 阻 害 す るこ と は 合 併 症 の 治 療 に有 用であると考えられる。ブタの膵臓から抽出されたェラスターゼは糖尿病モデルマ ウ スの 腎糸球体の基底膜の肥厚を抑えることが報告されており、糖尿病腎症患者に対する 投与で尿アルブミン排出量を減少させるという報告がある。本研究では膵エラスターゼ（以 下 エラ スタ ーゼ ）の 糖尿 病腎症 に対 する 効果 を、 AGE 阻害の 点か ら検討した。血vitro の 系 で は ェラ スタ ーゼ がコ ラー ゲン の AGE 化を 阻止 する かど うか を検 討し た。 すなわ ち、

マ ウ ス IV 型 コラ ーゲ ンを コー ティ ング した 96well のプ レー トに AGE 化ウ シ血 清アル プミ ン (AGE‑BSA) を入 れ 、 コ ラ ー ゲ ン と 結 合 さ せ た 。 各 well に エ ラ ス ター ゼを 添加、 イン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 、 洗 浄 し 、 プ レ ー ト上 の コ ラ ー ゲ ン に 結 合 して いる AGE‑BSA を ELISA に て 測 定し た 。 コ ラ ー ゲ ン に 結 合で きず に除去 され たAGE‑BSA の 比率 をェラ スタ ー ゼ非 添加 の well を 基準 として 算出 し、 工ラ スタ ーゼ のAGE 阻害 率とした。0.5 yg/ml の ェ ラ ス ター ゼは コラ ーゲ ンと AGE ‑BSA との 結合 を時間 依存 性に 阻害 し、 8 時 間での 阻害 率 は 43% であ った 。5yg/ml のェ ラス 夕一ゼの結合阻害率は8 時間で65 ％であった。50yg/ml の ェラ スタ ーゼ の結 合阻 害率は 5 yg/ml と有意差はなかった。っぎに、糖尿病モデル動物 を も ち いて 検討 を行 った 。 8 週 齢の 雌性 Balb/c マ ウス にス トレ プ卜 ゾト シン を腹腔 内投 与 し、 糖尿 病を 発症 した マウス のう ちェ ラス ター ゼ投 与群 には エラスターゼをSmg 瓜g 、 プ ラセ ポ群 には 生理 食塩 水を連 日筋 注し た。 投与 期間 は12 週間 とした。マウスの随時血 糖 を 2 週 毎に グル コー スオ キシ ダー ゼ法により測定した。各時点でエラスターゼ投与群と プ ラ セ ボ群 との 間に 血糖 値の 差は なか った 。投 与後4 週と 12 週 で 24 時間 蓄尿 を行い 、尿

夫

彦

雄

隆

知

輝

池 柳

橋

小 小

石

授 授

授

教 教

教

査 査

査

主 副

副

ア ル ブ ミン 排出 量をマ ウス アル ブミ ンに 対す る抗 体を 用い たELISA 法 にて 測定 した 。投 与 後12 週で はェ ラス ターゼ 投与 群の尿アルブミン排出量はプラセボ群の約400/0 に抑えら れ て い た。 投与 後12 週 でマ ウス を犠 牲死 させ 、腎 を摘 出し た。 腎の PAS 染 色標 本の 光顕 像 を 、 画 像 情 報 を デ ジ タ ル 処 理 す るMCID シ ステム に取 り込 み、 糸球 体の 断面 積を 計測 し 、形 態計 測の 理論 式（ Weibel の式）から糸球体体積を求めた。また、同システムを用 い て糸球体の断面積に占めるヌサンギウム領域の比率を計測した。プラセポ群の糸球体体 積 は正 常群 の1.5 倍に 増大 して いた が、 工ラ スタ ーゼ投 与群 では1.2 倍と有意に抑制され た 。糸 球体 断面 積に 対する ヌサ ンギウム領域比は、プラセボ群では正常群の2.3 倍に拡大 し てい たが 、エ ラス ターゼ 投与 群では1.3 倍と有意に抑制された。ついで、腎皮質を酸加 水分解してコラーゲン分画を抽出し、ヒドロキシプ口リン量を定量しコラーゲン量を算出、

さ ら に コ ラ ー ゲ ン 分 画 中 の non‑CML 型 AGE 量 お よ び CML 型 AGE 量 を 、 抗 AGE 抗 体 を 用 い た 競 合 ELISA で 測 定 し た 。 腎 皮 質 の non‑CML 型 AGE 量 は プ ラ セ ボ 群 が 正 常 群 の 3.4 倍 で あ っ た が 、 エラ ス タ ー ゼ 投 与 群 で は 1.3 倍で 有 意 に 低 か っ た 。 ま た CML 型 AGE 量 もプラセボ群が正常群の2.9 倍であったのに対し、エラスターゼ投与群では正常群の1.5 倍 で有 意に 抑制 され ていた 。以 上の結果より、工ラスターゼがin vitrD でAGE 化蛋白とコ ラ ーゲ ンの 結合 を阻 止し、 m レ f レD では 腎に おけ るAGE の蓄 積を阻害し、糖尿病腎症の発 症と進展を阻止できることが示唆された。

   この 論文 はエ ラス ター ゼが AGE 阻 害剤 とし て糖 尿病 腎症 の治 療に 有用 である こと を示

したものであり、糖尿病合併症の治療に寄与するところが大きいもの考える。審査員一同

は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ、申請者

が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。