Ann. Rept. Kansai Pl. Prot. (62): 95-99 (2020)
非病原性
Xanthomonas 属細菌によるレタス斑点細菌病の発病抑制
永井裕史
＊1, ＊4・三宅律幸
＊1・加藤晋朗
＊1・前川大輔
＊2・井上康宏
＊3・瀧川雄一
＊4Hirofumi Nagai*
1,*
4, Noriyuki Miyake*
1, Shinro Kato*
1, Daisuke Maekawa*
2, Yasuhiro Inoue*
3and Yuichi Takikawa*
4: Biological control of the bacterial spot of lettuce caused
by Xanthomonas axonopodis pv. vitians, using a nonpathogenic Xanthomonas sp. strain.
Abstract
In this study, we examined the biological control potential of a nonpathogenic Xanthomonas sp. strain 11-100-01 (npX) against bacterial spot of lettuce caused by Xanthomonas axonopodis pv. vitians (Xav.). The results from field trials conducted over 3 consecutive years showed that npX had a significant control efficacy towards Xav on lettuce, which was comparable to that of basic copper sulfate. A re-isolation experiment using a spontaneous rifampicin-resistant mutant strain of npX revealed that it efficiently colonized the lettuce leaves, particularly the wounded sites, for at least 1 week after the spray treatment. Furthermore, the results of the in vitro antagonism assay demonstrated that npX produces antibacterial substances that effectively inhibit the multiplication of Xav. Altogether, our results strongly indicated that npX has the potential to be used as a biological control agent against bacterial spot in lettuce.
Key words: bacterial spot of lettuce, nonpathogenic Xanthomonas, biological control
緒 言
レタス斑点細菌病は，レタスの栽培において被害が大 きく，また防除が困難な病害の一つである。病徴は，初 め外葉に小さな水浸状の斑点を生じ，褐色で不整形の病 斑を形成する。病斑は互いに融合して，葉縁が枯れ込 む形となり，さらに進むと葉脈に沿って基部に向かいV 字型に枯れ込む。乾くと黒褐色となり，縮むと葉がゆが む。多湿の状態が続くと病斑部は軟化して葉全体に及 び，さらに進展すると結球葉にも及ぶことがある（岸， 1982；1998）。本病の病原体は，グラム陰性桿状細菌のXanthomonas axonopodis pv. vitians である。
植物病原細菌によって引き起こされる病害に対して は，効果的な化学農薬が極めて少ない。防除に有効な銅 水和剤は，収穫が高温期になる春作レタスでは，薬害を しばしば生じるため使用時期が制限される。筆者らは， 病原細菌と同属の非病原性細菌を利用し，Xanthomonas 属細菌による病害全般を抑制できる生物農薬の開発を目指 した（井上ら，2009；2014；Kawaguchi et al.，2014）。そ の素材として，非病原性Xanthomonas 属細菌11-100-01株（以 下npX と略す）を新たに分離し，広範囲な Xanthomonas 属細菌病害を防除するために微生物液剤を開発した（石 井ら，2014；永井ら，2014）。また，npX のアブラナ科 野菜黒腐病に対する実用性を確認し，適用すべき作型を 明らかにした（Nagai et al.，2017）。 本稿では，アブラナ科野菜に加えてキク科野菜への npX の適用性を，レタスの重要病害である斑点細菌病を 用いて検討した。また，npX の同病発病抑制機構を解析 するため，npX のレタスへの定着数をリファンピシン耐 性変異株を用いて経時的に計数した。さらに，対峙培養 により，npX のレタス斑点細菌病菌に対する増殖抑制能 を調査した。 なお，本研究は農林水産業・食品産業科学技術研究推 進事業「（23037）主要作物をキサントモナス属病害から 守る新規微生物農薬の開発」（2011～2013年度）の助成 を受けて行った。 ＊1愛知県農業総合試験場・＊2クミアイ化学工業株式会社・＊3農業・食品産業技術総合研究機構中央農業総合研究センター・＊4静岡
大学創造科学大学院 *1Aichi Agricultural Research Center, *2KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD, *3NARO National Agricultural
Research Center, *4Graduate School of Science and Technology, Shizuoka University
2020年２月21日受理
材料及び方法
１．npX によるレタス斑点細菌病抑制試験
供試細菌株は第１表に示した。npX は生物防除素材と して，Xanthomonas axonopodis pv. vitians SUPP1991株（以
下Xav と略す）は接種用の病原細菌として使用した。本 試験の各処理日は第２表に示した。本試験では以下のよ うに調製したnpX 液剤を使用した。npX を肉エキス液体 培地（乾燥ブイヨン，日水製薬株式会社）で 27°C，200 rpm で24時間撹拌培養した。得られた培養液を 4,000×g で15分間遠心集菌し，沈殿したnpX のペレットを AB 塩 溶 液（Ghezzi et al.，1999）に懸濁，1×1010 CFU/mL
に調製した。Xav は YP（酵母エキス（BD Bacto）5 g， ペプトン（BD Bacto）10 g，蒸留水 1,000 mL，pH 6.8–7.0） 液体培地で 27°C，100 rpm で20時間振とう培養した。得 られた培養菌液を 7,000×g で10分間遠心集菌し，滅菌 水 50 mL に懸濁した。懸濁液の OD600 での吸光度と，希 釈平板法で作成した検量線により，Xav の菌密度を推定 した。npX 液剤は，水道水で 1×108 CFU/mL に調製し て散布した。塩基性硫酸銅水和剤（Z ボルドー）（以下 「銅水和剤」と略す）は，水道水で500倍に希釈して散布 した。無処理区には水道水を散布した。全ての散布液 には，展着剤（クミテン）を 10 L 当たり 3 mL 加えた。 散布は肩掛け動力噴霧器（RS2620H）を用い 0.9 MPa で 行った。npX 液剤，銅水和剤，無処理としての水道水は， 1,000 m2 当たり 200 L 相当量を散布した。全てのレタス は，npX 液 剤 等 の 散 布 翌 日 に，Xav を 3×106 CFU/mL の菌密度になるように水道水で希釈し，1,000 m2 当たり 50 L 相当の散布量で無傷接種した。試験期間中は，レ タスの生育に対して大きな被害となるような気象災害及 び虫害はなかった。
統計処理は，R version 3.3.1（R Foundation for Statistic Computing, Vienna, Austria）を用いてライアン法で行った。 ２．レタスへのnpXR 定着試験 （1）npXR の調製 供試細菌株は第１表に示した。レタス葉粉砕液から npX を選択的に分離し，レタスへの npX 定着数を経時 的に計数するために，npX からリファンピシン耐性変異 株npXR を作出した。npXR は YP 液体培地で 27°C，20 時間，100 rpm で振とう培養した。培養菌液を 7,000 ×g で10分間，遠心集菌し，滅菌水50 mL に懸濁した。懸濁 液のOD600での吸光度と，希釈平板法で作成した検量線 により，npXR の散布菌密度を推定した。 （2）レタス上のnpXR の経時的な計数 愛知県農業総合試験場内の無加温ガラス室で，５号 ポット栽培で実施した。供試レタス株数は１区３株の３ 反復，供試品種はシスコ，播種は2017年６月６日，鉢 上げは同年６月27日に行った。レタス葉への付傷は， npXR 処理の直前に，滅菌した解剖鋏により葉先端部か ら 100 mm の部分を垂直に切断した。葉への npXR 処理 濃度は 1×108 CFU/mL，処理量は約 200 L/1,000 m2 相当 量，処理日は2017年７月25日で，調査日は７月26日（１ 日後），28日（３日後），８月１日（７日後）。調査方法は， 無傷レタス葉の先端部，外側部，内側部各 10 mm×50 mm，及び付傷部 5 mm×100 mm を採取，採取した生葉 の重量を計量し，蒸留水 20 mL を加えホモジナイザー により 10,000 rpm で粉砕した（第１図）。リファンピ シン 100 mg/L，シクロヘキシミド 50 mg/L を加用した YPA（前出 YP 液体培地に，寒天 15 g を加えた）平板培 地を用い，希釈平板法により，27°C で40時間培養後に コロニー数を計数し，生葉重量あたりの定着菌数を測定 第１表 供試細菌株一覧 細菌株名 由来 非病原性Xanthomonas sp. 11-100-01（NITEa P-1243） 茨城県においてハクサイから分離された 11-100-01R 11-100-01株のリファンピシン耐性変異株
“Xanthomonas axonopodis pv. vitians”b SUPP1991 静岡県においてレタス斑点細菌病斑から分離された a NITE，独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託番号 b“ ”：未確定の学名 第２表 非病原性Xanthomonas 属細菌11-100-01株（npX）によるレタス斑点細菌病の発病抑制試験の各処理条件 試験年 試験面積（m） 供試 株数 播種日 定植日 npX と銅水和剤の 処理日 病原細菌（Xav）の 接種日 発病調査日 2013 5.8×2.4 45 ２月12日 ３月18日 ５月１日 ５月８日 ５月15日 ５月２日 ５月９日 ５月21日 2014 6.5×2.4 45 ２月10日 ３月12日 ４月16日 ４月23日 ５月１日 ４月17日 ４月24日 ５月８日 2015 6.5×2.4 45 ２月６日 ３月９日 ４月７日 ４月16日 ４月23日 ４月８日 ４月17日 ４月30日
した。同様の試験を，同年７月31日にnpXR 処理を行っ た上でもう一度行った（試験２回目）。 ３．平板培地上での対峙培養試験 npX と Xav は，YPA 平板培地を用い 27°C で２日間培 養した。Xav は，培地中の菌密度が約 1×107 CFU/mL になるように調製して，Ayers ら（1917）の平板培地（グ ルコース 1.0％，リン酸一アンモニウム 0.1％，塩化カリ ウム 0.02％，硫酸マグネシウム 0.02％，ブロモチモール ブルー 0.015％，蒸留水 1,000 mL，寒天 15 g，pH 7.0）に， 45°C で混合した。npX は，90 mm 平板で培養した 1/4 の 菌量を滅菌水 1 mL に懸濁し，50 μL を前出の Xav を混合 した平板培地の中央に滴下し対峙培養した。その後，27°C で２日間培養したのち，阻止円形成の有無を観察した。
結 果
１．npX によるレタス斑点細菌病抑制試験 2013年から2015年まで合計３回，npX 液剤によるレタ ス斑点細菌病抑制効果を露地で確認した。2013年では， レタスの発病株率は，無処理の 97.8％に対して，npX 液 剤処理 46.7％，銅水和剤処理 31.1％であった。npX 液剤 処理と銅水和剤処理のレタス発病株率は，ライアン法 （P＜0.05）により，無処理と比較して有意に低かった。 2014年では，レタスの発病株率は，無処理の 73.3％に対 して，npX 液剤処理 37.8％，銅水和剤処理 51.1％であっ た。npX 液剤処理と銅水和剤処理のレタス発病株率は， 無処理と比較して有意に低かった。2015年では，レタ スの発病株率は，無処理の 86.7％に対して，npX 液剤処 理 44.4％，銅水和剤処理 13.3％であった。発病株率をラ イアン法で検定すると，各々が有意な差があった。３年 間で３回行った全ての試験で，npX 液剤処理は無処理に 比べて有意にレタス斑点細菌病を抑制し，内２回でnpX 液剤と銅水和剤の同病抑制は同程度であった（第３表）。 ２．レタスへのnpXR 定着試験 （1）試験１回目 レタス葉の処理当日のnpXR 検出数は，先端部 9.8× 106 CFU/g，外側部 1.7×106 CFU/g，内側部 2.3×106 CFU/g， 付傷部 1.1×107 CFU/g であった。先端部，外側部，内 側部の検出数は徐々に減衰し７日後には先端部 4.6×104CFU/g，外側部 2.1×104 CFU/g，内側部 1.2×104 CFU/g
であった。散布当日を基準とした７日後のnpXR の検出 数の割合は，先端部 0.5％，外側部 1.2％，内側部 0.5％ に対して，付傷部 97.1％であった（第２A 図）。処理７ 日後のnpXR のレタスからの検出数は，付傷部が最も多 く，それ以外の部位と比較して約200倍～800倍であった。 （2）試験２回目 レタス葉の処理当日のnpXR 検出数は，先端部 5.7× 104 CFU/g，外側部 1.6×105 CFU/g，内側部 1.8×106 CFU/g，
付傷部 8.8×106 CFU/g であった。先端部，外側部，内 側部の検出数は徐々に減衰し７日後には先端部 1.2×104 CFU/g，外側部 3.8×103 CFU/g，内側部 8.4×102 CFU/g であった。散布当日を基準とした７日後のnpXR の検出 数の割合は，先端部 20.3％，外側部 2.4％，内側部 0.04％ に対して，付傷部は 393％であった（第２B 図）。処理 ７日後のnpXR のレタスからの検出数は，付傷部で最も 多く，それ以外の部位と比較して約3,000倍～40,000倍で あった。 ３．平板培地上での対峙培養試験 Ayers らの平板培地上で Xav と npX を対峙培養したと ころ，幅約 5 mm の阻止円を形成した（第３図）。その ため，npX は Xav に対して増殖抑制能を有することが 判明した。 第１図 レタスへのnpXR 定着試験の試料調整イメージ 第３表 非病原性Xanthomonas 属細菌11-100-01株（npX）によるレタス斑点細菌病の発病抑制試験の結果 試験年 2013年 2014年 2015年 各処理 供試株数 発病株率（％）a 供試株数 発病株率（％）a 供試株数 発病株率（％）a npX 液剤 45 46.7 a 45 37.8 a 45 44.4 b 銅水和剤 45 31.1 a 45 51.1 a 45 13.3 a 無処理 45 97.8 b 45 73.3 b 45 86.7 c a 同一英字はライアン法により P＜0.05 で発病株率に有意差がないことを示す
考 察
2013年から2015年に，春作で計３回，npX 液剤のレタ ス斑点細菌病に対する防除効果を検証するため，既存の 登録農薬である銅水和剤と病害抑制能を比較する試験を 実施した。2013年と2014年は同様の結果であり，npX 液 剤はレタス斑点細菌病に対して銅水和剤と同等の防除効 果を示し，npX 液剤と銅水和剤はともに，無処理に比べ 有意に発病株率が低かった。2015年は，レタス斑点細菌 病の発病株率は，銅水和剤が最も低く，次いでnpX 液剤， 無処理区が最も高かった。また，npX 液剤と銅水和剤は ともに，無処理に比べ有意に発病株率が低かった。３回 の試験全てでnpX 液剤の発病株率は無処理に比べ有意 に低く，また２回は銅水和剤と同等であったことから， npX 液剤がレタス斑点細菌病に対して高い抑制効果を有 することが明らかになった。 npX は，キャベツとハクサイに噴霧接種すると傷口部 分に１週間程度定着し，植物体に病原菌を後から噴霧し た場合，アブラナ科黒腐病菌の傷口近傍の増殖を抑制し た（井上ら，2014）。井上らは，npX の発病抑制機構を 植物体傷口への病原菌に先んじた定着と，病原菌増殖抑 制であると考察している。 レタスへのnpXR 定着試験で，npX が健全部に比べ付 傷部へ約200倍～40,000倍多く定着することがわかった。 付傷部の７日間の推移では１日後に増殖しその後菌数が 維持された（第２A，B 図）。また，平板培地上での対 峙培養の結果，npX は Xav に対して増殖抑制能を有す ることが判明した。以上の２点から，npX のレタス斑点 細菌病発病抑制機構は，アブラナ科野菜の場合と同様に， 植物体傷部の占有定着による病原性細菌の侵入防止と， 抗細菌物質等による病原性細菌の増殖抑制の，複合的発 病抑制であることが示唆された。 npX 液剤は，レタス斑点細菌病に対しては銅水和剤と 同等であったが（第３表），ブロッコリー黒腐病に対し ては発病抑制効果が有意に低かった（永井ら，2014）。 銅水和剤を基準として比較すると，npX 液剤の発病抑制 効果はブロッコリー黒腐病よりレタス斑点細菌病で高 い。ブロッコリーは，無傷の葉からはnpXR はほとんど 検出されなかった（データ未発表）。一方で，レタスでは， 無傷の葉からnpXR が処理７日後でも 8.4×102 CFU/g ～ 4.6×104 CFU/g 検出された（第２A，B 図）。無傷のブロッ コリーではnpXR はほとんど定着できなかったのに対し て，レタスでは徐々に検出量は減少するが７日目まで減 少しながらも検出され続けた。この無傷部への定着の差 が，npX のレタスとブロッコリーの病害抑制能力の差で ある可能性が示唆された。ブロッコリーは，キャベツと 同様に葉表面にワックスが多くあるため，水が付着しに くい作物である。一方レタスは，葉表面にワックスが少 なく水が付着しやすい。この葉表面の差が無傷葉への npX 定着数の差になると考えられた。 npX 液剤は，ブロッコリー黒腐病，モモせん孔細菌病， 第２図 レタスへの npXR 定着試験 A：試験１回目，B：試験２回目 図中の縦棒は標準誤差を示す 第３図 npX による Xav の阻止円形成 スケールバーは 10 mmカンキツかいよう病に対して発病抑制効果がある（永井 ら，2014； 石 井 ら，2014；Kawaguchi et al.，2014）。本 稿で，さらにレタス斑点細菌病に対しても高い発病抑 制効果があることが明らかとなり，npX 液剤が広範囲の Xanthomonas 属細菌病を抑制することが示された。
摘 要
非病原性Xanthomonas sp. 11-100-01株を用いて作成 したnpX 液剤のレタス斑点細菌病に対する発病抑制効 果について，３年間の露地試験により検証した結果，同 病に対する強い発病抑制効果が認められた。その効果は 銅水和剤と同等であり，無処理に比べ有意に高かった。 また，npX のレタスへの定着数を，リファンピシン耐性 変異株を用いて経時的に計数した結果，npX は１週間以 上レタスに定着し，葉の健全部に比べ付傷部に多いこと が判明した。npX は Xav への増殖抑制能を有すること も判明した。本試験により，npX 液剤のレタス斑点細菌 病の生物防除効果を実証した。引 用 文 献
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