タンパク解析技術を用いた化学物質の生殖発生毒性評価法に関する研究

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Title

タンパク解析技術を用いた化学物質の生殖発生毒性評価法

_{に関する研究( 内容の要旨(Summary) )}

Author(s)

宇佐見, 誠

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(農学) 乙第126号

Issue Date

2008-09-10

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/33627

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氏名(本(副籍) 学位の種類学位記番号学位授与年月日学位授与の要件学位論文題目審査委旦会宇佐見誠 (愛知県) 博士(農学) 農博乙第126号平成20年9月10日学位規則第3条第2項該当タンパク解析技術を用いた化学物質の生殖発生毒性評価法に関する研究主査岐阜大学教授副査静岡大学教授副査岐阜大学准教授副査信州大学教授守也淳忠哲弘井坂澤井土高岩辻論文の内容の要旨近年のタンパク解析技術の進歩は目覚しく､分子間相互作用による生体機能の解析や､組織中のピコモル単位のタンパク質を網羅することができるプロテオクスを可能にしている｡これらの解析技術を､化学物質の毒性スクリーニングや毒性発現の機序解明などに応用できれば､これまでほとんど行われていなかったタンパク解析技術を用いた生殖発生毒性の研究が目覚しく進展することとなる｡そこで本研究では､生殖発生毒性研究における新しいタンパク解析技術の応用として､表面プラズモンバイオセンサーを用いた化学物質のエストロゲン受容体結合能測定法の開発および二次元電気泳動を用いた培養ラット胚のプロテオミクス解析法の開発を行った｡まず､放射性標識および蛍光標識化合物を必要としない表面プラズモンバイオセンサーを用いた簡便な化学物質のエストロゲン受容体結合能測定法の確立を試みた｡すなわち､表面プラズモン効果を応用したバイオセンサーであるビアコアバイオセンサーにおいて､合成したアミノ化estradiol(E2-17PeNH)をリガンド､およびヒト組み替えエストロゲン受容体(hrERa)を高分子相互作用分子とし､被験物質をアナライトとした｡その結果､被験物質のhrERaへの結合は､hrERaのE2-17PeNHへの結合の減少として測定することができ､簡便なエストロゲン受容体結合能測定法を確立した｡次に､インビトロの発生毒性研究における簡便なプロテオミクス解析法として､培養ラット胚タンパクの二次元電気泳動法の確立を試みた｡その結果､一次元目に固定化p8勾配等電点電気泳動法を､二次元目にドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動法を用いて種々改良を重ね､ラット妊娠10.5日胚または卵黄嚢膜1検体から約800個､1,000個のタンパクスポットが各々検出できた｡さらに質量分析装置を用いて､これらのタンパクスポットの中での組織特異的な機能に関与するタンパクを同定し､二次元電気泳動マップの作成を可能にした｡この改良した電気泳動法は､インビトロの発生毒性研究における胚タンパクの二次元電気泳動解析法として有用であるとともに､培養胚のプロテオミクス解析が発生毒性学における新しい研究法の1つになりうることを確認した｡

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-87-最後に､本研究で確立した方法を用いて､セレンの胚毒性を培養ラット胚のプロテオミクス解析により調べ､月杢本体および卵黄嚢膜において胚毒性の発現に関与する可能性があるタンパクを同定した｡これらのタンパクは､セレンの胚毒性の発現に関与する可能性があると考えられ､さらに発生毒性研究においてバイオマーカーとして利用できるものと推察された｡以上の研究結果から､化学物質が引き起こす発生毒性について組織特異性機能タンパクなどを介して詳細に追及することができるようになり､化学物質の生殖発生毒性評価法を開発することができた｡審査結果の要旨本研究は､生殖発生毒性研究における新しいタンパク解析技術の応用として､表面プラズモンバイオセンサーを用いた化学物質のエストロゲン受容体結合能測定法の開発および二次元電気泳動を用いた培養ラット胚のプロテオミクス解析法の開発を行ったものである｡近年のタンパク解析技術の進歩は､分子間相互作用による生体機能の解析や､組織中のピコモル単位のタンパク質を網羅することができるプロテオクスを可能にした｡これらの解析技術を､化学物質の毒性スクリーニングや毒性発現の機序などに応用できれば､これまでにほとんど行われていなかったタンパク解析技術を用いた生殖発生毒性の研究が目覚しく進展する｡そこで､この研究では､｢バイオセンサーを用いた化学物質のエストロゲン受容体結合能測定法の開発｣､｢培養ラット初期着床胚タンパクの二次元電気泳動法の確立｣､｢培養ラット初期着床胚のプロテオーム解析｣および｢セレンの培養ラット胚に及ぼす影響のプロテオクス解析｣について研究した｡まず､表面プラズモンバイオセンサーを用いた､放射性標識および蛍光標識化合物を必要としない簡便な化学物質のエストロゲン受容体結合能測定法を確立した｡すなわち､表面プラズモン効果を応用したバイオセンサーであるビアコアバイオセンサーにおいて､合成したアミノ化estradiol(E2-17PeNH)をリガンド､ヒト組み替えエストロゲン受容体(hrERa)を高分子相互作用分子とし､被験物質をアナライトとした｡被験物質のhrERaへの結合は､hrERaのE2-17PeNHへの結合の減少として測定できた｡次に､インビトロの発生毒性研究における簡便なプロテオミクス解析法として､培養ラット胚タンパクの二次元電気泳動法を確立した｡一次元目に固定化pH勾配等電点電気泳動法を､二次元目にドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動法を用いて種々改良を重ね､ラット妊娠10.5日胚ひとつから約800個のタンパクスポットが検出できた｡また､質量分析により81個のタンパクスポットを同定し､二次元電気泳動マップを作成した｡この改良した電気泳動法は､インビトロの発生毒性研究における胚タンパクの二次元電気泳動解析法として有用であることが判明したこととともに､ラット培養胚のプロテオミクス解析が､発生毒性学における新しい研究法の1つになることも確認できた｡すなわち､胚本体および卵黄嚢膜についてそれぞれ約800個および1,000個のタンパクスポットのうち､胚本体(126スポット)または卵黄嚢膜(304スポット)に組織特異的な機能に関与するタンパクを同定することが出来た｡最後に､本研究で確立した方法を用いて､セレンの胚毒性を培養ラット胚のプロテオミクス解析により調べ､胚本体および卵黄嚢膜において胚毒性の発現に関与する可

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-88-能性があるタンパクを同定した｡これらのタンパクは､セレンの胚毒性の発現に関与する可能性があると考えられ､さらに発生毒性研究においてバイオマーカーとして利用できるものと推察された｡以上について､審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合農学研究科の学位論文として十分価値あるものと認めた｡学位論文の基礎となる学術論文は以下の通りである｡･UsamiM,MitsunagaK,OhnoY･Estrogenreceptorbindingassayofchemicals withasurfhceplasmonresonancebiosensor･JSteroidBiochemMoIBiol, 81:47-55.2002. ･UsamiM,MitsunagaE,NakazawaK･Two-dimensionalelectrophoresisof proteinfromculturedpostimplantationratembryosfordevelopmentaltoxicity studies. ToxicolInVitro,21:521･526.2007. ･UsamiM,MitsunagaK,NakazawaK.Comparativeproteomeanalysisofthe embryoproperandyolksacmembraneofdayll･5culturedratembryos･ BirthDefectsResB,80:383･395.2007. ･Usami,M.,Mitsunaga,K.Nakazawa,K.andDoi,0.Proteomicanalysisof seleniumembryotoxicityinculturedpostimplantationratembryos･Birth DefectsResB,83:80･96.2008. その他参考となる学術論文は､合計24編(筆頭9編､その他15編)である｡