Title
p53/Mieap-regulated mitochondrial quality control plays an
important role as a tumor suppressor in gastric and esophageal
cancers( 内容と審査の要旨(Summary) )
Author(s)
佐野, 仁哉
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(医学) 甲第1143号
Issue Date
2020-12-16
Type
博士論文
Version
none
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/79930
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名 （ 本 籍 ） 佐 野 仁 哉 （岐阜県） 学 位 の 種 類 博 士（医学）
学 位 授 与 番 号 甲第 1143 号
学 位 授 与 日 付 令和 2 年 12 月 16 日 学 位 授 与 要 件 学位規則第４条第１項該当
学 位 論 文 題 目 p53/Mieap-regulated mitochondrial quality control plays an important role as a tumor suppressor in gastric and esophageal cancers
審 査 委 員 （主査）教授 長岡 仁
（副査）教授 小川 武則 教授 森重 健一郎
論 文 内 容 の 要 旨 【緒言】
p53 は DNA の障害下, 転写因子として様々な標的遺伝子の発現を制御し，癌抑制に働く。p53 の標 的遺伝子であるMieap(Mitochondria-eating protein)は，①活性酸素種(ROS)を産生し，エネルギー 産生の低下した不良なミトコンドリアを修復する(MALM), ②品質の低下したミトコンドリアを巨大 な液胞様構造体へ取り込んで分解・排除する(MIV)，という機能を持つことが判明している。先行研 究では，Mieap は, BNIP3, NIX をコファクターとして細胞内に蓄積した ROS レベルを下げ，ミトコン ド リ ア の 品 質 管 理(MQC; Mitochondria quality control) を 行 っ て お り , こ の 際, p53-Mieap-BNIP3/NIX で制御される MQC が細胞の癌化や悪性化に関係していることが示唆された。特に乳癌細胞 では，Mieap 強制発現によって Caspase 依存性のアポトーシスが誘導されること，消化器癌マウスモ デルにおいて，Mieap が腸管ポリープや癌の発生に抑制的に働くこと，ヒト大腸癌，乳癌において， p53 遺伝子変異，Mieap，BNIP3プロモーター領域のメチル化など MQC 経路の不活化が高率に起こって いることが報告された。以上のことから，胃癌や食道癌における，Mieap 発現の癌細胞に及ぼす影響， MQC 経路の不活化について検討した。 【対象と方法】 ⒈ Mieap の発現による胃癌細胞株のアポトーシス誘導評価の検討：
Mieap 発現アデノウイルス(Ad-Mieap)を用いて胃癌細胞株(MKN1，MKN45，TMK1)に Mieap を強制発 現(5-60moi)させ，各細胞株の形態学的特徴，細胞周期を光学顕微鏡，Fluorescence activated cell sorting（FACS）にて評価した。更にこの時の Caspase 活性，アポトーシス関連タンパク質の変化に ついて Caspase assay，Western blot にて観察した。
⒉ ヒト胃癌・食道癌細胞株，臨床検体における MQC 経路(p53-Mieap-BNIP3/NIX)異常に関する検討： 胃癌細胞株(MKN1，MKN7，MKN45，MKN74，TMK1，KATOⅢ，SH-10-TC)，食道癌細胞株(TE1，TE4，TE5，
TE10，T.T，T.Tn，KYSE70)，当院の手術検体から採取した胃癌(47 例)および食道癌(12 例)の凍結組 織を用いて，Mieap，BNIP3，NIXプロモーター領域のメチル化をメチル化 PCR(MSP)にて，p53変異 の有無をダイレクトシークエンス法にて解析した。
【結果】
⒈ 胃癌細胞株 MKN1，MKN45，TMK1 に Ad-Mieap(30moi)を感染させると，24 時間後に Mieap が過剰発 現し，細胞質に液胞様構造体である MIV が出現した。さらに 48～72 時間後，MKN1，TMK1 は濃度依 存性に細胞死に至り，FACS で細胞周期を観察すると，対照の Ad-EGFP(30moi)感染株と比べて
sub-G1 が増加した。また，Caspase assay では， Mieap 過剰発現の 72 時間後，3/7, Caspase-9 の有意な活性化上昇を認め，Western blot でも，Caspase-3,Caspase-9 の活性化に伴う PARP の断片化を認 めた。一方， MKN45 は同条件下で sub-G1 が少なく，3,9 活性化が軽度にとどまり， Caspase-3,9 の活性化に伴う PARP の断片化を示さなかった。また，いずれの胃癌細胞株においても，Mieap の過剰発現で NIX の発現上昇を示したが，BNIP3 の発現，LC-3 分解には関与しなかった。 ⒉ 胃癌・食道癌細胞株を用いた MSP，p53 変異解析では，すべての細胞株で，p53に変異を認め，Mieap， BNIP3のメチル化と併せて MQC 経路全体で高率に不活化していた。胃癌・食道癌組織を用いた解析 では，胃癌においては 70.2％，食道癌においては 83.3％で MQC 経路が不活化していた。また，胃 癌患者の正常粘膜上皮においても，BNIP3のメチル化が高率に認められた。 【考察】
胃癌細胞に Mieap を過剰発現させると，Caspase-3,9 活性を中心とした内因性 Caspase 依存性のア ポトーシスが誘導された。特に，TMK1 は高い Caspase 活性を示し，Mieap 感受性で細胞死が起こりや すいのに対して，MKN45 は Caspase 活性が低く，Mieap 耐性で細胞死が起こりにくいと判断された。 これは Mieap が, 癌細胞における不良ミトコンドリア由来の ROS を感知し，癌細胞を生存させるか， 細胞死させるかのチェック機構を担っている可能性があると考えられる。また，ヒトの癌における MQC 経路破綻の頻度は，既出の乳癌 26.1％に対して，大腸癌 79.5％，本研究の胃癌 70.2％，食道癌 83.3％ と消化管癌で高率であった。消化管癌では, BNIP3の不活化頻度が高く，特に胃癌では前癌状態から 高率なメチル化が生じていた。これらのことから，p53-Mieap-BNIP3/NIX を介した MQC 機構は消化管 癌の発生・進展において重要な働きをしており，Mieap を中心とした MQC 制御は，癌を抑制する主要 な現象のなかのひとつであると考えられる。 【結論】 Mieap は，上部消化管癌において癌の進展を阻止する癌抑制遺伝子であり，p53-Mieap 調整性 MQC 経路の異常が，消化管癌の発癌に関与している可能性が示唆される。 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 申請者 佐野 仁哉 は，p53 下流遺伝子Mieapが上部消化管癌において，MQC 経路を介して癌抑制遺 伝子として機能することを示した。この抑制効果には癌細胞による差があり，Mieap が異常ミトコン ドリアの差を感知し，選択的に細胞死を誘導する新たな機能を持つことが示唆される。また，消化器 癌における MQC 経路消失機構も解明しており，その臨床的意義は高い。これらの研究成果は p53 の癌 抑制機能の一端を解明するものであり，外科腫瘍学の発展・進歩に少なからず寄与するものと認める。 ［主論文公表誌］
Hitoya Sano, Manabu Futamura, Siqin Gaowa, Hiroki Kamino, Yasuyuki Nakamura, Kazuya Yamaguchi, Yoshihiro Tanaka, Itaru Yasufuku, Akira Nakakami, Hirofumi Arakawa, Kazuhiro Yoshida：p53/Mieap-regulated mitochondrial quality control plays an important role as a tumor suppressor in gastric and esophageal cancers
Biochemical and Biophysical Research Communications ， 529 ， 582-589 （ 2020 ） DOI ： 10.1016/j.bbrc.2020.05.168
