修士論文の和文要旨研究科・専攻

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修士論文の和文要旨

研究科・専攻大学院情報理工学研究科基盤理工学専攻博士前期課程氏名萬代創太学籍番号 1833123

論文題目哺乳類受精卵における細胞内イノシトール三リン酸濃度変化の測定

要旨

【背景・目的】

哺乳類の受精卵では、長時間続く周期的な細胞内Ca²⁺濃度（[Ca²⁺]i）の上昇（Ca²⁺オシレーション）が生じることで、胚発生がトリガーされる。Ca²⁺オシレーションは、精子から移行したホスホリパーゼ C ゼータ（PLCζ）によって産生されるイノシトール三リン酸（IP3）が小胞体からの Ca²⁺放出を誘発することによって生じるとされているが、受精時の細胞内IP3濃度（[IP3]i）の変化の詳細は未だ明らかになっていない。本研究では、マウス卵の受精直後に予想される微小な[IP3]i

変化を検出するため、（１）蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用した高親和性IP3プローブの有効性の検証、（２）FRETペアの変更によるプローブのシグナル変化率の改善、および（３）IP3

親和性の最適化を試みた。

【方法】

高親和性IP3プローブには、蛍光タンパク質ECFPとEYFPの間のFRETを使ったCY-fretino-1.1 を用いた。またそのFRET ペアを緑色と赤色の蛍光タンパク質や循環置換変異型の蛍光タンパク質に入れ替えた8種類の改変型プローブを作製した。これらのcRNAをマウス未成熟卵に注入し、

16時間培養してin vitroで成熟させる間にプローブタンパク質を発現させた。蛍光性Ca²⁺プローブfura-2をロードした後、PLCζのcRNAを注入することでCa²⁺オシレーションを誘発し、fretino とfura-2の蛍光シグナルの経時変化を同時に記録した。さらに、fretinoのIP3親和性を段階的に下げるため、IP3結合ドメインのC末端の１〜４アミノ酸を欠損させたものを作製し、同様にマウス卵に発現させた後、静止状態でのFRETシグナルを計測して比較した。

【結果・考察】

先行研究では中程度の親和性のプローブ（CY-fretino-2.1）によってCa²⁺オシレーション開始前後の[IP3]i変化を明確には捉えられなかったのに対し、CY-fretino-1.1による測定ではCa²⁺オシレーションと同期した[IP3]iの変化を示すFRETシグナルの変化が検出され、高親和性プローブの有効性が示された。一方FRETペアを緑色/赤色蛍光タンパク質や循環置換型蛍光タンパク質に変更したプローブによる測定では、いずれも [Ca²⁺]iと相関した変化はみられなかった。IP3親和性の微調整を意図して作製した一連のプローブについては、従来のFRETペア（ECFP/EYFP）によるものは予想された通りの傾向の FRETシグナルを示したのに対して、他の蛍光タンパク質を用いたものについては親和性の違いとは一致しない値を示した。これらの結果は、fretinoの分子内FRET 効率およびそのIP3依存的変化には、IP3結合ドメインの立体構造だけでなく蛍光タンパク質の生化学的性質も影響している可能性を示唆するものであり、今後のプローブの改良に際しては、蛍光タンパク質間の直接的な相互作用等も考慮に入れた分子設計が必要であると考えられる。

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令和元年度修士論文

哺乳類受精卵における細胞内

イノシトール三リン酸濃度変化の測定

電気通信大学

基盤理工学専攻化学生命工学プログラム学籍番号１８３３１２３

氏名萬代創太

主任指導教員白川英樹准教授

指導教員狩野豊教授

提出日令和２年２月２８日

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カルシウムイオン（Ca²⁺）は生体内において細胞の増殖や分化、エネルギー産生、アポトーシスなどの様々な細胞機能の制御に関与する細胞内メッセンジャーである。近年では、細胞内イメージング技術の発達により、時間・空間的なパターンを持ったCa²⁺シグナルが細胞機能を調節することが明らかとなった。また、イノシトール1,4,5-リン酸(IP3)受容体を介したCa²⁺放出が、このCa²⁺シグナルの発生において重要な役割を担っており、時間・空間的なCa²⁺シグナルとIP3動態の関係性の解析が求められている。

哺乳類卵細胞内でもCa²⁺シグナルによる制御は行われており、受精時には長く続く周期的な細胞内Ca²⁺濃度の上昇が発生する。これはCa²⁺オシレーションと呼ばれ、多精拒否や細胞周期の進行をトリガーする、卵発生において重要な現象である^[1]。受精卵内のCa²⁺濃度の上昇はIP3シグナリング経路の活性によって誘発され、Ca²⁺オシレーションには細胞内小胞体のIP3受容体によるCa²⁺の放出が必要である^[2,3］。このことは、IP3受容体の阻害剤を用いた実験でIP3受容体ブロックをするとCa²⁺オシレーションが起こらないことから示された^[4]。また、Ca²⁺オシレーションは持続的にIP3を卵にインジェクションすることによっても引き起こされる^[5]。

哺乳類卵細胞が精子と融合すると、精子細胞質からホスホリパーゼCζ（PLCζ）と呼ばれる酵素が卵細胞質中へと移行する。PLCζは卵細胞膜のホスファチジルイノシトール

4,5-二リン酸（PIP2）を加水分解し、IP3とジアシルグリセロールを生成する。このIP3が

細胞質内小胞体上のIP3受容体（IP3R）に結合し、細胞質内にCa²⁺を放出させる。PLCζ の酵素活性はCa²⁺により増強され、更なるIP3の精製を促進する（図1.1）^[6,7]。PLCζの

RNA^[8,9]またはPLCζのタンパク質^[10]をマウスの卵細胞にインジェクションし発現させる

とCa²⁺オシレーションが引き起こされる。PLCζはPIP2を加水分解する酵素活性のためのCa²⁺感受性が他のPLCζに比べて高い^[11,12]。この高いCa²⁺感受性により起こる、放出されたCa²⁺からIP3を生成する高速のサイクルがCa²⁺オシレーションを生み出している可能性がある^[13-15]。

小胞体内のCa²⁺濃度は低下するが、細胞質内のCa²⁺が小胞体に存在するCa²⁺ポンプに

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図1.1 受精時におけるCa²⁺放出機構

① 卵と精子が融合すると、PLCζ が精子から卵細胞質へと移行する。

② PLCζ は膜脂質にあるPIP2を加水分解し卵細胞質中にIP3を産生する。

③ IP3は細胞質内小胞体のIP3 受容体に結合する。

④ ③により細胞質中へにCa²⁺が放出される。

⑤ 放出されたCa²⁺は PLCζ の酵素活性を促進しさらなるIP3の生産を促す。

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よって再び小胞体内に取り込まれることにより、小胞体にCa²⁺が再充填される。この過程には、細胞膜上のCa²⁺透過性チャネルを介した細胞外からのCa²⁺流入も関与していると考えられるが、そのイオンチャネルの実態やその制御機構などの詳細は不明である。

1.2. FRETの原理

蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Resonance Energy Transfer、FRET）とは、近接した二つの色素分子あるいは発色団の間で、励起光による励起エネルギーが、電磁波にならずに電子の共鳴により直接移動する現象を指す。ドナーで吸収された励起光のエネルギーがアクセプタに移動することで、アクセプタ側から蛍光が発せられる^[16-18]。ドナーおよびアクセプタからの蛍光強度の変化から、タンパク質の構造変化など、分子の動態や反応を捉えることができるため、FRETは細胞のイメージングにおいて非常に有用である。

また、FRET効率はドナーの発光スペクトルとアクセプタの吸収スペクトルの重なりの大きさや、二分子の角度と距離、電気双極子の配向などに影響される^[19]。近年では、従来の青色および黄色蛍光タンパク質ペアではなく、光安定性に優れた緑色および赤色蛍光タンパク質のペア^{[20, 21]}や、蛍光タンパク質のN末端およびC末端を人工的にリンカーで接続し、別の箇所を切断することで新たなN末端およびC末端を作成する循環置換変異を加えた蛍光タンパク質ペア^[22]の開発など、FRET効率の向上のための蛍光タンパク質ペアの最適化に関する研究が多く行われている。さらに、二量体形成による他の分子との予期せぬ相互作用を防ぐため、単量体を形成する蛍光タンパク質の開発も行われている。

1.3. FRET型IP3蛍光プローブによるIP3動態の観察

先に述べたように、Ca²⁺オシレーションとIP3は深く関わっており、細胞内のIP3濃度の変化を観察することはCa²⁺オシレーションについて研究する上で重要である。IP3濃度変化の測定には、GFP-PHD^[23]というGFPとPLCδのpHドメインの融合タンパク質が用いられていた。GFP-PHDはPIP2をモニターするが、IP3がPIP2と競合的にGFP-PHD と結合するため、細胞膜上のPIP2と結合したGFP-PHDが遊離し、IP3動態を観測することができる。しかし、GFP-PHDの細胞質への遊離はPIP2の代謝や、他のPIP2結合タンパク質の影響によっても起きることから、IP3特異性についての問題が存在した。

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現在では、IP3受容体のリガンド結合ドメインを用いたIP3特異性の高い蛍光タンパク質プローブが開発されている。IP3受容体リガンド結合ドメインには、N末端にIP3の結合を弱めるサプレッサー領域を、C末端にIP3が結合するコア領域が存在する。IP3プローブ

LIBRA^[24]は、リガンド結合ドメインの全体が使われているため、低いIP3親和性を持つプ

ローブである。一方で、Fretino^[16-18]やIRIS^[25]というIP3プローブはリガンド結合ドメインのコア領域のみが使われているため、比較的高いIP3親和性を持っている。一般的な細胞では高親和性プローブを用いる場合、無刺激時の細胞内IP3に反応してしまうため検出機能が低下してしまう恐れがある。しかし、哺乳類卵細胞の受精時におけるIP3濃度は非常に低く、微小な変化の検出が求められるため、高親和性プローブを用いる必要がある。

本研究では、IRISよりもIP3親和性が高く、微小な変化の検出に長けていることから、

Fretinoを用いて測定および改良を行った。

Fretinoはシアン（Cyan）とイエロー（Yellow）の蛍光タンパク質であるECFPと

EYFPを、1型のIP3受容体を用いて結合したFRET型のIP3プローブであり、IP3受容体へのIP3結合により構造変化が起こりEYFPからの蛍光がECFPの蛍光へと変わる（図 1.2）。このため、ECFPとEYFPの蛍光強度比（ECFP/EYFP）を取ることでIP3濃度の変化を観察することができる。先行研究より、SatoらはFretino（高親和性）、Fretino-2（中程度の親和性）、Fretino-3（低親和性）を作製している(図1.3、図1.5)。以後、本論文では作製したプローブのIP3親和性やFRETペアの違いを明示的に表すために、従来の Fretinoを”CY-fretino-1.1”、Fretino-2を”CY-fretino-2.1”と呼ぶこととし、”Fretino”という呼称は一連のIP3プローブ全体を指すものとして用いる。また、本研究で作製したプローブについては、図中に示した名称で呼ぶこととする（図1.3、図1.4）。

1.4. 本研究の目的と概要

CY-fretino-1.1のIP3R部分に変異を加えたCY-fretino-2.1を用いることで、マウス卵細胞内でのCa²⁺オシレーション中のIP3濃度変化を観測することができ、受精卵ではIP3濃度が持続的に上昇していること、またPLCζ存在下では、卵細胞内のCa²⁺濃度の一過性の上昇に伴ってIP3濃度も一過的に上昇することが明らかになった^[26]。しかし、CY-

fretino-2.1ではCa²⁺オシレーションがある程度進行してからでなければCa²⁺濃度上昇に伴

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図1.2 Fretinoの動作原理

IP3がIP3受容体に結合していない状態ではFRETが起こり、ECFP（ドナー）を450 nmの波長で励起するとEYFP（アクセプタ）から535 nm蛍光を発する。 IP3がIP3受容体に結合すると構造変化が起きFRETが解かれ、ECFPを450 nmの波長で励起すると、

ECFPから480 nmの蛍光を発するようになる。

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図1.3 Fretinoのドメイン構造（青色および黄色蛍光タンパク質ペア）

本研究室ではCY-fretino-1.1（高親和性）、IP3R部分に変異を導入したCY-fretino-2（中程度の親和性）およびCY-fretino-3（低親和性）に加え、循環置換変異を加えた蛍光タンパク質を用いたCY-fretino-2.3~2.6を所持していた。本研究では新たに循環置換変異型蛍光タンパクを持つ高親和性プローブCY-fretino-1.3~1.6や、CY-fretino-1.1のIP3受容体部分についてC末端のアミノ酸残基を1~4つ除きIP3親和性の調整を試みたプローブCY- fretino-4.1~7.1を作製した。

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図1.4 Fretinoのドメイン構造（緑色および赤色蛍光タンパク質ペア）

本研究室ではCY-fretino-2.1の蛍光タンパク質ペアをTagGFP2とTagRFPの組み合わせへ変更したGR-fretino-2.1および2.2を所持していた。本研究では新たに、CY-fretino- 1.1の蛍光タンパク質ペアをTagGFP2とTagRFPの組み合わせへ変更したGR-fretino-1.1 および1.2や、CY-fretino-1.1~7.1の蛍光タンパク質ペアを緑色蛍光タンパク質Cloverと赤色蛍光タンパク質mRuby2の組み合わせへと変更したClRb-fretino-1.1~7.1を作製した。

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図1.5 FretinoおよびFretino-2のIP3親和性文献[16]より引用。

高親和性プローブFretino（Kd=7.6 nM）と中程度の親和性を持つプローブFretino-2

（Kd=190 nM）の各IP3濃度における蛍光強度比を表す。Fretino-2ではIP3濃度が低い場合、蛍光強度比の変化が小さくなってしまう。一方、Fretinoではより低濃度のIP3を検出できるが、高濃度になるにつれ蛍光強度比の変化は小さくなっていく。

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うIP3濃度の変化を観測することができなかった^[26]。原因として、Ca²⁺オシレーション早

期ではPLCζの酵素活性によるIP3の産生が少ないことが考えられる。

培養細胞内において、CY-fretino-1.1のIP3に対する親和性は非常に高く、濃度変化を検出することが難しいことから親和性を下げたCY-fretino-2.1が用いられていた^[16]。しかし、IP3の産生が少ないCa²⁺オシレーション早期のIP3濃度の検出であれば、親和性の高

いCY-fretino-1.1を用いることで微小な濃度変化を検出できると考えられる。したがっ

て、本研究ではCY-fretino-1.1を用いることで、CY-fretino-2.1を用いた場合では検出することのできなかったCa²⁺オシレーション早期のIP3濃度変化を捉えることを目的とした

（図1.6）。

次に、この実験から有効であることが示唆されたCY-fretino-1.1の蛍光タンパク質ペアへ変異を加えることによるFRET効率の向上を試みた。ここでは先行研究に従い、FRET 効率の向上が報告されている赤色および緑色蛍光タンパク質ペアおよび循環置換変異を加えた蛍光タンパク質ペアを持つFretinoを作製した。本研究室では以前、CY-fretino-2.1の蛍光タンパク質ペアをTagGFP2およびTagGFP2Δ10とTagRFPの組み合わせに変えた GR-fretino-2.1およびGR-fretino-2.2^[28]、そして循環置換変異型の蛍光タンパクを用いた CY-fretino-2.3~2.6^[27]を作製したが、どれもCa²⁺オシレーション早期におけるIP3濃度変化検出への有効性は示されなかった。本研究では、有効性が示された高親和性プローブ CY-fretino-1.1の蛍光タンパク質について同様の変異を加えたGR-fretino-1.1および1.2、

CY-fretino-1.3~1.6について有効性を評価した。さらに、CY-fretino-1.1および2.1の蛍光タンパク質ペアを、FRET効率が向上したという報告がある緑色蛍光タンパク質Cloverと赤色蛍光タンパク質mRuby2のペアへと変更したClRb-fretino-1.1および2.1についても同様に有効性を評価した。

また、高いIP3親和性親和性を有するCY-fretino-1.1と中程度のIP3親和性を有するCY-

fretino-2.1はどちらもCa²⁺オシレーション早期におけるIP3濃度に対し、最適な親和性で

はないことでIP3濃度変化の検出機能が低下していると予想し（図1.7）、IP3親和性の最適化を試みた。IP3受容体部分のC末端のアミノ酸残基を減らすことで、IP3親和性が減少する^[29]という報告から、CY-fretino-1.1のIP3受容体部分のC末端のアミノ酸残基を1~4つ

削ったCY-fretino-4.1~7.1を作製し、IP3濃度変化の検出機能および静止状態における蛍

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図1.6 受精時あるいはPLCζのRNAインジェクション時の蛍光シグナル変化文献[26]より引用。

（A）CY-fretino-2.1発現卵における受精時の蛍光シグナル変化。Ca²⁺オシレーション（点線）に伴うC/Y比（実線）の変化は見られない。

（B）CY-fretino-2.1発現卵におけるPLCζのRNAインジェクション時の蛍光シグナル変化。Ca²⁺オシレーションがある程度進行した後はCa²⁺オシレーション（点線）に伴うC/Y 比（実線）の変化が見られるが、オシレーション早期では変化を捉えることができていない。

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図1.7 CY-fretino-1.1および2.1のIP3親和性の予想

以前の研究より、CY-fretino-2.1ではCa²⁺オシレーション早期におけるIP3濃度が低い場合にはIP3濃度変化を捉えることはできず、Ca²⁺オシレーションが繰り返され、IP3濃度が高くなるにつれ、検出が可能になることが示されている。また本研究でCY-fretino-1.1 ではIP3濃度が低い場合でも検出することはできるが、変化は小さいという結果が得られている。したがってCY-fretino-1.1および2.1のIP3濃度による変化域は図中の黒色の線で示される。IP3親和性の最適化を行うには、図中にオレンジ色で示した、これらの間の IP3親和性をもつプローブを開発する必要がある。

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光強度比からIP3親和性の変化を評価した。さらに、このCY-fretino-4.1~7.1の蛍光タンパク質をECFPとEYFPからCloverとmRuby2へと変更したClRb-fretino-4.1~7.1も作製し、同様の評価を行った。

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14 第2章実験方法

2.1.IP3プローブfretinoのcDNAコンストラクトおよびcRNAの作製 2.1.1. GR-fretino-1.1および1.2のcDNAコンストラクトの作製

GR-fretino-1.1-pGLS(A21)8TおよびGR-fretino-1.2-pGLS(A21)8T のcDNAコンストラクトは以下の手順で作製を行った。プラスミドDNA：CY-fretino-1.1-pGLS(A21)8Tを制限酵素（EcoRⅠ、SacⅠ）により切断したものをインサート、プラスミドDNA：GR-fretino- 2.1-pGLS(A21)8TおよびGR-fretino-2.2-pGLS(A21)8Tを制限酵素（EcoRⅠ、SacⅠ）により切断したものをベクターとし、それぞれをMonoFas® DNA精製キットを用いて精製を行った後、DNA Ligation Kitを用いてライゲーションを行った。

※ライゲーションを行った後はBacteria, XL-1 Blueへの形質転換を行い、LBプレート上へ撒き約16時間培養した。プレート培養後、コロニーピックアップを行い、LB液体培地

500 µL と50 mg/mLのアンピシリン0.5 µL を加えた1.7 mLチューブ内にて、少量の振盪

培養(190rpm、37℃)を7時間行った。培養後、Go Taq® Green Master Mixを用いてコロニーPCRを行い目的プラスミドDNAのスクリーニングを行った。続けて、LB液体培地 20 mLと50 mg/mLのアンピシリン20 µL を加えた50 mLチューブを2本用意し、それぞれ少量培養後のサンプル100 µLを加え、大量の振盪培養(190rpm)を37℃で16～18時間行った。大量培養後、Wizard® Midipreps DNA Purification Systemを用いてプラスミド DNAの精製を行い、冷蔵保存した。溶液調整および操作については各キットの説明に従い行った。

2.1.2. CY-fretino-1.3~1.6のcDNAコンストラクトの作製

CY-fretino-1.3-pGLS(A21)8T ~ CY-fretino-1.6-pGLS(A21)8T のcDNAコンストラクトは以下の手順で作製を行った。プラスミドDNA：CY-fretino-1.1-pGLS(A21)8Tを制限酵素

（EcoRⅠ、SacⅠ）により切断したものをインサート、プラスミドDNA：CY-fretino-2.3- pGLS(A21)8T ~ CY-fretino-2.6-pGLS(A21)8Tを制限酵素（EcoRⅠ、SacⅠ）により切断したものをベクターとし、それぞれをMonoFas® DNA精製キットを用いて精製を行った後、

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DNA Ligation Kitを用いてライゲーションを行った。

以降の操作は2.1.1.に記載した※と同様に行った。

2.1.3. CY-fretino-4.1~7.1のcDNAコンストラクトの作製

2.1.3.1. CY-fretino-4.1-pcDNA3.1~CY-fretino-7.1-pcDNA3.1の作製

プラスミドDNA：CY-fretino-1.1-pcDNA3.1をテンプレートとし、PrimeSTAR®

Mutagenesis Basal Kitを用いてhIP3R部分のC末端のアミノ酸を1つ～４つ除くように PCR増幅した。その後PCR産物についてMonoFas® DNA精製キットを用いてそれぞれ精製を行った。精製したPCR産物それぞれを制限酵素（EcoRⅠ、BamHⅠ）により切断したものをインサート、プラスミドDNA：CY-fretino-1.1-pcDNA3.1を制限酵素（EcoR

Ⅰ、BamHⅠ）により切断したものをベクターとし、それぞれをMonoFas® DNA精製キットを用いて精製を行った後、DNA Ligation Kitを用いてライゲーションを行った。

2.1.3.2. CY-fretino-4.1-pGLS(A21)8T ~ CY-fretino-7.1-pGLS(A21)8Tの作製

2.1.3.1.で作製したプラスミドDNA：CY-fretino-4.1-pcDNA3.1~ CY-fretino-7.1-

pcDNA3.1を制限酵素（EcoRⅠ、XbaⅠ）により切断したものをインサート、プラスミド

DNA：CY-fretino-1.1-pGLS(A21)8Tを制限酵素（EcoRⅠ、XbaⅠ）により切断したものをベクターとし、それぞれをMonoFas® DNA精製キットを用いて精製を行った後、DNA

Ligation Kitを用いてライゲーションを行った。

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2.1.4. ClRb-fretino-1.1、2.1、4.1~7.1のcDNAコンストラクトの作製 2.1.4.1. Clover部分およびmRuby2部分のPCR増幅

ClRb-fretino-fretino-1.1-pGLS(A21)8T ~ ClRb-fretino-7.1-pGLS(A21)8T のcDNAコンストラクトは以下の手順で作製を行った。プラスミドDNA：Clover-mRuby2-pcDNA3.1をテンプレートとし、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase を用いてClover部分および

mRuby2部分の配列をPCR増幅した。その後PCR産物についてMonoFas® DNA精製キ

ットを用いてそれぞれ精製を行った。

2.1.4.2. Clover部分の挿入

2.1.4.1.で精製したClover部分のPCR産物を制限酵素（EcoRⅠ、HindⅢ）により切断

したものをインサート、プラスミドDNA：CY-fretino-1.1-pcDNA3.1 ~ CY-fretino-7.1-

pcDNA3.1を制限酵素（EcoRⅠ、HindⅢ）により切断したものをベクターとし、それぞ

れをMonoFas® DNA精製キットを用いて精製を行った後、DNA Ligation Kitを用いてラ

イゲーションを行った。

2.1.4.3. mRuby2部分の挿入

2.1.4.1.で精製したmRuby2部分のPCR産物を制限酵素（BamHⅠ、XhoⅠ）により切

断したものをインサート、2.1.4.2.でClover部分の配列を挿入したプラスミドDNAそれぞれを制限酵素（BamHⅠ、EcoRⅠ）により切断したものをベクターとし、それぞれを

MonoFas® DNA精製キットを用いて精製を行った後、DNA Ligation Kitを用いてライゲ

ーションを行った。

2.1.4.4. ClRb-fretino-1.1-pGLS(A21)8T ~ ClRb-fretino-7.1-pGLS(A21)8Tの作製

2.1.4.3.で作製したプラスミドDNA：ClRb-fretino-1.1-pcDNA3.1~ ClRb-fretino-7.1-

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pcDNA3.1を制限酵素（HindⅢ、XbaⅠ）により切断したものをインサート、プラスミド

DNA：CY-fretino-7.1-pGLS(A21)8Tを制限酵素（HindⅢ、XbaⅠ）により切断したものをベクターとし、それぞれをMonoFas® DNA精製キットを用いて精製を行った後、DNA

Ligation Kitを用いてライゲーションを行った。

2.1.5. cRNAの作製

一般的に真核細胞では核内でDNAから転写されたRNAへpolyA鎖が付与され、細胞質にてmRNAはリボソーム上でタンパク質へと翻訳される。しかし、未成熟卵内では DNAからRNAへの転写が抑制されているため、外来性のタンパク質を発現させるためにはpolyA鎖を含むRNAの導入が必要となる。本実験では、ClRb-fretino-1.1-pGLS(A21)8T

~ ClRb-fretino-7.1-pGLS(A21)8Tについては制限酵素AflⅡを用いて、その他のfretinoについては全て制限酵素NdeⅠを用いて直鎖化した後、mMESSAGE mMACHINE™ T7 Transcription Kit T7により転写反応を行い、in VitroにてcRNA合成を行った。合成後、

RNeasy MinElute Cleanup KitでRNAの精製を行い、-80℃ のフリーザー内で冷凍保存した。

2.2.測定

本実験で発現させるタンパク質性蛍光プローブのRNAは長く、時間当たりの翻訳量が少ない。そのため、受精可能な成熟卵（第二次卵母細胞）になるまで可能な限り多くの時間培養するため、本実験では未成熟卵（第一次卵母細胞）の段階で採集しRNAを導入、

in vitroで成熟卵へと成熟させた後、測定を行った。

2.2.1. 未成熟卵採取

ddY（日本SLC）メスマウス（6週齢以上）に妊馬血清性腺刺激ホルモン（PMSG）を

約0.2 ｍL皮下注射して過排卵処置を行った。注射後約48時間後にマウスを頸椎脱臼し、心肺が停止したことを確認した後、腹部全体を消毒用アルコール綿で拭き、陰部のす

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ぐ上の腹部を剪刀およびピンセットで開胸した。卵巣を摘出し、付着した血液や脂肪をキムワイプでふき取り、M2培地ドロップへ移し、ピンセットで押さえながら注射針で卵巣を細かく切り、未成熟卵を採集した。その後、ガラスピペットを用いてBSAを加えたM2

（M2+）培地ドロップ内で洗浄した。

2.2.2. 未成熟卵へのfretinoのRNA導入

本研究では微量のRNAを導入するための方法としてマイクロインジェクション法を用いた。測定用ガラスディッシュにM2＋培地ドロップ 400µL を加え、揮発を防ぐため流動パラフィンで表面を覆った。未成熟卵をこのドロップ内へと移し、倒立顕微鏡下でホールディングピペットにより固定し、マイクロインジェクションピペットでRNAを注入した。注入後、前日よりpHを調製しておいたBSAを加えたM16（M16＋）培地ドロップ内へと移し、37℃、5％ CO2インキュベーター内で約18時間培養した。

2.2.3. Ca²⁺オシレーションに伴った蛍光強度比の測定

2.2.2で培養した卵をFura-2-AMドロップへ移し、37℃、5％ CO2インキュベーター内

で10分間ロードした。M2＋培地ドロップ内で洗浄した後、2.2.2.と同様に測定用ガラスディッシュを用意し、卵を測定用ディッシュへと移した。発現およびロードの確認を行った後、ホールディングピペットで固定し、マイクロインジェクションピペットでmPLCζ

のRNA(50 ng/µL)を注入した。RNA注入後、蛍光顕微鏡（図2.1）を用いて蛍光画像の連

続撮影を行った。励起光の光源としてはXeランプを用いた。各蛍光については、付録の表の組み合わせで測定した。取得した画像データは解析ソフトOptical Imageを用いて細胞全体の蛍光強度を平均化し、解析に用いた。

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図2.1 倒立型蛍光顕微鏡の概略図

励起フィルターでXeランプからの波長を選択し、選択された励起光はダイクロイックミラーによって反射され、卵細胞内の蛍光物質に照射される。蛍光物質から照射された光は、ダイクロイックミラーと蛍光フィルターを透過し、インテンシファイア付CCDカメラに到達する。

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2.2.4. 静止状態における蛍光強度比の測定

2.2.2で培養した卵をM2＋培地ドロップ内で洗浄した後、2.2.2.と同様に測定用ガラス

ディッシュを用意し、卵を移した。2.2.3.と同様に蛍光顕微鏡を用いての測定を行ったが、

ここでは卵の位置を撮影範囲の右上、右下、左上、左下の4か所へ移動させながら約5分間ずつ蛍光画像の連続撮影を行い、4か所での蛍光強度を平均することで測定場所による光ムラの較正を行った。取得した画像データについても同様に解析ソフトOptical Image を用いて細胞全体の蛍光強度を平均化、そして約5分間撮影した画像についても平均化し、解析に用いた。

(23)

21 第3章結果

3.1. 高親和性プローブの有効性の評価

CY-fretino-1.1を発現させた卵にmPLCζのRNAをマイクロインジェクションし、

fura-2およびCY-fretino-1.1の蛍光画像を撮影した（図3.1 A）。結果の解析には、fura-2

の340 nm励起の蛍光強度と380 nm励起の蛍光強度の比（340 /380比）をCa²⁺濃度変化

とし、CY-fretino-1.1のECFPの蛍光強度とEYFPの蛍光強度の比（C/Y比）をIP3濃度変化とし、解析を行った（図3.1 B）。CY-fretino-1.1発現卵では、Ca²⁺オシレーション早期におけるCa²⁺濃度の増加に伴ったC/Y比の変化が見られ、これは以前の研究でCY-

fretino-2.1を用いた際には検出することができなかった。さらに、Ca²⁺スパイクのピーク

を基準とし、スパイクの直前から約6分間でのC/Y比の変化についてファーストスパイクを除いたスパイクについて加算平均することで、Ca²⁺濃度増加によるC/Y比の変化を評価

した（図3.1 C）。Ca²⁺スパイクのピークを基準とした場合、スパイク直前のC/Y比は

0.99±0.014(平均±標準偏差)、スパイク後に最大となるのC/Y比は1.02±0.015となり、

有意差が確認された（p<0.01）。また、C/Y比は最大値となった後は低下していく様子が見られ、Ca²⁺オシレーションに伴ったC/Y比の周期的な変化を捉えることができている。

したがって、これらの結果より、Ca²⁺オシレーション早期におけるIP3濃度変化の測定に高親和性プローブが有効であることが示唆された。

3.2.変異型fretinoにおける有効性の評価

FRET 効率が向上し、より大きくドナーからアクセプタへのエネルギー移動が行われると、FRET が起きたときや解かれたときの蛍光強度比の変化は大きくなる。したがって、

FRET 型プローブではFRET 効率の向上によるプローブの改良が多く行われている。本研究では、有効性が示された高親和性プローブCY-fretino-1.1や、中程度の親和性をもつCY-

fretino-2.1 について、蛍光タンパク質を変更することで２つの蛍光タンパク質間の距離や

配向に影響を与え、FRET効率を変化させることを試みた。

(24)

22

図3.1 CY-fretino-1.1とfura-2の蛍光シグナルの変化

（A）撮影したCY-fretino-1.1発現卵の蛍光画像の例。

（B）PLCζ（50 ng/µL）のRNAをマイクロインジェクションした卵についての蛍光シグナルの変化。青色の実線はCY-fretino-1.1の蛍光強度比の変化（C/Y比）を、黒色の点

線はfura-2の蛍光強度比の変化を表している。C/Y比の変化がIP3濃度の変化を、fura-2

の蛍光強度比の変化がCa²⁺濃度の変化を表す。矢印で示した箇所についてCa²⁺スパイクに伴ったC/Y比の変化が見られた。

（C）Ca²⁺スパイクのピークを基準とした場合におけるスパイク前後のC/Y比変化の加算平均結果。**で示したスパイク前後のC/Y比においては有意差（p<0.01）が存在し、スパイクに伴いC/Y比が上昇している様子が見られた。

(25)

23

3.2.1. 緑色および赤色蛍光タンパク質プローブの有効性の評価

3.2.1.1. GR-fretino-1.1および1.2の有効性の評価

CY-fretino-1.1の蛍光タンパク質をTagGFP2およびTagGFP2Δ10とTagRFPの組み合わせへ変更したGR-fretino-1.1および1.2を発現させた卵にmPLCζのRNAをマイクロインジェクションし、fura-2およびGR-fretino-1.1および1.2の蛍光画像を撮影した（図

3.2 A）。結果の解析には、fura-2の340 nm励起の蛍光強度と380 nm励起の蛍光強度の比

（340 /380比）をCa²⁺濃度変化、GR-fretino-1.1および1.2のTagGFP2の蛍光強度と

TagRFPの蛍光強度の比（G/R比）をIP3濃度変化とし、解析を行った（図3.2 B,C）。

GR-fretino-1.1および1.2発現卵ではCa²⁺オシレーションと相関したG/R比の変化は検出

されなかった。このことからGR-fretino-1.1および1.2はIP3濃度変化の測定において有効性が示された高親和性プローブではあるが、fretinoの場合、蛍光タンパク質ペアを

TagGFP2およびTagGFP2Δ10とTagRFPの組み合わせに変えたことが構造や配向につ

いて問題が生じ、FRET効率を低下させ、IP3濃度変化の検出機能が低下してしまった可能性がある。

3.2.1.2. ClRb-fretino-1.1および2.1の有効性の評価

CY-fretino-1.1および2.1の蛍光タンパク質をCloverとmRuby2の組み合わせへ変更し

たClRb-fretino-1.1および2.1を発現させた卵にmPLCζのRNAをマイクロインジェク

ションし、fura-2およびClRb-fretino-1.1および2.1の蛍光画像を撮影した（図3.3 A）。結果の解析には、fura-2の340 nm励起の蛍光強度と380 nm励起の蛍光強度の比（340 /380比）をCa²⁺濃度変化、ClRb-fretino-1.1および2.1のCloverの蛍光強度とmRuby2 の蛍光強度の比（G/R比）をIP3濃度変化とし、解析を行った（図3.3 B,C）。しかし ClRb-fretino-1.1および2.1発現卵のどちらもCa²⁺オシレーションと相関したG/R比の変化は検出されなかった。蛍光タンパク質Clover、mRuby2はFRETプローブの改良のために作成され、FRET効率の向上が報告されていた蛍光タンパク質ペアであったが、fretino に用いた際には構造や配向の問題から有効ではなかったのだと思われる。

(26)

24

図3.2 GR-fretino-1.1および1.2とfura-2の蛍光シグナルの変化

（A）撮影したGR-fretino-1.1および1.2発現卵の蛍光画像の例。

（B,C）ｍPLCζ（50 ng/µL）のRNAをマイクロインジェクションした卵についての蛍光シグナルの変化。青色の実線はそれぞれGR-fretino-1.1および1.2の蛍光強度比の変化

（G/R比）を、黒色の点線はfura-2の蛍光強度比の変化を表している。G/R比の変化が IP3濃度の変化を、fura-2の蛍光強度比の変化がCa²⁺濃度の変化を表す。GR-fretino-1.1 および1.2のどちらの場合でもCa²⁺オシレーションに伴ったG/R比の変化は検出されなかった。

(27)

25

図3.3 ClRb-fretino-1.1および2.1とfura-2の蛍光シグナルの変化

（A）撮影したClRb-fretino-1.1および2.1発現卵の蛍光画像の例。

（B,C）mPLCζ（50 ng/µL）のRNAをマイクロインジェクションした卵についての蛍光シグナルの変化。青色の実線はそれぞれClRb-fretino-1.1および2.1の蛍光強度比の変化

（G/R比）を、黒色の点線はfura-2の蛍光強度比の変化を表している。G/R比の変化が IP3濃度の変化を、fura-2の蛍光強度比の変化がCa²⁺濃度の変化を表す。高親和性プローブClRb-fretino-1.1、中程度の親和性を有するプローブClRb-fretino-2.1のどちらを用いた際にもCa²⁺オシレーションに伴ったG/R比の変化は検出されなかった。

(28)

26 3.2.1.3. ClRb-fretino-1.1および2.1の有効性の評価

CY-fretino-1.1および2.1の蛍光タンパク質をCloverとmRuby2の組み合わせへ変更し

たClRb-fretino-1.1および2.1を発現させた卵にmPLCζのRNAをマイクロインジェク

ションし、fura-2およびClRb-fretino-1.1および2.1の蛍光画像を撮影した（図3.3 A）。結果の解析には、fura-2の340 nm励起の蛍光強度と380 nm励起の蛍光強度の比（340 /380比）をCa²⁺濃度変化、ClRb-fretino-1.1および2.1のCloverの蛍光強度とmRuby2 の蛍光強度の比（G/R比）をIP3濃度変化とし、解析を行った（図3.3 B,C）。しかし ClRb-fretino-1.1および2.1発現卵のどちらもCa²⁺オシレーションと相関したG/R比の変化は検出されなかった。蛍光タンパク質Clover、mRuby2はFRETプローブの改良のために作成され、FRET効率の向上が報告されていた蛍光タンパク質ペアであったが、fretino に用いた際には構造や配向の問題から有効ではなかったのだと思われる。

3.2.2. 循環置換変異型プローブの有効性の評価

CY-fretino-1.1 の蛍光タンパク質ペアを ECFPΔ11 と Venus、あるいはそれらの循環置換

変異体を組み合わせたペアへと変更したCY-fretino-1.3~1.6 を発現させた卵に mPLCζの RNAをマイクロインジェクションし、fura-2およびCY-fretino-1.3~1.6の蛍光画像を撮影

した（図3.4 A）。結果の解析には、fura-2の340 nm励起の蛍光強度と380 nm励起の蛍光

強度の比（340 /380比）をCa²⁺濃度変化、CY-fretino-1.3~1.6のECFPΔC11およびcpECFP の蛍光強度とVenusおよびcpVenusの蛍光強度の比（C/Y比）をIP3濃度変化とし、解析を行った（図3.4 B,C）。以前の研究でCY-fretino-2.3~2.6発現卵について測定を行った際、

Ca²⁺オシレーションに伴うIP3濃度変化を捉えることはできなかった。本研究では高親和性

プローブCY-fretino-1.3~1.6を用いたが、同様にIP3濃度変化を検出することができなかっ

た。これらから、fretinoに循環置換変異型の蛍光タンパク質を用いた場合でも、FRET効率が向上するような相互作用の変化は起きていないと考えられる。

(29)

27

図3.4 CY-fretino-1.3~1.6とfura-2の蛍光シグナルの変化

（A）撮影したCY-fretino-1.3～1.6発現卵の蛍光画像の例。

（B,C）mPLCζ（50 ng/µL）のRNAをマイクロインジェクションした卵についての蛍光シグナルの変化。青色の実線はそれぞれCY-fretino-1.3~1.6の蛍光強度比の変化（C/Y 比）を、黒色の点線はfura-2の蛍光強度比の変化を表している。C/Y比の変化がIP3濃度の変化を、fura-2の蛍光強度比の変化がCa²⁺濃度の変化を表す。しかし、循環置換変異型蛍光タンパク質を用いてもそれぞれのプローブでCa²⁺オシレーションと相関したC/Y比の変化は捉えられていない。

(30)

28 3.3.IP3親和性の調整についての評価

CY-fretino-1.1のIP3受容体部分のC末端のアミノ酸残基を1~4つ除いたCY-fretino- 4.1~7.1発現卵、およびClRb-fretino-1.1について同様にアミノ酸残基を除いたClRb-

fretino-4.1~7.1発現卵を用いて静止状態における蛍光強度比からIP3親和性の変化を調べ

た。静止状態においてはIP3親和性が高いほど、よりIP3と結合し蛍光強度比が高くなる。すなわち、高親和性プローブであるCY-fretino-1.1およびClRb-fretino-1.1の静止状態における蛍光強度比と、中程度の親和性を有するプローブCY-fretino-2.1およびClRb-

fretino-2.1の静止状態における蛍光強度比と比較し、静止状態においてこれらの中間の蛍

光強度比を持つプローブが高～中程度における中間のIP3親和性を有すると考えられる。

ここではまず、CY-fretino-1.1~7.1について静止状態のC/Y比を比較した（図3.5 A）。 CY-fretino-1.1発現卵では静止状態のC/Y比は0.66±0.02（平均±標準偏差）、CY- fretino-2.1発現卵では0.58±0.06であり、これらには有意差が確認された（p<0.01）。 CY-fretino-1.1および2.1のIP3親和性との関係性とも一致している。またCY-fretino- 4.1~7.1のC/Y比は順に0.64±0.03、0.65±0.04、0.65±0.04、0.63±0.03であり、CY-

fretino-1.1に比べて有意なC/Y比の低下は見られないが、わずかに平均値が低下している

様子が見られた。これは先行研究のIP3受容体部分C末端のアミノ酸残基を除去することでIP3親和性が低下するという報告と一致しており、CY-fretino-7.1の親和性がCY-

fretino-1.1と2.1の親和性の中間である可能性を示唆している。

一方、ClRb-fretino-1.1~7.1発現卵の静止状態におけるG/R比を比較すると、ClRb- fretino-1.1では2.81±0.26（平均±標準偏差）、ClRb-fretino-2.1では3.00±0.46であり、

それぞれのIP3親和性の関係性と対応していない。また、ClRb-fretino-4.1~7.1のG/R比は順に2.53±0.33、4.76±0.20、3.62±0.37、4.80±0.32であり、CY-fretino-1.1と

5.1~7.1の間には有意差が存在する（p<0.01）。IP3受容体部分のC末端のアミノ酸残基を

除いた場合の方がG/R比が高くなっており、以前の報告とは逆の結果となった。

(31)

29

図3.5 静止状態における蛍光強度比の比較

（A）CY-fretino-1.1~7.1についての比較。CY-fretino-1.1とCY-fretino-2.1の蛍光強度比には有意差があり、IP3親和性の関係性と一致する(**, p<0.01)。

（B）ClRb-fretino-1.1~7.1についての比較。ClRb-fretino-1.1とClRb-fretino-2.1の蛍光強度比には有意差がなく、予想されるIP3親和性の関係性とは一致しない。また、ClRb- fretino-1.1と比べ、ClRb-fretino-5.1~7.1では蛍光強度比が有意に大きく(**, p<0.01)、C

末端を削るごとにIP3親和性が低下する報告とは逆の結果となっている。

(32)

30 第4章考察

4.1.高親和性プローブの有効性について

本研究により、CY-fretino-1.1を用いた測定が、以前までのCY-fretino-2.1を用いた際には観測されなかった FRET 比の変化を捉え、高親和性プローブによる IP3動態検出の可能性が示された。これは、以前の低親和性プローブを用いた測定では Ca²⁺オシレーション早期におけるIP3濃度が非常に低く、プローブの変化域から離れていたことより変化が検出されなかったという予想と一致している。しかし、本研究で高親和性プローブにより観測されたFRET比の変化は非常に小さく、IP3動態を検出するプローブにはより大きなFRET比の変化が求められる。ここで、次に我々は蛍光タンパク質ペアに注目し FRET 効率を向上させることで FRET 比の変化を大きくする方法、および IP3親和性に注目し親和性の最適化により大きなFRET比の変化を得る方法を考え、プローブの改良を進めた。

4.2.蛍光タンパク質ペアの変更によるFRET効率の変化について

本研究では、先行研究で FRET 効率の向上が確認された緑色および赤色蛍光タンパク質ペアや、循環置換変異型蛍光タンパク質ペアを用いたfretinoを作製し、それぞれを用いた場合のCa²⁺オシレーション早期におけるFRET比の変化の検出を試みたが、どのプローブを用いた場合でもCY-fretino-1.1を用いた場合と比べ、FRET比の変化が大きくなる様子は見られなかった。CY-fretino-1.1 での測定時に見られた、Ca²⁺オシレーションと相関した FRET 比の変化もほとんど検出されず、蛍光タンパク質ペアの変更により FRET 効率が向上した様子は見られなかった。特に、緑色および赤色蛍光タンパク質ペアを用いた fretino については、アクセプタ（赤色蛍光タンパク質）よりもドナー（緑色蛍光タンパク質）の蛍光強度が大きいことから、CY-fretino-1.1に比べFRET効率が低下していると予想される。

FRET効率の主な影響因子は、2つの蛍光タンパク質間の距離や配向、励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりの 3 つである。この中でも蛍光タンパク質間の距離や配向は、蛍光タンパク質同士の相互作用や 2 つの蛍光タンパク質をつなぐリンカー部分の長さ等に影響され、容易に変化してしまう。したがって、先行研究では FRET 効率の向上が確認された場合でも、fretinoのようにIP3受容体部分を間に挟んだ構造では、そのリンカー部分の長さや相互作用により条件を同一にすることはできない。そのため、本研究では先行研究との様々な条件の違いにより、予想とは逆にFRET効率が低下してしまったのだと考えられる。

(33)

31 4.3.IP3親和性の最適化について

CY-fretino-1.1～7.1の静止状態におけるC/Y比は、CY-fretino-1.1と比べて有意な低下はしていなかったが、わずかに平均値が低下している。先行研究ではIP3受容体のC末端アミノ酸残基の欠損によるIP3親和性の低下が報告されており、本研究での C/Y 比の低下はこの親和性の低下に由来している可能性が考えられる。しかし一方で、緑色および赤色蛍光タンパク質ペアであるClRb-fretino-1.1～7.1の静止状態におけるG/R比は予想と全く異なっており、アミノ酸残基を偶数個欠損させた際には特徴的なG/R比の向上が見られた。4.2.

でのFRET効率の低下や、この静止状態におけるG/R比の変化から、緑色および赤色蛍光タンパク質ペアを用いた際の、FRETメカニズムへ影響が示唆される。

4.4.二量体形成の影響について

一般的に、FRET型プローブに用いられる蛍光タンパク質は、他の分子との予期せぬ相互作用を防ぐために単量体を形成するものが望ましいとされ、二量体形成を防ぐための変異が加えられているものが多い。しかし、fretino では二量体形成のための微弱な蛍光タンパク質間相互作用が FRET メカニズムに関わっている可能性があり、二量体形成を阻害する変異が FRET 効率の低下を引き起こしている恐れがある。本研究で用いた緑色および赤色蛍光タンパク質は単量体を形成するように開発された蛍光タンパク質であり、二量体形成を防ぐことで4.3.で述べたように FRETメカニズムへの影響が、FRET効率の低下やプローブの予期せぬ挙動を引き起こしている可能性が考えられる。

(34)

32 第5章まとめ及び今後の展望

CY-fretino-1.1発現卵においては、PLCζのRNAをマイクロインジェクションした際の

fura-2の蛍光強度比に伴った蛍光強度比の変化が観測されたことにより、CY-fretino-1.1

発現卵でのオシレーション早期におけるCa²⁺濃度上昇に伴うIP3濃度の増加を検出することができた。これにより、高親和性プローブがオシレーション早期のIP3濃度変化の検出に有効であることが明らかとなった。

次にFRET効率の向上のため、蛍光タンパク質ペアを変更したfretinoを作製し、プローブとしての機能の評価を行ったが、どのプローブを用いた場合でもCY-fretino-1.1を用いた場合と比べ、Ca²⁺濃度上昇に伴った蛍光強度比の変化は検出されなかった。これは蛍光タンパク質間の距離や配向が望ましくなく、FRET効率が変化していない、あるいは低下したことが予想される。

最後に、IP3受容体部分のIP3親和性に着目し、CY-fretino-1.1および2.1の中間の親和性を有するfretinoの作製を試みた。本研究で作製した親和性調節型のプローブの1つで

あるCY-fretino-7.1は先行研究の報告と同様にIP3親和性が低下している様子が見られ

た。しかし、ClRb-fretino-1.1~7.1では予想と逆の結果が得られ、蛍光タンパク質ペアに由来するFRETメカニズムへの影響が示唆された。

CY-fretino-1.1の変化も非常に小さく、プローブとしての検出機能の向上が求められる

等、本研究には多くの課題が残されている。本研究室では現在、fretinoに用いられている IP3受容体とはバリアントタイプが異なるIP3受容体を用いたfretinoの作製および評価、

そして二量体形成を促進する変異を加えたfretinoの作製および評価を行っている。一方で、今回は最大で4つのC末端アミノ酸残基の除去を行ったが、さらに除去していくことでの親和性の変化についても調べる余地がある。今後の研究では、このようにfretinoの FRETメカニズムへの影響因子の調査とIP3受容体部分についての改良を共に進め、最適なIP3親和性および蛍光タンパク質ペアを得ることが主な目的である。

(35)

33

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[25] T. Matsu-ura, T. Michikawa, T. Inoue, A. Miyawaki, M. Yoshida, K. Mikoshiba, Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells, J. Biol. Chem., 173-5(2006)755-65.

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Biophys. Res. Commun., 345 (2006) 781-788.

[27] 吉田嵩志, 改良型IP3可視化蛍光プローブの作製と評価, 電気通信大学情報理工学部先進理工学科卒業論文, 2015.

[28] 津野勇太,イノシトール三リン酸可視化のためのFRET型プローブの改良, 電気通信大学情報理工学部先進理工学科卒業論文, 2016.

[29] F. Yoshikawa, M. Morita, T. Monkawa, T. Michikawa, T. Furuichi, and K. Mikoshiba, Mutational Analysis of the Ligand Binding Site of the Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor, J. Biol. Chem., 271-30(1996)18277-84.

(38)

36 付録

・測定

蛍光観察を行う際に使用したフィルターの組み合わせを以下の表に記載した。

励起フィルターと蛍光フィルターの組み合わせ

励起フィルター蛍光フィルター

Fura-2(340) 340±5nm 535±12nm

Fura-2(380) 380±5nm

黄色蛍光タンパク質 450±5nm 535±12nm

青色蛍光タンパク質 480±15nm

緑色蛍光タンパク質 480±10nm 535±12nm

赤色蛍光タンパク質 580±15nm

・プライマー

以下にcDNA作製の際に使用したプライマーを記載する。

・IP3受容体部分C末端アミノ酸残基除去

名称配列

Eco-hITPR1-224_F AAAGAATTCATGAAATGGAGTGATAAC

hITPR1-575-Bam-R2 TTTGGATCCCAACACATCATAGCCAATC

hITPR1-576-Bam-R2 TTTGGATCCAGCCAACACATCATAGCC

hITPR1-577-Bam-R2 TTTGGATCCTTCAGCCAACACATCATAG

hITPR1-578-Bam-R2 TTTGGATCCGTCTTCAGCCAACACATC

(39)

37 使用機器及び試薬

（1）分子生物学用の使用機器

⚫ オートクレーブ（AUTOCLAVE：MLS-2420 （SANYO）

⚫ 乾熱滅菌器：NDN-400 （EYELA）

⚫ 上皿電子天秤：DL202-S （METTLER TOLEDO）

⚫ ブロックインキュベーター：Bl-516C or Bl-516H （ASTEC）

⚫ CO2インキュベーター：IT63 （HITECYamato）

⚫ クリーンベンチ：PCV （HITACHI）

⚫ サーマルサイクラー：PC320 （ASTEC）

⚫ 電気泳動装置：GelMate^®2000 （TOYOBO）

⚫ 電気泳動撮影用デジタルカメラ：SP-510UZ （OLYMPUS）

⚫ UV （ 302 / 365 nm ）トランスイルミネーター：TFML-20E （UVP）

⚫ デジカメ仕様ゲル撮影装置：PX410 （BIO CRAFT）

⚫ 卓上遠心分離機：チビタン（Millipore）

⚫ 微量高速冷却遠心機：MRX-150 （TOMY）

⚫ 微量高速冷却遠心機：MX-301 （TOMY）

⚫ 小型振盪（培養）機：DOUBLE SHAKER NR-3 （TAITEC）

⚫ 恒温槽（Hot & Cool Bath）：EHC （AS ONE）

⚫ 試験管ミキサー（ボルテックス）：TM-1 or HM-1 （AS ONE）

⚫ 分光光度計：Biophotometer （Eppendorf）

⚫ 吸引加圧ポンプ：USS型（NRK）

（2）細胞生理学用の使用機器

⚫ 電子分析天秤：AB54-S （METTLER TOLEDO）

⚫ pHメーター：pB-11 （Sartorius）

⚫ ホットスターラー：CHS-350 （AS ONE）

⚫ ブロックインキュベーター：Dry Thermo Unit DTU-1B （TAITEC）

⚫ CO2インキュベーター：BNS-110 （ESPEC CORP.）

(40)

38

⚫ 双眼実体顕微鏡：SMZ-2B （TRANSFORMER XN）（Nikon）

⚫ 蛍光顕微鏡：Axiovert S100TV （Carl Zeiss）

⚫ キセノンランプ：XPS100 （Nikon）

⚫ 励起光フィルター：MX340 （朝日分光）

⚫ 蛍光フィルター：480AF30 （Omega Optical）

⚫ 蛍光フィルター：535DF25 （Omega Optical）

⚫ ダイクロイックミラー：SU450/DM460 （Omega Optical）

⚫ キセノンランプ電源：C6979 （浜松ホトニクス）

⚫ リングヒーター：リングヒーター（室町製作所）

⚫ フィルター交換機：LAMBDA10-2 （Sutter Instrument CO.）

⚫ VIDEO SCOPE：ICCD-350F （Video Scope）

⚫ Micro Injector：IM300 （成茂）

⚫ マイクロマニピュレイター：MX-2 （成茂）

⚫ フッドスイッチ：TreadliteⅡ （Linemaster Switch Corporation）

⚫ 微小電極用増幅器：MEZ-8301 （日本光電）

⚫ パズコントローラ：SS-1433 （日本光電）

⚫ エアーコンプレッサー：YC-3F （八重崎空圧）

⚫ 共焦点顕微鏡：CSU10 （横河電気）

⚫ 温度計：MGA-Ⅱ （芝浦電子）

⚫ SUTTER INSTRUMENT：P-87（SUTTER INSTRUMENT COMPANY）

⚫ ホットプレート：MODEL HM-11 （ヤマト科学）

⚫ 50-ml シリンジ：SS-50ESZ （TERMO）

⚫ 1.0-mlシリンジ：SS-01T （TERMO）

⚫ 20G 注射針：NN-2038R （TERMO）

⚫ 27G 注射針：NN-2719S （TERMO）

⚫ 滅菌フィルター：Syringe Filter 33 mm （IWAKI）

(41)

39

⚫ プラスティックディッシュ：35×24 mm style （FALCON）

⚫ 角カバーグラス：24×24 No.1 （MATSUNAMI）

⚫ ワックス：Unility Wax （GC）

⚫ 測定用ディッシュ（Grass Bottom ディッシュ）

ボール盤を用いてPetriディッシュ（FALCON）に直径約12 mmの穴をあけ、

Utility Wax（大阪歯科工業株式会社）を使用して Cover Glass（MATSUNAMI）

で穴を塞いで作製

⚫ Injection pipette

ガラス管（G150-4, Warner Instrument 若しくはGC150F-10, CLAEK ELECTROMEDICAL INSTRUMENTS）を用いて作製

⚫ Holding pipette

ガラス管（GC100TF-10, CLAEK ELECTROMEDICAL INSTRUMENTS）を用いて作製

⚫ 未成熟卵採集用マニピュレーションピペット

100LAMBDA（cu, mm） with One Aspirator Tube （Drum Mond Scientific Company）を用いて作製

（3）解析用のフリーソフトウェア各種

⚫ ApE-A Plasmid Editor （プラスミドDNA作製）

⚫ Optical Image：NIHimage 1.62 b 30 （NIH, USA）

（4）分子生物学用の試薬核酸懸濁用の緩衝液

⚫ 10×TE （Tris/EDTA）

Tris （Trishydroxymethylaminomethane）（Wako） 100 mM EDTA （Ethylenediaminetetraacetic Acid）（Wako） 10 mM

修 士 論 文 の 和 文 要 旨 研究科・専攻