FD-LC-MS/MS
法を用いたタンパク質の 高感度分析に関する研究日大生産工 ○朝本 紘充 日大・薬 内倉 和雄 日大生産工 南澤 宏明 武蔵野大・薬 今井 一洋
【緒言】
近年、ポ ストゲノ ム研 究の中心 として、
遺伝情報 の最終産 物で あるタン パク質を 網 羅的に解 析するプ ロテ オミクス 研究が急 速 な発展を 遂げてい る。 なかでも 、老化や 病 態組織中 などで特 異的 な発現量 変化を示 す タンパク 質の解析 は、 各種疾患 のマーカ ー タンパク 質のみな らず 、創薬標 的の発見 に も繋がる ため重要 であ る。2次元 電気泳 動 (2-DE)法は、こ のよう なプロテ オミクス 研 究に取り 組む多く の機 関が採用 している 主 要な解析 法である が、 標識化試 薬の反応 率 の低さお よび分離 操作 の煩雑さ 等の理由 か ら、感度 と再現性 の面 で問題点 を有する 。 このため 、再現性 の高 い、高感 度なプロ テ オーム解 析法の開 発が 望まれて いる。
Toriumiらは 、チオ ール 基選択的 発蛍光誘 導体化試 薬であるSBD-Fに より生 体試料 中 のタンパ ク質を蛍 光誘 導体化(Fluorogenic derivatization: FD)し、 蛍光検出 器と組み 合 わせた高 速液体ク ロマ トグラフ ィー(HPLC) により分 離、検出 した 後、目的 タンパク 質 のみを抽 出し、こ れを 酵素水解 してHPLC- タンデム 型質量分 析計(LC-MS/MS)に 付し 同定する という新 規プ ロテオー ム解析法 (FD-LC- MS/MS法)を開 発した1)。 タンパ ク 質の分離 手段にHPLCを 適用した 同手法は 再現性の 高い定量 解析 を実現し た。しか し、
SBD基 は 水 溶 液 中 で 負 に 荷 電 す る こ と か ら 、 その誘導 体化物はpositiveモード のMSでの 検 出 感 度 が 低 い と い う 問 題 点 を 有 し て い た 。 そこでMasudaらは 、MSでの高感 度検出に 適 した構造 を有する 新し いチオー ル基選択 的 発蛍光誘 導体化試 薬で あるDAABD-Clを開 発した(図1)。DAABD-Clを用い た本手 法は 高い感度 と再現性 を有 し、実試 料中の
プロテオ ーム解析 に有 用である ことが証 明 された。こ うしたMSで の高感度 検出の実 現 に伴い、 本手法の 応用 により2-DE法 などの 従来法で は困難で あっ たマウス など小動 物 の微小組 織中タン パク 質の高感 度なプロ テ オーム解 析が実現 でき る可能性 が示唆さ れ た。そこ で本研究 では 、小動物 マウスの 微 小組織で ある脳各 部位 (大脳皮 質、海 馬及
び脳幹)内で 、加齢 に伴 い発現量 が変動す る
タンパク 質をFD-LC-MS/MS法 により 同定 し、各脳 部位の加 齢変 化の特徴 をプロテ オ ームの観 点から考 察し た。
【方法】
蛍光誘導 体化反応 は、3段階の成 長過程 (4、12および20週齢)に おけるマ ウスの大 脳 皮質から 抽出した 各々 の可溶性 タンパク 質
画分にpH8.7の塩酸グ ア ニジン緩 衝液で調
製したTCEP、EDTA並びにCHAPS溶液を加
え、最後 にDAABD-Cl/アセトニ トリル溶 液 を添加後 、40℃で10分 間加熱す ることで 行
なった。20% TFA溶液 を添加し て反応を 停
止させた 後、この 反応 溶液を直 接HPLC-蛍 光検出器 に注入し 、誘 導体化タ ンパク質 の
Study on High Sensitivity Analysis of Proteins by FD-LC-MS/MS Method
Hiromichi ASAMOTO, Kazuo UCHIKURA, Hiroaki MINAMISAWA and Kazuhiro IMAI
図1. DAABD-Clの 化 学 構 造 お よ び チ オ ー ル 基 と の 誘 導 体 化 反 応
−日本大学生産工学部第42回学術講演会（2009-12-5）−
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分離、検出を 行った。HPLCにお けるカ ラム にはタン パク質分 離用 カラムを 用いた。 加 齢に伴い 有意な変 動が みられた ピーク(p <
0.05, Tukey’s test)を分 取後、トリ プシン消 化 によりペ プチドへ と分 解した。 得られた ペ プチドの アミノ酸 配列 をLC-MS/MSより 決 定し、こ れをMASCOTデータベ ースと照 合 すること で変動し たタ ンパク質 の同定を 行 なった。 海馬およ び脳 幹内の変 動タンパ ク 質につい ても同様 の手 法により 同定した 。
【結果と 考察】
誘導体化 された大 脳皮 質中タン パク質を HPLCにより分 離した と ころ、約400 本 のピ ークが検 出され、 その うち15本 のピーク が 加齢に伴 い有意に 変動 した(図2)。 同様に 、 海馬およ び脳幹か らも 同程度の 総ピーク 数 を示すク ロマトグ ラム が得られ 、それぞ れ 10本およ び3本の ピーク が加齢に 伴い有意 に変動し た。また 、こ れらのピ ークの LC-MS/MS測定よ り、 計28種類 の加齢変 動 タンパク 質が同定 され た2)
質の放出 制御に関 与)は 唯一、加齢に 伴い増 加した。 これはSyn2 proteinが 加齢によ る神 経機能の 衰退に深 く関 与してい ることを
。この うち7種 類 は本研究 において 初め て加齢に よる変動 が 確認され たタンパ ク質 であった。なかで も、
海馬で同 定されたSyn2 protein (神経伝 達物
示唆して いる。大 脳皮 質では細 胞骨格タ ン パク質で あるβ-actinやcofilinな どの神 経細 胞の維持 に関与す るタ ンパク質 が12週齢 で 最大発現 量を示し 、そ の後減少 した。ま た 海馬では 、細胞骨 格タ ンパク質 を含むほ と んどの変 動タンパ ク質 が加齢に 伴い減少 し た。これ より、加 齢に よる神経 細胞機能 の 衰退開始 時期は、 大脳 皮質より も海馬の 方 が早い可 能性が示 唆さ れた。一 方、変動 タ ンパク質 数が他の 部位 より極端 に少なか っ た脳幹で は、細胞 骨格 タンパク 質のγ-actin
が12週齢 で最小発 現量 を示して 以降、ほ ぼ
変動しな かった。 細胞 骨格タン パク質は 神 経細胞数 を反映す るた め、脳幹 では加齢 に よる神経 細胞の衰 退が ほとんど 起こらな い 可能性が 示唆され た。
こうした 成果より 、DAABD-Clを 用いた FD-LC-MS/MS法は 、従 来法では 困難であ っ た微小組 織中タン パク 質の高感 度な分析 を 可能とし 、新たな 知見 を提供で きる有用 な 解析法で あること が証 明された 。
【参考文 献】
1) C. Toriumi, K. Imai: Anal. Chem., 75 (2003) pp. 3725-3730.
2) H. Asamoto, T. Ichibangase, K. Uchikura, K. Imai, J. Chromatogr. A, 1208 (2008) pp.
147-155.
図2. DAABD-Clに よ り 誘 導 体 化 さ れ た 各 週 齢 の マ ウ ス 大 脳 皮 質 中 タ ン パ ク 質 の ク ロ マ ト グ ラ ム
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