乳酸菌を用いた味噌における γ ア ミノ酪酸の生成

i 近畿大学農学部紀要 第 40号 39‑45 7) 39

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す る非 タ ンパ ク性 の ア ミノ酸 で､ ヒ トな ど晒乳 グル タ ミン酸脱 炭酸酵素活性 の高 い微生物 と L‑

動物の小脳 な どに存在 して､抑制性神経伝達物質 グルタミン酸 を発酵食品に添加 してインキュベ‑

と して機 能 している 1)｡具体 的には､血圧 降下作 トす れば､発酵 食品中にGABAが生成､蓄積 す 用や精神安定効果などが注 目されてお り､高血圧 ると考 えた｡

症や脳血流の改善による不 眠や彰 な どの予防､さ 乳酸菌 は古来 よ り発酵食品や飲料 の製造 に関与 らに腎機 能改 善効果が期待 されてい る｡一般 に し､乳酸発酵 をお こなって食品に保存性 と風味 を

200

乳酸菌を用いた味噌における γ ア ミノ酪酸の生成

岸本 憲 明*･上武 誠 * *･藤 田 藤樹夫 *

◆近畿大学大学 院農学研 究科応用生命化学専攻

‥ 近畿大学農学部応用生命化 学科

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認可 され､注 目を集めている 6｡

著者 らは､L グル タミン酸脱炭酸酵素が Lグ ル タミン酸 に働 くとGABAが生成す ることか ら､

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GABAは 1日に 20mg以上摂取す る と効果があ

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( mellas )葉 を嫌気処理 して作成 る と言 われている 2)0

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乳 酸 菌L illsh dii ､s occ mophi と La illsd ･ 8)

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したギ ヤバ ロン茶 3)には､通常のお茶 の約 3

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γ‑ア ミノ酪酸 os

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付与 して きた｡乳酸菌の中か らグル タミン酸脱炭 酸酵素活性 の高い株 が単離 されてい る｡ た とえ ば､ ヨーグル トやキムチの製造 に関わる非耐塩性 緒 言

ABA)は､天然 に広 く存在

倍 のGABAが含 まれてお り､ また玄米 を水 に浸潰

i revs u

I,acoactb illsb 9)か ら高い酵素活性が検 出 さ ことが報告 されている 4‑)5｡最近では GABA濃度 れている｡ しか し､味噌や醤油 など高濃度の食塩 を高めた乳酸菌発酵飲料が特定保健用食品 として を含 む発酵食品の製造 に関与 している耐塩 性乳酸

して腔 を発芽 させ る と､GABA濃度が上昇す る

0

4 岸本 意 明 ･上 武 誠 ･藤 田 藤樹 夫

菌 occsh hlll か ら､ グル タ ミン 酸脱炭酸酵素活性 の高い株 は報告 されていない｡

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T teragenoc 乳 酸 菌 を分 離 した｡ 分 離 源 の味 噌 10gに蒸 留 8

2 10ml

水 を 添加 し均 一 に懸濁後､遠心分離 で得 そ こで本研 究で は､多 くの市販味噌 中の食塩濃 た 上 清 に

V lを 1% (W/)と な る よ う に 添 加 した｡ この味噌抽 出液 100mlと3%(W/)莱

V 2

N Ca 度､1% (W/)N

菌 を耐塩性乳酸菌 と定義 し､味噌製造 に使用 され 天溶液 100mlを別 々に高圧 滅菌 した後 ､混合 し C

a V

2 l存在下で も生育で きる乳酸

て い る T hl h.aopilusと市販 お よび 自家製味 噌 か シャー レに分注 して､味噌抽 出液平板培地 を作成 ら単離 した耐塩性乳酸菌､醤油醸造用乳酸菌群 を した｡培地 中の食塩濃度 は､食塩濃度測定用屈折

計 S

株 をス ク リーニ ング した｡ しか し､供試株 の中か を用 いて測定 した｡

2

‑

対象 に､L‑グル タ ミン酸 を GABAに変換 で きる 8E (株式会社相互理化学硝子製作所 ､京都)

ら活性 の高い株 を兄いだす ことがで きなか った｡

一方､高 い グルタ ミン酸脱炭酸酵素活性 を もつ と報告 されている非耐塩性乳酸菌 L b )の休 止菌体 を 1%(W/)N lを含 む L‑グル タ ミン

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酸 Na( uN )溶液 中で イ ンキュベ

と､GABAが生 成 され る こ とを兄 い だ した｡ そ a

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80 i revs 凍 結 乾 燥 菌 懸 濁 液 (0.5gm/l) とLGuNa(l

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mg)を市販 味 噌 8gに添加 して 7日間 イ ンキ ュ

9mgの lOOml

ベ ‑ ト した と こ ろ､ 味 噌 1gあ た り L‑cysenti 00.1g ABAが生 産 され たの で､ そ れ らの結 果 を報告

す る｡

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材 料 お よび方 法 MRSB

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occ illsb NBRC 20005は､ 長 野 県 味 噌 工 業 協 同組 合 連 合 会 と 1

味 噌 醸 造 用 耐 塩 性 乳 酸 菌 N0

h l♪aohilus .3と ratroomtmpe erautrefr1o 8 e d t t xrace

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B eC (独立法人製 品評価技

術基盤機構生物遺伝 資源部 門,千葉県)か ら分譲

を受 けた｡ また､醤油醸造用乳酸菌群 は株 式会社 供試味噌 か ら耐塩性乳酸菌の単離

)N Cal 0

8 V

4 1

溶液で 1 コール)無添加 の市販味噌 6点 と自家製味 噌 5点 倍段 階希釈 した｡希釈 液 を味噌抽 出液平板培地 に か ら耐塩性乳酸菌 を分離 した｡供試味噌の食塩濃 塗抹 し､脱酸素剤 (三菱 ガス化学㈱ ) を入 れた嫌

% (W/)であ った｡ 気 パ ックに平板 を入 れて 2℃ で 6日間培 養 した｡

V ビオ ック (豊橋 市)か ら購 入 した｡保存料 (アル 供試味噌 1gを滅菌 6% (W/

‑ 11 度 は

得 られた コロニーの中か ら独立 した コロニー を味 供試培地 噌抽 出液培 地 に移植 し､28℃ で 3日間培養後､無 菌的に遠心分離 して集め た菌 を ‑80℃ で凍結保存 3

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T hl h.aop N0 の培養 に 供試株 の培養 には

用 い られてい る PH培地､乳酸菌の培養 に使用 さ した｡

れ る MRS培 地 と大 豆 抽 出液 添加 MRS培 地 を使

用 した (T bale1‑3)0 Ploypepotnは 日本製薬㈱ L‑グル タ ミン酸 を GABAに変換 で きる乳 酸菌 の t

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(東 京 )､Y とMRSB hはB tecon,

y(USA)か ら購入 した｡

探索 V 1

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Di nadC mp % (W/)グル タ ミン酸 ナ トリウム を添 加 し 味 噌抽 出液 平板 培 地 を用 い て味 噌 か ら耐塩 性 た PH培 地､MRS培 地､大豆抽 出液添加 MRS培

乳酸菌 を用いた味噌における γ‑ア ミノ酪酸の生成 41

弛lomlに､16.Ⅹ109 cumlf/ に調整 した乳酸菌懸 濁液 を 100 〟1接種 し､スクリューコック付 き試 験管で､28℃で 6日間静置培養 した｡2日ごとに 培養液 をサ ンプリング し濁度 を測定後､遠心分離 (12000rm, 0mi)p 1 n した上清のpHとグル タミ ン酸濃度 を測定 した｡ グルタミン酸 はF‑キ ッ ト し グル タ ミン酸 (..∫K イ ンターナ シ ョナル､東 京) を用いて定量 した｡ また､培養液上清 を蒸留 水で 100倍希釈 し､ フィルター渡過 した ものをア ミノ酸分析装置 (目立‑5800､東京)でGABAと L‑グルタミン酸 を定量 した｡

L̲ /vsbejNBRC 10 52 0 の耐塩性

1%( VW/ )LGl a‑ uN と0‑ 6 W/)Na%( V Clを含 be S む大豆抽 出液添加 MRS培 地 100mi に L. rvl' 懸濁液 (.Ⅹ16109 cumlf/ )を1ml接種 し､28℃で 6日間静置培養 した｡2日毎 に培養 液の濁度 と上 清のpH､し グルタミン酸濃度を測定 した｡

薄層 クロマ トグラフ ィー (TLC)を用 いた し グ ルタミン酸 と GABAの検出

アル ミシー トセルロースFプ レー ト(MERCK.

Germany)に､ 標 準 品 と 100倍 希 釈 試 料 を ス ポ ッ トし､2‑rpn l ds.Poao : itWae Actcaitr: ei cd /504: VVV:55(// )で展開 した｡ニ ンヒ ドリン溶 液 を噴霧後､加熱 して青紫色スポ ッ トを発色 させ た｡

beJsNBR 2 0

L. rv' C 10 5によるL･グルタミン酸か ら GABAへの変換

1% ( VW/)LGluNaを含 む大 豆 抽 出 液 添 加 MRS培地100mlに16.Ⅹ107 cumf/lとなるように i.brevisを接種 し､28℃で 6日間静置培養 した｡

培 養 液 のpHが 50.以下 に低 下 した後､再 び 58.

‑ 6.3まで上昇 して きた培養液 を遠心分離 (008 0 rpm､1 0mi)n して菌体 を回収 した｡0 (W/V)NaClを含む大豆抽出液添加 MRS培地

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1

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0

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mlに､前培 養 した菌懸濁 液 (.16Ⅹ1⁰¹0 f/cumlに 調整) を 1ml接種 し､3日間静置培養 した｡経時 的 にサ ンプ リング した培養液の濁度 とL‑グル タ ミン酸､GABA濃度 を TLCとア ミノ酸分析計で 測定 した｡

L. rvbe sI'NBRC 10 520 の凍結乾燥菌体の調製 1% (W/V)LGluNaを含 む 大 豆 抽 出 液 添 加

MRS培地100mlにLb i.reusを1.6Ⅹ107 cumf/lと なるように接種 し､28℃ で 6日間静置培養 した｡

1.6Ⅹ1⁰¹0 f/cumlに調整 した菌懸濁液10mlに凍結 保護剤 として トレハ ロース と牛血清アルブ ミンを それ ぞれ 0.2gと00.1g加 え､凍結 乾燥 ( aiAsh TechnoGlass,東京) した｡ コ ン トロー ル と し て､凍結保護剤無添加で凍結乾燥 した菌体 も調製

した｡

凍結乾燥菌体 を用いた市販味噌 における L‑グル タミン酸か らGABAへの変換

5% (W/V)LGluNaを含 む 大 豆 抽 出 液 添 加 MRS培 地1mlに凍結 乾燥 菌体 を05g. 懸 濁 し､

これを市販味噌8gに添加 して 28℃で 7日間保 っ た｡経時的に採取 した味噌0,3gを滅菌蒸留水10 mlに懸濁 し､上清の 100倍希釈液 を TLCとア ミ

ノ酸分析 した｡

結果および考察

供試味噌 か ら耐塩性乳酸菌の単離 とL‑グル タミ ン酸 か らGABAへの変換能力 が高い耐塩性乳酸 菌の探索

供試味噌 11点か ら50株 の耐塩性乳酸菌 を分離 した｡分離株50株 とT hlpiu.aohlsNo3.､醤油醸 造用乳酸菌群 は､PH培地や 12% (W/V)NaCl添 加MRS培地､12% (W/V)NaClを含 む大豆抽 出 液添加 MRS培地 に生育 したが､非耐塩性乳酸菌 i.brevisNBRC 120005は､これ らの培地 に生育 で きなかった｡醤油醸造用乳酸菌群か ら特徴の異 なる複数種の コロニーが出現 したが､本実験では 単離せずに群集 として取 り扱 った｡

分 離株50株 とT hlzhls. ao'iuN .o3､醤 油 醸 造 用乳酸菌群 は､1% ( VW/ )Gl‑auN 添加 pH培地､

12% ( VW/ )NaClと 1% ( vW/)Gl‑uNaを添加 し た MRS培地 と大豆抽 出液添加 MRS培 地いず れ に も よ く生 育 し､培 養7日 目でOD660が0.‑8 1.､培養 液の p0 Hは 45‑ 50まで低 下 した｡ し. . か し､いずれの培養液か らもGABAのスポ ッ ト を検 出す るこ とがで きなか った｡ また､培養液 中の し グルタミン酸濃度 も減少 していなかった｡

これ らの結果か ら､Thao)iulzhlsや味噌か ら分 離 した耐塩性乳酸菌､醤油醸造用乳酸菌群は､し グル タミン酸 を GABAへ変換す る酵素 を生産 し ていないか､極めて弱い活性 しか有 していない と

42 岸本 憲明 ･上武 誠 ･藤 田 藤樹夫

考 え られる｡

Gudioら L)O は大腸 菌が生産す る L グル タ ミン‑ 酸脱 炭酸酵素 の局在 部位 を調べ､酵素 は細 胞 質 内に局在す ることと､本酵素は細胞 質 を中性域 に 維持す る機能 を有す ると述べている｡ また､石川 と小幡 11)は精製 した L‑グル タミン酸脱炭酸酵素 活 性 が､ 高 濃 度 の NaCl,NaNO3,KCl a,C C1, 2

CuS04で 阻害 され た と報 告 して い る｡ た とえ ば､5% NaCl存在下で 90分間酵素反応 させ ると､

CO2発生量が NaCl無添加の 80%に低下 した と記 載 している｡ これ らの情報か ら､L‑グルタ ミン酸 脱炭酸酵素は菌体 内酵素で､菌体外 に単離す ると 5% (W/V)以上の NaClで活性が阻害 され る と考 えられる｡

一 方､ 非 耐 塩 性 乳 酸 菌 の 一 部 が L‑グル タ ミ ン酸 を GABAに変 換 で きる こ とは､ す で に明 らか に され て い る｡ 早 川 ら8)は ヨー グ ル トか ら 分 離 し た Stre♪tococcusthermophilusY‑1と Latbccoaillusdlrekebucl' ‑iY2を混合培養す る と､

し グル タ ミン酸か らGABAが生産 された と述べ てい るO また､OhandPark9)はキムチか ら分離 した L breuisOPK‑3を用 い て GABAを高 生 産 (8,9422mgL h/ / )す る条件 を確立す る とともに､

ibruSOP ‑el K3の gua t eabx lsltm aedcroyae遺伝 子 をクローニ ング している｡ さらに複本 ら 12)は､

L‑ uNaGl を添加 した米糠 に L bei FO 1. rvsI 20005 を 20℃以下の低温で 7日間培養す る と､100mg/

g以上 の GABAが生 産 され る こ とを明 らか に し ている｡

そこで､非耐塩性乳酸菌 L.brevisIFO 120005 を用 いて gltmaedcroyaeua t eabx ls活性 の高い休 止菌体 が､高濃度食塩存在下で もL‑グル タ ミン 酸 を GABAに変換で きるか検討 した｡

L. rbsNB C 100be i R 2 0 5の耐塩性 と N Cal添加培 地 における L‑グル タミン酸から GABAへの変換

L. rvsNBRCbei 100205を

0 ‑

50/ W/ ).0o( V NaClを含 む大 豆抽 出液添加 MRS培 地 で培 養 す る と､培養液 の pHは低下 し､培養 2‑ 4日目で pH4.‑5 50.に達 した｡ そ してその後､pHは上 昇 した｡一 方､NaClを 55.% ( VW/)以上 添加 し た培 地 で は､pHは 50.付 近 に低 下 した ま まで上 昇 しなか った (Flg.1)｡培養初期 に培養液の pH が低下 したのは､乳酸発酵 によって乳酸が生成 し たためで､培養後期 に培養液の pHが上昇 したの

は､し グル タ ミン酸 が gltmaedcua t e baroxylsae で脱炭酸 されて GABAに変換 され､酸 と して働

くカル ボキシル基 が 1個 減 ったため と考 え られ る｡

0 2 4 6 8 10 12

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50.% N Cal△ ;, 55.%NaCl□ , :./N CI600o a

NaClを 60 W/ ).%( V 添加す ると､NBRC120005 はほ とん ど増殖 しなかったことか ら､ この株 の耐 塩性 は 4.% ( V0 W/)と考 えた (i. ) % (Fg 201 W/

V)LGluNaを含 む大豆抽 出液添加 MRS培 地 に 4% (W/V)以下 の NaClを添加 して培養す る と､

培養 液 中の L‑グル タ ミン酸 は減少 したが､55.%

(W/)V 以上添加す ると減少 しなかった ( g 3Fi. )0 そ して､2.% ( V0 W/)NaCl添 加培 地 で は 8日 目 で L‑グル タ ミンの ピー クが検 出で きな くな り､

220Lml lml(O/ 6日培養)の GABAが､ また 40./0o (W/)Na lV C添加培養 液か らは 20LmO/0 l lml(10 日培養)の GABAが検 出 された｡それぞれ L‑ uGl Naに対 す る GABAのモ ル変換 率 は 75%と68% であった (Fg3i.)0

NBRC120005の生育は､6% (W/V)NaCl存在 下で阻害 された｡市販味噌 には 11‑ 14% (W/V) NaClが含 まれ てい るので､NBRC120005が市販 味 噌で増殖 す る こ とは難 しい｡ しか し,細 胞膜 が NaClの透過 を防 ぐ障壁 と して機 能 し､高濃度 食塩存在下で も細胞 内の食塩 を低濃度 に維持で き れば､菌体 内酵素 L‑グル タ ミン酸脱炭酸酵素 の

乳酸菌 を用 いた味噌 にお け る y‑ア ミノ酪酸の生成 43

活性低 下 は防 ぐこ とがで きる と予測 した｡ そ こ (W/ )V LGl‑ uNaと 1% 2 ( VW/ )NaClを含 む大豆 で､NBRC120005休止菌体 を用 いて 12o 0/ (W/V) 抽 出液添加 MRS培地に加 え 28℃ で静置 した｡培 NaClを含 む大豆抽 出液添加 MRS培 地で し グル 養 液 を経 時的 にサ ンプ リング して TLC分析 した タ ミン酸か らGABAへの変換 を検討 した｡ ところ､12時 間か らL‑グル タ ミン酸 スポ ッ トが

薄 くな り､GABAスポ ッ トが出現 して きた (Fig.

4)0

7

2時 間 イ ンキ ュベ ー ト後 の GABA濃 度 は mlで L‑グル タ ミン酸 に対 す るモル変 l/

21 l0 LmO

換率は 71%であった｡

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NBRC 120005.Glu.L‑glutalTlicac .GABA, id

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GABA.mob

γ‑amin rCaCd Mi:l l, x Lg tluamicaci ndad Fig.2.Turb iidt ure ilepha ;2 rse ‑p panol:do ist^.H²0 :

･45: V5( id

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NBRC120005 i

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NaCJ cinubatedwihtL b

20 aCl. L‑ uNaGl 添加培地で前培養 した NBRC 1 005

●:2 % N.0 aCl▲, : % N3

△ :5 %N 0 . 5 . l,

aCl,■.4 aCl.

□;

6

0;50.%NaC aCl 休 止 菌体 は､12% (W/V)NaCl存 在 下 で も L‑グ ルタ ミン酸 を GABAに高変換することがで きた｡

この結果 は､ 12% (W/V)前後 の食塩 を含 む市販 味噌 に NBRC120005の休止菌体 と LGl‑ uNaを添 加す る と､味噌 に GABAが生成､蓄積 され るこ

とを示唆 している｡

pp

(1 ]6 ∈ ) e uⅧ ∈ el n 19 ･ 1

re

L b bsNBRi C 10 02 0 5凍 結 乾 燥 菌 体 と LGl‑ u Naを添加 した市販味噌 における GABAの生成

1% (W/V)LG】uNa添 加 培 地 で 前 培 養 した

000 .

NBRC12 5株 の凍結乾燥菌体 05gを 5% (W/

V)LGluNaを含 む大 豆 抽 出液 添加 MRS培 地 1

0 2 4 6 8 10

mlに懸濁 した｡ この懸 濁液 を市販味噌 8gに添

y s ( d

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a onofMRS 17‑ 22LLmOlの GABAが検 出 された (し グルタ 加 し28℃ で 7日間保 った ところ､味 噌 1gか ら Fig.3.L‑Glutamicacldconcen

ミン酸 に対す るモル変換率 は 46‑ 6%) ( g.,0 Fi 5 lt

cu ureso ilu onct ontainingsoyex atrcsand2t .0

to6.% NaCli0 ncuba dwite thi b uire sNBRC 6)｡ また､凍結保 護剤 無添加 よ りも添加 した方

0 . 12

●:2

005. が､保護剤の種類 も牛血清 アルブ ミンよ り トレハ

ロースに懸濁 した凍結乾燥菌体が､高い変換率 を

%NaCl▲ , :3.% NaCl∫ , % N0 . 4.0 aCl, 5

.

5 % NaC

l□ .

:60

○;50% NaCl,△ : % NaCl 示 した｡

1% (W/ )V LGl‑ uNaを 含 む 大 豆 抽 出 液 添 加 味噌には麹 カビの分泌す るタンパ ク質分解酵素 20

MRS培 地 で 前 培 養 した NBRC1 005を､1% によって､大豆 タンパ ク質が分解 され､遊離 ア ミ 0

l

岸本 憲明 ･上武 誠 ･藤 EE]藤樹夫

O

し軟 らか くなった ものの､市販味噌の性状 と大 き な違いは認め られなかった｡

Lh

GABAは､ ヒ トな ど噛乳 動物 の小脳 に存在 し

Oll J)O322⊥

て､抑制性神経伝 達物 質 と して機 能す るこ とか ら､GABAを含 む食 品 が 多 く開 発 されて い る｡

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た とえば､Lグル タ ミン酸か ら GABA‑ 能 の高 い非耐塩性乳 酸菌 を用 いて､GABA濃度

‑ の変換

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の高 いキムチや発酵乳飲料 な どが市販 され てい る｡

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V 一方､市販味噌 には､食塩が 11‑ 14% (W/ ) 含 まれていて､ E]本人が一 日に飲 むみそ汁か ら摂

9 . 取す る食塩量 は 1 ‑

高血圧 を予防する観点か ら減塩が勧 め られている が､GABAには血圧 を下 げ る効 果 もあ る こ とか ら､高濃度の塩分 を含む味噌や醤油 な どの発酵食 品 に GABAが含 まれてい る と､高血圧 の予 防 に 効果があると期待 される^｡

謝 辞

4) 2. 6gと報告 されている 1 ｡

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酸分析計で試料 中の し グルタミン酸 とGABAを 定量 していただ きま した近畿大学農学部水産学科 ノ酸 と くに L‑グル タ ミン酸が 多 く含 まれてい る 安藤正 史博士 に深謝いた します｡

と期待 した｡そこで､味噌手由出液 をア ミノ酸分析

したが､L‑グルタ ミン酸の高い ピークを検 出す る 参考文献 こ とがで きなか った｡綾部 ら 131は､味噌麹 よ り

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l) ta d E,El d. Re も醤油麹で醸造 した味噌の方が ､グルタ ミン酸量

が多かった と報告 している｡使用する麹 カ ビの種 Neurobiol,2,279‑332( 7190).

類 によって生産 されるタンパ ク分解酵素の特性が 2) H. ,C St tanonIArch I.nt.Pharmaco yn.d ,

異な り､ これが製品中の グルタミン酸 を決める大 14 1204( 619

きな要 因の一つ と考 えられるc Lたが って､味噌 3) 大 森 正 司､ 矢 野 と し子､ 岡本 順 子､ 津 志 に GABAを生 成､蓄積 させ るため には､GABA 田藤 二 郎､村 井 敏 信､樋 口満 :農 化､61,

3,195 3).

の変換 能力 の高い乳酸菌 とともに L 一緒 に添加す る必要がある｡

‑GluNaも 87).

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凍結乾燥菌体の菌懸濁液ではな く､粉末 を市販 10 / 味噌 に添加 した ところ､GABAの生成量 は 1 以下 に低 下 した｡ これは味噌の水 分量が少 な く､

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‑ LGl

で きなか った こ とが原 因 と考 えてい る｡ そ こで､

LINaと凍結 乾燥 菌体 が味噌 中で均一 に混合 6)

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(A､2006

A.Yu.M.M .Pl .T.GL .

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‑5669(2006). 味噌 8gに加 える液量 を検討 した ところ､1mlで

GABA‑ の変換､蓄積 が安 定 して認 め られ､そ 7)

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れ以上添加 して も変換 率 は大 き く増加 しなか っ A. mpYa a･ Ap Bi ,88,2

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d Bi mi 65(2000). た｡一方､菌懸濁液 を 1ml加 えた味噌 は､す こ

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4(4),2 239‑44 小 田耕 平 :生 物 工 学 会 誌､7

199 (

乳酸菌 を用いた味噌 における γ‑ア ミノ酪酸の生成

8) 早 川潔､上野 義 栄､河村 真 也､谷 口良三､

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gy,98(2),3

波寛 子､海老根 秀子 :味 噌 の科学 と技術､

9(200

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,689‑692(9155).

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