岡 山 医 誌 (1993) 105, 291∼302
高 気 圧 酸 素曝 露 の ラ ッ ト脳 内 の脂 質 過 酸 化,
活性 酸 素 消 去 能,グ
ア ニ ジ ノ化 合 物 お よび
ア ミノ酸 代 謝 にお よぼ す 影 響
岡 山大学 医学 部 附属分 子細 胞 医学研 究施 設神 経情 報学 部 門(指 導:森
昭胤 教授)
伊
藤
武
彦
(平成4年12月25日 受 稿)
Key words: hyperbaric oxygen, lipid peroxidation, antioxidants, guanidino compounds, amino acids
緒 言 高 気 圧 酸 素 曝 露 は 生 体 内 の 活 性 酸 素 種 の 生 成 を促 し,生 体 に 対 して 酸 化 的 ス トレ ス と して 働 く こ と が 知 ら れ て い る.例 え ば,5.0絶 対 気 圧 (ATA)の 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 脳 内 の脂 質 過 酸 化 物 が 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る1).ま た,吸 入 酸 素 濃 度 依 存 性 に 過 酸 化 水 素 が 脳 内 に 蓄 積 し う る こ と も報 告 さ れ て い る.さ ら に,4.0 ATAの 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 脳 内 の ア ミノ 酸,カ テ コー ル ア ミン に 変 化 を生 じ る こ とが 示 さ れ て い る2).し か し,こ れ ら の 研 究 は そ の 多 く が 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 誘 発 さ れ る痙 攣 の メ カ ニ ズ ム との 関 連 に お い て な され て い る3). 一 方 ,臨 床 にお け る高気 圧酸 素療 法 は,高 気 圧 酸 素 に よ っ て 生 じ る 生 体 組 織 内 の 高 酸 素 分 圧 の 生 化 学 的 効 果,ま た は 高 気 圧 の 物 理 的 効 果 を 根 拠 と し て 現 在,突 発 性 難 聴,網 膜 中 心 動 脈 閉 塞 症,低 酸 素 症 に よ る 意 識 障 害,閉 塞 性 動 脈 硬 化 症 あ る い は 減 圧 症 な どの 治 療 に さ か ん に 用 い ら れ て い る4).し か し,そ の 効 果 の 機 序 に つ い て は 未 解 決 の 点 も多 い. そ こ で,臨 床 的 状 況 に 近 い 条 件 下 で の 高 気 圧 酸 素 曝 露 の 生 化 学 的 効 果 に つ い て 明 らか に す る た め に 本 実 験 を行 な っ た.は じめ に 高 気 圧 酸 素 曝 露 を小 動 物(ラ ッ ト,マ ウ ス な ど)に 対 し て 能 率 的 に 行 な え る よ うに 既 存 の 装 置 に 若 干 の 改 良 を加 え て 新 た な 実 験 系 を作 製 した.次 に,こ の 実 験 系 を 用 い て,高 気 圧 酸 素 曝 露 が ラ ッ トの 脳 に 与 え る 酸 化 的 ス トレ ス に つ い て の 評 価 を試 み た.こ こ で は,従 来 組 織 過 酸 化 に 関 す る実 験 にお い て 多 く用 い られ て き たthiobarbituric acid reactive substances (TBARS)値 の 測 定 に 加 え て 電 子 ス ピ ン共 鳴 法 を 用 い た活 性 酸 素 種 の 検 出 も行 な っ た.そ の の ち に,酸 化 的 ス トレ ス に 対 す る生 体 の 防 御 反 応 に つ い て 検 討 した.こ こ で は,と くに 活 性 酸 素 種 の ひ とつ で あ るsuperoxide anionの 消 去 能 を 測 定 す る と と もに,脳 内 に 多 く存 在 す るascorbic acid含 量 も測 定 し た.こ のascorbic acidは,活 性 酸 素 種 の 消 去 物 質 と し て よ く知 ら れ て い る.さ らに,痙 攣 と の 関 係 で 注 目 さ れ る脳 内 グ ア ニ ジ ノ化 合 物 代 謝 な ら び に ア ミ ノ酸 代 謝 に つ い て も検 討 し た.こ とに, グ ア ニ ジ ノ化 合 物 に 関 して は 代 謝 の 基 本 的 部 分 を構 成 す る 二 つ の 酵 素, arginase (EC 3.5.3. 1)と arginine: glycine-amidinotransferase (GAT, EC 2.1.4.1)に 着 目 して 検 討 し た. 以 上 の 実 験 を行 な っ た 結 果,高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ る ラ ッ ト脳 内 の 生 化 学 的 変 化 に つ い て の知 見 を得 た の で 報 告 す る. 材 料 と 方 法 1. 動 物 動 物 は7週 齢 の 雄 性Sprague-Dawley ratを 用 い た.す べ て の 動 物 は6週 齢 の もの を購 入 し, 実 験 に 先 立 ち 空 調 さ れ た 部 屋 で12時 間 明 暗 法 で 291
飼 育 し て,環 境 に 馴 化 さ せ た もの を 用 い た.餌 (MF,オ リエ ン タ ル 酵 母 社)と 水 は 不 断 給 餌 法 に て 与 え た.高 気 圧 酸 素 曝 露 中 は 絶 食 と し,ま た,対 照 群 の 動 物 に つ い て は,食 餌 性 の 差 が 生 じ るの を避 け る た め に,2時 間 の 絶 食 と した の ち に 脳 の 摘 出 な ど を行 な っ た. 2. 高 気 圧 酸 素 曝 露 高 気 圧 酸 素 の 曝 露 に は 中 型 動 物 用 高 気 圧 酸 素 チ ャ ン バ ー(PHC-特 型,タ バ イ 製 作 所)に,小 動 物 に 対 す る 高 気 圧 酸 素 曝 露 に 適 す る よ う若 干 の 改 良 を 加 え て 用 い た(Fig. 1). 主 な 改 良 点 は 主 チ ャ ン バ ー 内 に ラ ッ ト用 の ケ ー ジ を副 チ ャ ンバ ー と して 収 容 し,こ の 内部 を 純 酸 素 で 満 た した うえ,副 チ ャ ン バ ー 内 外 に 圧 勾 配 をつ く り副 チ ャ ンバ ー 内 を系 内 で最 も高 圧 に す る こ と に よ っ て 酸 素 濃 度 の 調 節 性 を 良 く し た こ と で あ る.ま た,主 チ ャ ンバ ー の 貫 通 口 に サ ン プ リン グ チ ュ ー ブ を 通 し副 チ ャ ン バ ー 内 の 気 体 の 酸 素 濃 度,二 酸 化 炭 素 濃 度 を 直 接 モ ニ タ リン グ で き る よ う に し た.こ の 実 験 系 を用 い て 次 の よ う に し て 高 気 圧 酸 素 曝 露 を 行 な っ た. 1)は じめ に 動 物 と適 量 の 二 酸 化 炭 素 吸 収 剤(ソ ー ダ ラ イ ム)を 副 チ ャ ンバ ー に 入 れ ,10分 間 馴 化 させ,主 チ ャ ンバ ー の ドア を 閉 め,排 気 弁 を 開 放 状 態(図 中A弁)に し て 系 を 半 閉 鎖 の 状 態 に し た. 2) 酸 素 送 気 弁(図 中B弁)を 開 放 し,医 療 用 純 酸 素 を 毎 分 約20リ ッ トル の 速 度 で3分 間, 副 チ ャ ン バ ー 内 に 送 気 し た. 3) こ の 状 態 で 排 気 弁 を閉 鎖 した うえ,圧 縮 空 気 送 気 弁(図 中C弁)を 徐 々 に 開 放 し,圧 力 計 を見 なが ら5分 間 で3.0ATAま で加 圧 した. 4) 圧 縮 空 気 送 気 弁 を 閉 鎖 し,ま た,酸 素 流 量 が 毎 分4∼6リ ッ トル(3.0ATA)に な る よ う に 酸 素 送 気 弁 を 調 整 し た.以 後110分 間 排 気 弁 を 調 節 し て こ の 状 態 を維 持 し た.副 チ ャ ン バ ー 内 の 酸 素 濃 度 は95%以 上 ,二 酸 化炭 素 濃 度 は0.5%以 下,温 度 は25±1℃ で あ っ た. 5) 排 気 弁 を徐 々 に 開 放 し5分 間 で 常 圧 まで 復 圧 し動 物 を取 りだ し,脳 の 摘 出 に 供 し た. 対 照 群 に つ い て は 副 チ ャ ン バ ー 内 に動 物 を入 れ, 上 記 の 操 作 をせ ず に 主 チ ャ ン バ ー 内 に お き,系 を 開 放 した ま ま2時 間 お い て か ら脳 を摘 出 した. 3. 試 料 の 作 成 測 定 の 内容 に よ っ て 次 の 二 通 りの 方 法 に よ っ て 試 料 を得 た:
1) TBARS値, free radical含 量, superoxide dismutase (SOD)様 活 性, arginase活 性,
高気 圧酸 素曝 露 が ラ ッ ト脳 にお よぼ す影響
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GAT活 性, ascorbic acid含 量 お よ びmet-hemoglobin含 量 の 測 定 用 試 料 の 作 成: ま ず 動 物 を エ ー テ ル 麻 酔 下 に 開 腹 し,腹 部 大 動 脈 を 確 保 した う え で 約2ml採 血 した.そ の 後 に 素 早 く開 胸 し,右 心 耳 に 切 開 を 加 え た.同 時 に 冷 生 理 食 塩 水 を 用 い て 全 身 を灌 流 し,迅 速 に 脳 を摘 出 し, GlowinskiとIversenの 方 法5)に よ っ て 大 脳 皮 質 を分 離 して,こ れ を 測 定 用 の 試 料 と し た.ま た,赤 血 球 に つ い て は 生 理 食塩 水 で3回 洗 浄 し洗 浄 赤 血 球 浮 遊 液 と し た も の を用 い た. 2) ア ミ ノ酸 分 析 用 の 試 料 の 作 成: 動 物 を 断 頭 に よ っ て 屠 殺 し,た だ ち に 頭 部 を 液 体 窒 素 中 に7秒 間 浸 した の ち,素 早 く脳 を摘 出 し1)と 同 様 の 方 法 で 大 脳 皮 質 を得 て,こ れ を ア ミノ 酸 分 析 用 の 試 料 と した. 4. TBARS値 の 測 定 TBARS値 は 大 川 らの 方 法6)に 若 干 の 変 更 を 加 え て 測 定 した.測 定 に は,ま ず,上 記3.-1) の 方 法 で 得 られ た大 脳 皮 質 をpH 7.8に 調 整 した 0.1M燐 酸 緩 衝 液 に て磨 砕 し た.そ の 磨 砕 液100 μlに8.1% sodium dodecylsulfate溶 液200μl, pH 3.5に 調 整 した20%酢 酸 緩 衝 液1.5ml, 0.8% sodium thiobarbiturate溶 液1.5ml, 0.1M燐 酸 緩 衝 液0.7mlを 順 次 加 え,よ く攪 拌 し た の ち に 沸 騰 水 中 に1時 間 お い た.そ し て,氷 水 中 に て 冷 却 し,蒸 留 水 を1.0ml加 え た の ち, 1-butanolを 5ml加 え て,2分 間 よ く振 盪 した.1.650×gに て10分 間 遠 沈 し, 1-butanol層 を分 取 して 測 定 に 供 した.測 定 に は 蛍 光 分 光 光 度 計(日 立650-10S)を 用 い,励 起 波 長515nm,蛍 光 波 長555nm にて測 定 した.標 準 物 質 として1,1,3,3-tetrameth oxypropaneを 用 い た. 5. SOD様 活 性 の 測 定 SOD様 活 性 の 測 定 に 先 立 っ て,試 料 をDahn らの 方 法7)に よ っ てsubcellular fractionに 分 画 した.す な わ ち, pH 7.8に 調 整 した0.1M燐 酸 緩 衝 液 に て 上 記3.-1)で 得 られ た 大 脳 皮 質 を 磨 砕 し,1,650×gで15分 間 遠 沈 した.そ の 上 清 を11,000×gで30分 間 遠 沈 し得 ら れ た 沈 殿 物 を 同 じ燐 酸 緩 衝 液 で再 懸 濁 して ミ ト コ ン ド リア分 画 と した.ま た,11,000×gの 遠 沈 で 得 ら れ た 上 清 を さ らに105,000×gに て超 遠 沈 して その 上 清 を 細 胞 質 上 清 分 画 と し た.以 上 の 二 つ の 分 画 を 測 定 に 供 し た.測 定 に は 電 子 ス ピ ン 共 鳴 法 を 用 い た8).す な わ ち 試 験 管 に 試 料 を50μl, 2mM hypoxanthine溶 液 を50μl, 10.98mM dieth ylenetriaminepentaacetic acid溶 液 を35μl, 9.8M 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO)を15μlを そ れ ぞ れ 取 り,こ れ に0.326 U xanthine oxidase溶 液 を50μl加 え て よ く 攪 拌 しxanthine oxidaseを 添 加 後60秒 後 に 電 子 ス ピ ン 共 鳴 装 置(日 本 電 子, FE 1 XG)に よ っ て DMPO-O2-adductの 測 定 を 開 始 し た.測 定 に は 石 英 製 偏 平 セ ル を 用 い た.電 子 ス ピ ン 共 鳴 装 置 の 設 定 は 次 の と お り で あ っ た:
Magnetic field, 335±5mT; power, 8.0 mW; response, 0.1s; modulation, 0.08mT; sweep time, 2min.す べ て の 測 定 は 室 温 で 行
な っ た.SOD様 活 性 の 標 準 と し て ヒ トCu, Zn -SODを 用 い た . 6. free radical含 量 の 測 定 free radical含 量 は,電 子 ス ピ ン 共 鳴 法 に よ るspin trap法 に よ っ て 行 な っ た.す な わ ち, 上 記3.-1)で 得 ら れ た 大 脳 皮 質 をpH 7.8に 調 整 し た0.1M燐 酸 緩 衝 液 に て 磨 砕 し,た だ ち に 磨 砕 液200μlと9.8M DMPO溶 液20μlと を 試 験 管 内 で よ く 混 和 し た の ち,石 英 製 偏 平 セ ル を 用 い て 測 定 を 行 な っ た.内 部 標 準 物 質 に は 酸 化 マ ン ガ ン を 使 用 し た.ス ピ ン 数 の 計 算 は,既 知 ス ピ ン 数 の2, 2, 6, 6-tetramethyl-4-hydroxyl-piperidine-1-oxyl (TEMPOL)の 信 号 強 度 と の 比 に よ り行 な っ た.電 子 ス ピ ン 共 鳴 装 置 に よ る 測 定 条 件 は 次 の と お り で あ る.
Magnetic field, 335±5mT; power, 8.0 mW: response, 0.1s; modulation, 0.2mT; sweep time, 30s.す べ て の 測 定 は 室 温 で 行 な っ た. 7. guanidino化 合 物 の 測 定 guanidino化 合 物 の 測 定 で は 上 記5.で 得 ら れ た 細 胞 質 上 清 分 画1.5mlに30% trichloroacetic acid溶 液150μlを 加 え て 除 蛋 白 し, 1,650×gに て10分 間 遠 沈 し た 上 清 を 孔 径0.45μmの フ ィ ル タ ー(Millipore)に て 濾 過 し た も の を 測 定 用 の 試 料 と し た.測 定 に は 全 自 動 グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 分 析 シ ス テ ム(日 本 分 光 製)を 用 い た.蛍 光 発
色 試 薬 と し て は, 9.10-phenanthrenequinoneを 用 い た. 8. ア ミ ノ 酸 分 析 上 記3.-2)で 得 ら れ た 大 脳 皮 質 を1% 2, 4, 6-trinitrophenol溶 液 で 磨 砕 し て 除 蛋 白 し, 1.650×gで 遠 沈 し た.得 ら れ た 上 清 を 約2mlの Dowex 2-X8で 充 填 し た カ ラ ム に 通 し 過 剰 の 2, 4, 6-trinitrophenolを 除 去 し,無 色 に な っ た 濾 液 を 減 圧 乾 固 し た.こ の 残 渣 をpH 2.2に 調 整 し た 塩 酸 に 溶 解 し 自 動 ア ミ ノ 酸 分 析 器(IRIKA 5500)を 用 い て 分 析 し た. 9. arginase活 性 の 測 定 arginase活 性 の 測 定 はColomboとKonars kaの 方 法9)に よ っ て 行 な っ た.す な わ ち,上 記 3.-1)で 得 ら れ た 大 脳 皮 質 を1mMのmanga nese chlorideを 含 む5mM tris緩 衝 液(pH 7.5)に て 磨 砕 し,こ の 磨 砕 液50μlと10mMの manganese chloride溶 液50μlを 混 合 し て55℃ に て20分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.氷 水 に て 冷 却 し た の ち,こ れ にpH 9.5に 調 整 し た0.1M炭 酸 緩 衝 液300μlを 加 え,さ ら に0.1M arginine溶 液l00μlを 加 え37℃ で30分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン は1.5mlの 氷 酢 酸 を 加 え る こ と に よ っ て 停 止 し た.こ れ に, ninhydrin発 色 液0.5mlを 加 え 沸 騰 水 中 に60分 間 置 い た の ち 氷 水 に て 冷 却 し,分 光 光 度 計 に てornithine標 準 液 を 対 照 と し て 波 長515nmで 比 色 し た.試 料 中 に こ の 反 応 に よ ら ず に 存 在 す るornithineの 影 響 を 除 外 す る た め に 試 料 ブ ラ ン ク を 置 い た. ar ginase活 性 は1時 間 あ た り単 位 組 織 重 量 あ た り に 生 成 し たornithineの 量 で 表 わ し た. 10. GAT活 性 の 測 定
GAT活 性 の 測 定 は, Van Pilsumら の 方 法10) に 若 干 の 変 更 を 加 え て 行 な っ た.す な わ ち,上 記3.-1)で 得 ら れ た 大 脳 皮 質 をpH 7.4に 調 整 し た0.1M燐 酸 緩 衝 液 に て 磨 砕 し,磨 砕 液250 μlにarginine-glycine基 質 溶 液(A-G液)ま た はarginine基 質 溶 液(A液)250μlを 加 え37℃ で3時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.そ の の ち0.6M perchloric acid溶 液1.5mlを 加 え,反 応 を 停 止 し, 1,650×gで10分 間 遠 沈 し た.こ の 上 清 を1 ml取 っ て,こ れ に6% ninhydrin ethylene glycol methyl ester溶 液3mlを 加 え,25分 間 沸 騰 水 中 に 置 き,冷 却 後505nmで 吸 光 度 を 測 定 し た. A-G液 を 含 む 検 体 とA液 を 含 む 検 体 と の 吸 光 度 の 差 か らGAT活 性 を 算 出 し た. GAT活 性 は1時 間 あ た り 単 位 組 織 重 量 あ た り に 生 成 し た ornithineの 量 で 表 わ し た. 11. ascorbic acid含 量 の 測 定
ascorbic acid含 量 の 測 定 はZannoniら の 方 法11)に 若 干 の 変 更 を 加 え て 測 定 し た.す な わ ち, 上 記9.で 得 ら れ た 磨 砕 液350μlに, 10% tri chloroacetic acid溶 液350μlを 加 え て 除 蛋 白 し た の ち に1.650×gで10分 間 遠 沈 し た.こ の 上 清 を400μl取 り,こ れ にFe-α, α'-dipyridyl錯 体 を 含 む 発 色 試 薬 を600μl加 え て37℃ で20分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.こ れ を 氷 水 に て 冷 却 し た の ち 波 長515nmで 吸 光 度 を 測 定 し た. 12. methemoglobin含 量 の 測 定 上 記3.-1)で 得 られ た 洗 浄 赤 血 球 浮 遊 液(ヘ マ ト ク リ ッ ト約50%に 調 整)を 検 体 と し て, CO -Oxymeter (Instrumental Laboratory)を 用 い て 測 定 し た. methemoglobin含 量 は 総hemoglo binに 占 め るmethemoglobinのper centで 表 わ し た.
13. 蛋 白 質 の 定 量
蛋 白 質 は ウ シ albumin を 標 準 と し, bicin choninic acid (BCA)法12)を 用 い て 測 定 し た. 14. 動 物 ・薬 品 等
ラ ッ トは 日 本 チ ャ ー ル ス リバ ー 社 よ り購 入 し た.医 療 用 純 酸 素 お よ び 圧 縮 空 気 は 中 国 化 成, DMPOは 第 一 化 学 薬 品, xanthine oxidaseは Boehringer Mannheim,ヒ トCu, Zn-SODは
日本 化 薬, BCA蛋 白 定 量kitはPierceよ り そ れ ぞ れ 購 入 し た.そ の 他 の 試 薬 は 市 販 の 特 級 試 薬 ま た は 微 量 分 析 用 試 薬 を 用 い た.
15. 統 計 処 理
有 意 差 の 検 定 に はWelchの 検 定 の 後, Stu dent's unpaired t-testを 用 い て 検 定 し た.た だ
し, methemoglobin含 量 の 測 定 結 果 に つ い て は WilcoxonのU-testを 用 い た.い ず れ の 場 合 も 危 険 率5%未 満 を も っ て 有 意 と し た. 結 果 1. 組 織 の 過 酸 化 な ら び に 防 御 系 に 関 す る 指 標 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て,大 脳 皮 質 に お け る
高 気圧 酸素 曝 露が ラ ッ ト脳 に お よぼす影 響
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Table 1 TBARS, free radical contents, SOD-like activity, ascorbic acid content and methemoglobin content
Each value represents mean•}SEM of 7 or 8 rats. Significance: *) p<0.05 vs control, **) p<0.01 vs
control. abbrebiation: HBO, hyperbaric oxygen.
Table 2 Guanidino compounds in the cerebral cortex
Each value represents mean•}SEM of 7 or 8 rats. Significance: *) p<0.05 vs control, **) p<0.01 vs control, ***) p<0.005 vs control.
TBARS含 量 とcarbon-centered radical含 量 は 増 加 して い た が,同 時 に,SOD様 活 性 も ミ ト コ ン ド リア 分 画 と細 胞 質 上 清 分 画 との 両 方 で 増 加 して い た. ascorbic acid含 量 は 対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 が な か っ た.血 中 のmethemoglobin含 量 は,高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 有 意 に 減 少 し て い た (Table 1). 2. 大 脳 皮 質 内 の グ ア ニ ジ ノ化 合 物 含 量 大 脳 皮 質 内 の グ ア ニ ジ ノ化 合 物 はTable 2に 示 した もの が 分 離 ・定 量 され た.そ の う ち で, arginine, guanidinoacetic acid (GAA)は 高 気
圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 有 意 に 増 加 して い た. 3. arginase活 性 な ら び にGAT活 性 arginase活 性 は 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 有 意 に 減 少 し て い た が,GAT活 性 に は 有 意 な 差 が な か っ た(Table 3). 4. ア ミ ノ 酸 分 析 ア ミ ノ 酸 はTable 4に 示 し た も の が 分 離 ・定 量 さ れ た.高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ てarginine の 他 に, taurine, phosphoethanolamine,
threonine, serine, glutamine, histidineの 含 量 は 有 意 に 増 加 し て い た がphenylalanine, β-alanineの 含 量 は 有 意 に 減 少 し て い た.
Table 3 Arginase and GAT activity in the cere-bral cortex
Each value represents mean•}S.D. of 7 to 9 rats. Significance: *) p<0.01 vs control.
Table 4 Amino acids in the cerebral cortex
Each value represents mean•}S.D. of 8 or 9 rats.
Significance: *) p<0.05 vs control, **) p<0.01 vs control,
***) p<0.005 vs control. 考 察 1. 組 織 の 過 酸 化 な ら び に 防 御 系 に 関 す る指 標 に つ い て 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ てTBARS値 お よ び carbon-centered radical含 量 の 増 加 して い た こ とか ら,こ の 条 件 下 で大 脳 皮 質 の 組 織 過 酸 化 が 進 行 し て い る こ と が 判 明 し た. liposome mediated SODが 高 気 圧 痙 攣 を抑 制 す る こ とか ら高 気 圧 酸 素 曝 露 に よっ て脳 内 にsuperoxideが 発 生 す る こ とが 考 え られ て い るが13),こ のsuper oxideか ら,過 酸 化 水 素 が 発 生 す る こ とが 考 え ら れ, Yusaら に よ っ て 過 酸 化 水 素 の 蓄 積 が 証 明 され て い る14).今回 の 実 験 で検 出 され たhydroxyl radicalな ら び にhydrogen radicalは こ れ ら の
radicalが 本 来 短 寿 命 のradicalで あ る こ とか ら 意 味 づ け が 困 難 で あ るが,磨 砕 液 中 に 存 在 す る 過 酸 化 水 素 に よ るFenton型 反 応 に よ っ て 生 じ た もの で あ る可 能 性 が 高 い.す な わ ち,組 織 が 活 性 酸 素 種 を産 生 す る能 力 を 反 映 し て い る と 考 え られ る.そ して,本 実 験 ではhydroxyl radical 含 量 は 高 気 圧 酸 素 曝 露 群 で む し ろ減 少 し て い る こ とか ら,何 らか の 形 で 活性 酸 素 種 発 生 の抑 制 機 序 が働 い て い る可 能 性 が 示 唆 され た. hydrogen radicalに つ い て は い ま だ生 体 で の 産 生,代 謝 の 機 序 が 明 らか で な くさ ら に検 討 が 必 要 で あ る. 全 身 性 の 影 響 に つ い て は 今 回 動 脈 血 中 のmet hemoglobin含 量 を測 定 した が,酸 化 的 ス トレ ス 下 に も か か わ らずmethemoglobinの 含 量 は 増 加 して い な い こ とが 見 い だ さ れ た.体 内 で酸 素 分 圧 が 最 も 高 い血 液 中 で この よ う な 変 化 が 見 ら れ た こ と は,臨 床 的 効 果 を考 え る う え で 興 味 深 い. 一 方,防 御 系 につ い て は,SOD様 活 性 で示 さ れ るsuperoxide消 去 能 が,ミ トコ ン ド リア な らび に 細 胞 質 上 清 の 各 レベ ル で 上 昇 して い る こ とが 見 い だ さ れ た.一 般 に ミ ト コ ン ド リア分 画 中 のSOD様 活 性 は 大 半 がMn-SODに 由 来 し, 細 胞 質 上 清 分 画 中 の そ れ は 概 ねCu, Zn-SODに 由 来 す る もの と考 え られ る7).今 回用 い た 電 子 ス ピ ン共 鳴 法 に よ る測 定 はsuperoxide radicalの 消 去 を 直 接 に 観 察 し う る 点 に お い て,従 来 の cytochrome C還 元 法 やnitrobluetetrazolium (NBT)法 に 比 べ てsuperoxide radicalに 対 す る特 異 性 が 高 い こ とが 示 され て い る8).しか し, SOD以 外 の 分 子 で もsuperoxide消 去 能 を も っ て い れ ば,SOD活 性 と し て観 察 さ れ う る こ と か ら 測 定 さ れ たSOD様 活 性 の 一 部 がceluroplas min, metallothionein, ascorbic acid, uric acid
な どに 由 来 す る可 能 性 は 否 定 で き な い.こ れ ら の 物 質 の 中 で 最 も高 濃 度 で脳 内 に 存 在 す るの は ascorbic acidで あ り, superoxideと の 反 応 定 数 を勘 案 す る とascorbic acidの 存 在 は 無 視 し え な い と考 え られ た.し か し,今 回ascorbic acid も同 時 に 測 定 し有 意 差 が 検 出 され な か っ た こ と か ら,こ の 理 由 に よ っ てSOD様 活 性 に 差 を生 じ た可 能 性 は 低 い もの と結 論 し た. Harabinら は, 2.8ATA,4時 間 の 高 気 圧 酸 素 曝 露 でSOD活 性 の 有 意 な 増 加 を親 察 で き な か っ た と して い る15).その 理 由 と して脳 内 の 酸 素
高 気圧 酸素 曝露 が ラ ッ ト脳 に お よぼす影 響
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分 圧 が 酵 素 誘 導 に 十 分 で な か っ た か,あ る い は, 誘 導 さ れ るSODは も っ ぱ らMn-SODで あ る こ とか ら,総SODを 測 定 し た 彼 ら は相 対 的 に 低 活 性 で あ るMn-SOD活 性 の 変 化 を検 出 し え な か っ た の で は な い か と して い る.一 方,本 実 験 で は 脳 内 に お い て 脂 質 過 酸 化 は確 か に 進 行 し て お り,ま た,SOD様 活 性 に つ い て,ミ トコ ン ド リア 分 画,細 胞 質 上 清 分 画 の 両 方 で 独 立 して 測 定 を行 な っ て い る.そ の 結 果SOD様 活 性 の 増 加 が 双 方 で 観 察 さ れ た.し た が っ て 酵 素 の 誘 導 合 成 に 必 要 と考 え ら れ る 時 間 よ りは 高 気 圧 酸 素 曝 露 時 間 が 若 干 短 い もの の,彼 らが 検 出 しな か っ たSODの 誘 導 を今 回観 察 し た と考 え られ る.今 後,酵 素 化 学 的 検 索 ま た は 分 子 生 物 学 的 検 索 を行 な い,こ の 点 に つ い て確 認 す る 必 要 が あ る と考 え る. 先 に 述 べ た よ うに, ascorbic acid含 量 は 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 有 意 に 変 化 しな か っ た が, こ の こ とは 脂 質 過 酸 化 物 の 消 去 を考 え る う え で 重 要 で あ る.なぜ な ら,脂 質 過 酸 化 物 はtocopher olに よ って ふ た た びnon-radicalに な り,生 じ たtocopherol radicalはascorbic acidや glutathioneな どの 水 溶 性radical scavengerによっ て 消 去 され る こ とが知 られ てい るが, ascorbic acidが 減 少 す る よ う な ら ば こ の サ イ クル が 障 害 さ れ る こ と に な るか らで あ る16).本実 験 の よ うな 臨 床 用 量 に 近 い 高 気 圧 酸 素 曝 露 で は,豊 富 に 存 在 す るascorbic acidは 影 響 を受 け に くい と考 え て よ い で あ ろ う.防 御 系 全 体 と して は 過 剰 の 活 性 酸 素 種 の 消 去 の 方 向 に働 い て い る と考 えた. 2. 大 脳 皮 質 内 の グア ニ ジ ノ化 合 物 代 謝 に つ い て Fig.2 に グ ア ニ ジ ノ化 合 物 の 代 謝 経 路 を示 し た が, arginineは 種 々 の 代 謝 酵 素 の 活 性 の 大 小 か ら考 えて 大 半 はarginaseに よ っ て 等 モ ル の 尿 素 お よ びornithineに 代 謝 さ れ る もの と思 わ れ る.ま た,GAT活 性 はarginase活 性 に 較 べ る と著 し く小 さい がarginineの 一 部 は 脳 内 で等 モ ル のGAAお よ びornithineに 代 謝 さ れ て い る も の と考 え ら れ る.高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て arginineとGAA含 量 が 増 加 し た が, arginine の 増 加 に つ い て は 上 記 の理 由 でarginase活 性 の 低 下 が 大 き く関 与 し て い る も の と考 え られ た. arginaseの 活 性 が 低 下 した理 由 と して は, Edlba
cherら はin vitroの 酸 素 曝 露 に よ ってarginase の 標 品 の 活 性 が 減 少 す る こ と を報 告 して お り17), 筆 者 ら も常 圧 の 酸 素 曝 露 に よ っ て マ ウ ス の 神 経 細 胞 膜 上 の 蛋 白が 酸 素 に よ っ て 直 接 酸 化 され て い る可 能 性 を電 子 ス ピ ン共 鳴 法 に よ る検 索 か ら 明 らか に して い る こ とか ら18),今 回のin vivoの 例 で もarginaseを 構 成 す る蛋 白 上 のsulfhydril 基(SH 基)が 酸 素 に よ っ て 直接 に 酸 化 され た 可 能 性 が 大 き い.こ の よ う な酸 素 に よ る 酵 素 の 活 性 低 下 の 例 は い くつ か 見 い だ さ れ て い るが, こ と に そ の よ う な 変 化 が 可 逆 的 で あ るか ど うか は 臨 床 的 な 治 療 効 果 を考 え る う えで 重 要 で あ る. 一 方 ,GAAが 増 加 し た こ とに つ い て はGAT 活 性 の 有 意 な 変 化 が 見 られ な か っ た こ とか ら,
プ ー ル さ れ たarginineがGAAに 代 謝 され た こ とが 考 え られ る. ま た,酸 化 ス ト レ ス の 指 標 と さ れ19),痙 攣 誘 発 作 用 の 大 き いmethylguanidine20)は 今 回 増 加 し な か っ た が,常 圧 下 で12時 間 ま た は24時 間 高 濃 度 酸 素 を曝 露 し た場 合 は 有 意 に 増 加 す る こ とが 示 され て お り21, 22) methylguanidine産 生 は 酸 素 曝 露 条 件 に 依 存 す る こ と が考 え られ た. 最 近arginineか ら 等 モ ル のcitrullineとNO (い わ ゆ るendothelium-derived relaxing fac tor, EDRF)が 生 成 す るNO synthaseの 経 路 が 注 目 さ れ て い る が23),基 質arginineの 増 加 に 伴 っ てNOの 産 生 が 増 加 して い る 可 能 性 も想 像 で き る.こ の 点 に つ い て はarginine自 体 が,NO 産 生 を介 す るproconvulsantと 考 え る研 究 者 も い る こ とか ら24),高気 圧 痙 攣 との 関 わ りに つ い て さ ら に 研 究 が 必 要 で あ ろ う. 3. ア ミ ノ酸 代 謝 に つ い て ア ミ ノ酸 の 代 謝 に つ い て 考 察 す る と,含 量 の 増 減 に 着 目 して 大 き く3群 に 分 け て 考 え る こ と が で き る.ま ず 含 量 が 増 加 した ア ミノ酸 で あ る がglutamineの 増 加 が 最 も 注 目 さ れ る. glutamateはglutamate dehydrogenaseお よ びglutamine synthaseに よ っ て 代 謝 さ れ る が 高 濃 度 酸 素 に よ っ てglutamate dehydrogenase お よ びglutaminaseの 活 性 が 低 下 す る こ とが知 ら れ て い る25, 26).し た が っ て,こ の 機 序 に よ り glutamineの 産 生 が 増 加 し た こ とが 考 え られ る が,こ れ は, ammoniaの 処 理 の 観 点 か ら臨 床 的 に 好 ま しい 変 化 か も知 れ ない.実 際, Yakolevと Leonovは ネ コに お け る実 験 的 出 血 シ ョ ックモ デ ル に お い て 高 気 圧 酸 素 曝 露 後,上 記 と 同様 の 変 化 を観 察 し て お り,高 気 圧 酸 素 療 法 の 適 応 を考 え る う え で 重 要 な代 謝 変 化 で あ る27). ま た, taurineも 増 加 して い た ア ミノ 酸 の ひ と つ で あ る. taurineは コバ ル ト焦 点 て ん か ん モ デ ル に お い て 痙 攣 を 抑 制 し,高 気 圧 痙 攣 に お い て は, 100mg/kg i.p.のtaurineは 無 効 で あ っ た と 報 告 さ れ て い るが28),外 部 か ら投 与 され た も の で な く生 体 内 で 増 加 し たtaurineは そ の 膜 安 定 化 作 用 を 介 して 痙 攣 域 値 を増 加 させ う る か も知 れ な い. threonine, serine, histidineの 各 ア ミ ノ 酸 に つ い て は そ の 増 加 の 原 因 を考 察 す る こ と が 困 難 で あ る が,脳 内 で 合 成 さ れ 難 い ア ミ ノ酸 で あ る こ とか ら あ る い は 血 液 − 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 に よる ものか も しれ ない. histidineはhistamine の 前 駆 体 で あ り, histamine代 謝 に 影 響 を お よ ぼ す 可 能 性 が あ る. 含 量 が 減 少 し て い た ア ミノ 酸 は検 出 さ れ た ア ミ ノ酸 の 中 で はphenylalanineと β-alanineの み で あ る.そ の 減 少 の 理 由 は 明 ら か で は な い が, 前 者 は カ テ コー ル ア ミ ン代 謝 の 前 駆 体 で あ り, 一 方 後 者 は 痙 攣 性 の 先 天 性 疾 患(高 β-alanine 血 症)に お い て 脳 内 に 高 濃 度 で 存 在 す る こ とか ら痙 攣 との か か わ りで 興 味 深 い29).その 他 の ア ミ ノ酸 につ い て は,興 奮 性 ア ミノ酸 で あ るglutamic acid, asparatic acidお よ び 抑 制 性 ア ミ ノ酸 で
あ るglycine, GABAに 有 意 な変 化 が な くこ の 点 に お い て 痙 攣 準 備 状 態 に 関 与 し て い る 可 能 性 は 低 い と考 え られ る. 4. 臨 床 医 学 との 関 連 に つ い て 治 療 効 果 との 関 連 に つ い て は,物 部 ら が 今 回 の 実 験 に近 い条 件 下 に お い て ヒ トに 対 す る実 際 の 治 療 中 に 静 脈 血 血 清 内 の 過 酸 化 脂 質 が 有 意 に 減 少 し,か つ 好 中 球 の 活 性 酸 素 産 生 能 が 増 加 し て い る こ と を報 告 して い る30).ま た,油 布 ら は, ラ ッ トに お け る実 験 的 ク モ膜 下 出 血 モ デ ル に お い て低 下 し たNa, K-ATPase活 性 が 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よって 回復 し うる こ とを報 告 して い る31). こ れ らの 事 実 は 高 気 圧 酸 素 曝 露 は 酸 化 的 ス トレ ス を惹 起 し う る に もか か わ ら ず,防 御 系 を も賦 活 し う る こ と を 示 唆 し て い る. 今 回 の 実 験 か ら3ATA,2時 間 の 高 気 圧 酸 素 曝 露 は ラ ッ トの 脳 内 に 種 々 の 変 化 を与 え,一 方 で 組 織 過 酸 化 が 進 む が,他 方 で そ の 変 化 に対 応 して 防 御 系 が 活 性 化 さ れ る こ とが 示 唆 され た. 類 似 の 変 化 を惹 起 す る もの と して 放 射 線 照 射 が あ る.放 射 線 照 射 と酸 素 曝 露 とは そ れ ち の効 果 が 生 じ る機 序 に 活 性 酸 素 種 が 関 与 す る 点 で,生 体 に 対 して 同 様 の 効 果 が 生 じ う る. Yamaokaら は ラ ッ トに 対 して 全 身 低 線 量X線 照 射 を行 な っ た 時 にSOD活 性 の 上 昇 が 見 られ る と し た が, こ の 点 は本 実 験 の 結 果 に 類 似 し てい る32).低線 量 の 放 射 線 に つ い て は い わ ゆ る ホ ル ミシ ス 効 果 に よ っ て 生 体 に 好 影 響 を 与 え る こ とが 言 わ れ て お り,あ る い は,高 気 圧 酸 素 曝 露 に 関 して も,従
高気 圧 酸素 曝露 が ラ ッ ト脳 にお よぼ す影響
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来知 られ て い る 臨 床 的 効 果 に 加 え て 新 しい 用 法 が 見 い だ され る か も知 れ な い.こ の た め に は 今 回 観 察 さ れ た 諸 指 標 の 変 化 を 参 考 に し て,さ ら に 酸 素 投 与 量 の 最 適 化 を は か る 必 要 が あ る と考 え る. 結 論 今 回,臨 床 的 状 況 に 近 い 条 件 下 で の 高 気 圧 酸 素 曝 露 の 生 化 学 的 効 果 に つ い て 明 らか に す る た め に 新 た に小 動 物 用 の 実 験 装 置 を作 成 し た.こ の装 置 を用 い て ラ ッ トに 対 して3.0ATA,2時 間 の 高 気 圧 酸 素 曝 露 を 行 な い脳 内 の 脂 質 過 酸 化 の 指 標,活 性 酸 素 種,活 性 酸 素 種 に 対 す る 防 御 系, グ ア ニ ジ ノ化 合 物 代 謝,ア ミ ノ酸 含 量 に つ い て 観 察 した 結 果,次 の 知 見 を得 た. 1. 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ ってTBARS値 は 増 加 し た.ま た,電 子 ス ピ ン 共 鳴 法 に よ る検 索 に よ っ てcarbon-centered radicalが 増 加 して い た が, hydroxyl radical含 量 は 減 少 し て い た. 以 上 か ら,高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ て 脳 内 に 脂 質 過 酸 化 が 進 行 して い る こ とが 明 らか に な っ た. ま た,動 脈 血 中 のmethemoglobin含 量 は 低 下 して い た. 2. ミ トコ ン ドリ ア分 画 お よ び 細 胞 質 上 清 分 画 に お い てSOD様 活 性 を 測 定 し た が,高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ てSOD様 活 性 は 増 加 して い た. 3. グ ア ニ ジ ノ化 合 物 の 代 謝 に 関 し て は 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ てarginineお よ びGAA含 量 が 増 加 して い た.そ こ でarginase活 性 に つ い て 調 べ た と こ ろ こ の 酵 素 の 活 性 が 抑 制 さ れ て お りarginineの 増 加 に 寄 与 して い る こ とが 示 唆 さ れ た.ま た,GATの 活 性 は 有 意 に 変 化 し て い な か っ た が, arginineの 増 加 とあ い ま っ てGAA 含 量 が 増 加 し た もの と考 え ち れ た. 4. ア ミ ノ酸 代 謝 に 関 して は 高 気 圧 酸 素 曝 露 に よ っ てglutamine, taurineな ど の ア ミノ酸 が 増 加 し, phenylalanine, β-alanineが 減 少 して い た. 5. 以 上 の 結 果 か ち高 気 圧 酸 素 曝 露 は 脳 内 に お い て 酸 化 的 ス トレ ス と して 働 くが,そ れ に 対 す る 防 御 系 が 代 償 性 に 亢 進 す る こ とが 明 らか と な っ た.そ して,種 々 の 生 化 学 的 変 化 が 見 ら れ, 高 気 圧 酸 素 治 療 の 効 果 は 多 岐 に わ た り,さ ち に 詳 細 な 検 討 が 必 要 と考 え られ た. 稿 を終 え るに あた り終 始 御 指 導 と御 校 閲 を賜 りま した森 昭 胤教 授 に 深甚 の謝 意 を表 し ます.ま た, 御 指 導 と御助 言 をい た だ いた 岡山 大学 医 学 部 附属 病 院集 中治療 部 橋 本 秀則 講 師 な ちびに 同高 気圧 治 療 部 八 塚 秀彦 助 手,さ ちに本 実 験 に際 し多大 な る御 協 力 をい た だ い た油 布 克 巳 大 学 院 生 な らび に 枝 松 礼 学 士 に 深謝 いた し ます.文
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