第三章 : 医療用麻薬の新規バイオマーカーとしての血中 miRNA の探索
3.2 miRNA 抽出及び定量 PCR 解析
miRNA の評価は、ヒドロモルフォン及びオキシコドンの投与前及び投与 24 時間後に採
取した血漿サンプルを用いた。miRNAの定量PCR解析は、ヒト血漿や血清に存在する179
種類のmiRNA検出プライマーを搭載した定量PCRパネル（Serum/Plasma Focus microRNA
PCR Panel, 384 well V3.R、Exiqon）を用いて行った。
3.2.1 RNA 調製
Total RNAはmiRNeasyⓇ Mini Kit（Qiagen）を用いて調製した。
200 μLの血漿サンプルに、キャリアRNA（MS2 bacteriophage RNA, Roche、1 μg）及びRNA 抽出モニター用のコントロール合成RNAであるUniSp2, UniSp4, UniSp5 RNA template mix
（RNA Spike-in kit, UniRT、Exiqon）を添加し、QIAzol Lysis Reagentを加えて変性処理を行 った。これにクロロホルムを加え、遠心分離して水層を回収した。さらにエタノールを加え、
混合後、Qiagen RNeasyⓇ Mini Spin Columnに添加、遠心してRNAをカラムに吸着させた。
このカラムをQiagen Buffer RWTにより1回、Qiagen Buffer RPEにより3回洗浄した後、遠 心して余分な液を除いた。洗浄したカラムを新しいチューブにセットし、50 μLの水を添加、
遠心してtotal RNAを回収した。
3.2.2 定量 PCR 解析
miRNA の定量 PCR 解析は Exiqon 社のマニュアル（miRCURY LNATM Universal RT
microRNA PCR, Instruction manual 及び miRCURYTM microRNA QC PCR Panel Instruction
manual）に従い、ヒト血漿や血清に存在する179種類のmiRNA検出プライマーを搭載した
定量PCRパネル（Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel, 384 well V3.R、Exiqon）を用い て行った。
Universal cDNA Synthesis Kit II（Exiqon）を用いて、total RNAから定量PCRの鋳型となる 1本鎖cDNA合成を行った。Total RNA 7 μLからpolyA付加と逆転写反応を同時に行った。
反応終了後、95°Cで5分間加熱して逆転写酵素を失活させ、使用まで凍結保存した。
なお、cDNA 合成効率の確認用に、同キットに添付の Synthetic RNA spike-in template
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（UniSp6）、及びRNA Spike-in kit, UniRT（Exiqon）のcDNA合成モニター用のコントロール
合成RNA、cel-miR-39-3p RNA Spike-in templateを添加して上記反応を行った。
上記で調製された鋳型cDNAを用い、Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel V3（Exiqon）
による定量PCRを行った。
cDNA合成反応液を50倍希釈し、ExiLENT SYBRⓇ Green master mix（Exiqon）の2x ExiLENT SYBRⓇ Green master mixと等量混合し、Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panelに分注し た。定量PCRは、LightCyclerⓇ 480 Instrument IIを用いて行った。反応終了後、装置付属の ソフトウェアにてCq値の算出及び融解曲線分析を行った。各miRNAのCq値はPCR増幅 曲線の二次導 関数の最大 値となると なるサイ クル数とし て決定し た（2nd Derivative Maximum法）[14]。
3.2.3 データ解析
LightCyclerⓇ 480 Instrument IIから得られたデータを、Exiqon社のマニュアル（Data Analysis Guide For the miRCURY LNATM Universal RT microRNA Ready-to-Use PCR panels
using Exiqon GenEx software）に準拠した方法で解析した[15]。なお、40サイクルでも基準
値に達しなかった著しく発現量の低いmiRNAは検出限界以下とみなし、解析から除外し た。
179種の各miRNAのCq値は、グローバル標準化法にて標準化した（ΔCq）。すなわち、
「各miRNAのCq値」から「Cq値が得られたすべてのmiRNAのCq値の平均値」を減算
した値として算出した[16]。ΔCqpre及びΔCq24hはそれぞれ、薬物投与前及び投与24時間 後のΔCq値を表す。例えば、あるmiRNAの薬物投与24時間後と投与前でのそれぞれの ΔCq値の差（ΔCq24h − ΔCqpre）が −1の場合、そのmiRNAの血漿中レベルは24時間時 点で投与前時点より2倍高い事を意味する。
血漿中miRNA（179種）の発現変動レベル評価のため、各miRNAのΔCqpre及びΔCq24h
に関して、paired t-検定を行いBenjamini and Hochberg’s methodにより多重検定補正を行っ た。有意水準としてq < 0.05を用いた。オキシコドン試験のデータについては、DS-5058b
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徐放錠及びオキシコドン標準製剤の生物学的同等性が検証されていることから、これら2 つの製剤のデータはあわせて解析を行った。
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