MC-PUF

③: Cell suspension

Ce11 density : 1.0 X 10 7 cells / ml Cell suspension vol. : 7.0 ml

Injection rate : 3 ----4 ml / min

、-­

�

g

Fig.5-3-3 細胞の播種方法

94

|

^遠心法

|

Centrifuga1 accelertion : 200 X g in 3 directions for 6 min

5.3.1.3モデル薬物の代謝反応

モデル薬物は4.2.2の場合と同機に， 生体内の消失速度がすでに研究されており， 本研究との比較が可 能なリドカインとアセトアミノフェンを使用した。 第4章の静置培養法を用いた実験では， モデル薬物 の濃度を反 応律速にならない濃度とするため， リドカインでは初期投与濃度を0.25mM， アセトアミノ フェンでは1.0mMとした。 しかし， 本章では木装置と生体肝臓の薬物消失速度を比較することで性能評 価を行うことから， 生体に投与される場合を考慮してモデル薬物の初期濃度を以下のように設定した。

リドカイン ，20μM

アセトアミノフェン; 500μM

また， 反応には培養3日目でスフエロイド形成が十分なされたMC-PUFモジュールを利用した。

(1 )リドカインの代謝反応

1. 4mMのリドカイン/エタノ ール溶液を調製し， Fig.5-3-2の薬物注入口 から0.5ml投与すること で初期 濃度を20μMに調製しt.:.o

2. リドカイン投与後， 10min， 20min， 30min， lhr， 2hr， 3hrの間隔で1.0mlの培養培地をサンプリング した。

3. 得られたサンフルを4.2.3.1に示した方法で分析することによって， 装置内のリドカイン濃度変化を 評価した。

(2)アセトアミノフェンの代謝反応

1. 100mMのアセトアミノ フェン/エタ ノール溶液を調製 し， Fig.5-3-2の薬物注入口から0.5ml投与-する ことで初期濃度を0.5mMに調製した。

2.アセトアミノ フェン投与後， 20min， 30min， lhr， 2hr， 3hr， 9hr， 12hrの間隔で1.0mlの培養培地を サンプリングした。

3.得られたサンプルを4.2.3.2に示した方法で分析することによって 装置内のアセトアミノフェン濃 度変化を評価した。

また， 静置培養系と荷主流培養系での構造変換活性を比較するために， リドカイン代謝反応では初期濃 度が0.25mMの場合， アセトアミノフェン代謝反応では初期濃度が1.0mMの場合についても検討した。

5.3.1.4各種評価法 (1)細胞数の測定法

MC-PUFに固定化された刻U!J包数の測定には核数計数法を用いた。 これはvan WezeI75)�こよって報告され た方法であり， 0.1%クリスタルバイオレッドを含むO.lMのクエン酸溶液に細胞が固定化 されたPUFを 入れ， 37'Cで12� 16時間インキュベートすると， 細胞膜が溶解し紫色に染まった核のみが放出されるた め， その核数を血球計算板で計数できる。

また， 初代ラット肝細胞は約45%の細胞が2核を有しているこ とから， 細胞数は核数計数によ って得 られた結果をl .45で除すことにより求めたO

95

(2)薬物消失速度の評価日)，66)

4.2.3.3で述べたょっに， 肝臓および培養容器内の薬物消失速度の評価には 次式で定義されるクリア ランス(CL)が用いられる。

CL= k

.

^Vd

(

k;薬納物の消失速度定鵡数加 Vdぶ;分布容積(加 mlり)

一方， 生体の肝臓での薬物の消失を考える(Fig. 5-3-4)。

肝臓 Q

Cin

( r ^..-..._... _，

Cl

，

^{E ーー­ Cout}

(

^Q;血時一一一度Cout ;肝臓出口の血中薬物濃度

)

Fig.5-3-4 肝臓内の薬物消失速度の考え方

薬物が肝臓を一回通過するとき肝臓による薬物の消失速度は次式により与えられる。

(

^{肝)臓による消失速度}

)

^{= Q . C in -Q . Cout}

ここで， 肝臓に入ってくる血液中の薬物濃度を対象にし， 肝臓内の薬物のクリアランスを次式で定義す る。

Q. _�n -Q

.

^Cout

CLliver= c

\1111lj

nU1 hr

上式の右辺のカッコ内はO�lの値をとり， 肝臓が薬物をトラップできる率(抽出率;E)として表すこと ができる。

CLlivcr

=

^{Q. E}

肝臓内の薬物クリアランスCLliverは， 肝臓に流入する血液流量Qと抽出率Eとの積に等く ， れtl LH率は薬 物が肝臓を一回通過する際に除去される割合を示す。

生体肝臓と肝臓シミュレータ装置では， 細胞数や流量， 反応条件が異なるためクリアランスを直接比 較することはできないが， 反応が基質律速で進行する場合に限れば， 細胞当りの薬物抽出率は比較でき ると考えられる。 木研究および生体肝臓の実験67)， 76)において， モデル薬物は基質律速で反応、が進行す る濃度であることから， 肝臓シミュレータ装置内の細胞当りの薬物抽出率を生体肝臓の値と比較するこ とで性能評価を行った。

96

冨 圃

Photo.5-3-2 MC-PUFモジュール内でのラット肝細胞のスフェロイド形成 500μm 5.3.2実験結果

5.3.2. 1 細胞形態

Photo.5-3-2に培養3 日目の細 胞形態を示す。ここで， MC-PUF干し内 に固定化されていた細胞は約0.9X 107 cel1s/cm3 -PUFで、あり， 全体で約4 .0X ] 07 cel1s/moduleで、あった。肝細胞はMC-PUFの細管と細管の問で スフェロイドを形成したO

5.3.2.2静置培養と瀧流培養 による薬物構造変換活性の比較

Table 5-3-]に培養後3日自の静置培養と濯流培養のスフエロイド培養肝細胞 によるリドカインおよびア セトアミノフェン情造変換活性の違いを示す。これらのモデル薬物の構造変換速度は， 1産流培養を行う ことで静置培養の約2倍ほど活性が向上した。アセトアミノフ ェンの代謝反応では 構造変換産物とし て発現するアセトアミノフェンのグルクロン酸や硫酸抱合休の発現速度からも同様の評価ができる。こ れにより， 濯流培養を行うことで， スフエロイド培 養肝細胞の薬物構造変換速度が向上することが見出

された。

Table 5-3- 1 静置培養と瀧流培養におけるスフエロイド培養肝細胞の薬物構造変換活性の比較

Stationary culture Perfusion culture

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e 9ucd nH，，， -d e al rHH 9u pv nu F」

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36.21 58.]9

Acetaminophen disappcarance rate

[μg/l05yiable cell&'day] 50. 16 97.90

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A

40.41 58.96

Acetaminophcn sulfate appearance ratc [μgl1 05Yiable ccll&'day]

13.73 22.88

97

七七七七七七七七七七七七七七-=:_l

5.3.2.3 ì整流培養を利用した肝臓シミュレータの性能評価

Fig.5-3-6にアセトアミノフェンの濃度変化 Fig.5-3-5に木シミュレータによるリドカイン濃度変化を，

シミュレー 生体に投与される場合を考慮したものである。

モデル薬物の初期濃度は，

を示す。 ここで，

タ内に投与されたモデル薬物は， n寺問の経過に伴って減少した。 リドカインの代謝反応では， 構造変換 反応後3H寺問 目から構造変換産物であるアセトアミノフェンのグルクロン酸と硫酸抱合休の生成が見られた。

アセ トアミノフェンの千℃司tでは ， 産物として得られるMEGXは検出されなかった 。 また，

20

ドキュメント内 初代肝細胞の三次元培養法を利用した肝臓シュミ レータの開発 (ページ 48-52)