300 ... 500
250
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Homo‑clone
‑ ・ ‑ H e t e r o ‑ c l o n e
50
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Normal
之N
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50 150 250 350 450 550
Days a f t e r h a t c h i n g
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Homo‑clone H e t e r o ‑ c l o n e Normal‑2N
G
50 150 250 350 450 550
Days a
1まIe rh a t c h i n g
Fig. 11・7.Changes in theもodyweight紐dfork length of homo‑and hetero‑clones組dnonnal‑2N.
は各試験区間で、有意な差はなかった。夏季の高水温期を含む癖化後456‑‑548日目においては，
ヘテロクローンが有意に高く，次いでノーマル，ホモクローンのIJ震となった。
解化後50，100， 200， 365， 456および548
1 3
eJにおける各区の患文長および魚体重をT a b l e
II‑l1およびFig.II・7~こ示した。いずれのステージにおいてもホモクローンの尾文長および魚体 重は他区よりも存意に抵かったが，ヘテロクローンはノーマルよりも 200および365日目の魚体 重が有意に低かった以外にノーマノレとの関に有意差は認められなかった。II・2・3.考察
本研究は，染色体操作によってクローンマダイを作出した最初の報告であり，
m i t o t i c ‑ G 2 N
峰 雄から71，000尾のホモクローンおよび15，000尾のヘテロクローンの正常仔魚を生産した。ホモクローンの妊体形成率，解化率，正常鮮化率，解化後30日目までの生残率および成長は いずれも他区に比べ著しく低かった。この原因としては，ホモ接合型個体における近交弱勢効果 や 第 二 極 体 放 出 阻 止 の た め の 抵 温 処 理 の 物 理 的 影 響 が 考 え ら れ るo 完全ホモ接合型である
m i t o t i c ‑ G 2 N
親魚には 理論上劣性致死遺伝子は存在しないはずである。従って，低い生残率は 劣性致死遺伝子によるものではなく，遺伝的な要国としてそれ以外の弱有害遺伝子の関与が推察 される。今屈のホモクローン作出には低温処理を用いたが，低温処理は，星状体，紡錘体などの 核分裂装量の基本構造をなすチューブ、リンタンパク質を破壊し，その結果染色体の両極への移動 が阻害されて第二極体の放出が阻止される牧町ヘ低温処理が卵内のその他のタンパク質(酵素) にもダメージを与えることが予想され紛，これらの影響がホモクローンの鮮化率や生残率の低下 につながった可能性は十分に考えられる。ホモクローンの卵発生，解化および生残に及ぼす低温処理の影響は，ホモクローンを親魚まで養成して遺伝的に同一である次の2種類のホモクローン を作出し比較することにより明らかにできる。すなわち，ホモクローンを親魚まで育ててからさ らに低温処理により作出した2世代目のホモクローンと，そのホモクローンの卵と同じホモクロー ンの別個体をホノレモン処理により雄化して得た楕子とを媒精して作出した2世代臣のホモク百一 ンとの差異を比較することにより低温処理の影響が明らかとなる。また，本実験において，ホモ クローンの成長はノーマノレおよびヘテロクローンに比べ著しく劣っていた。このことは，ホモク ローンに固定された遺伝的な影響によるのかあるいは上記の弱有害遺伝子や経のダメージなどの 影響によるものかは本実験では明らかにできなかった。しかしながら，同じような結果がクロー ンヒラメ紛でも報告されており，ホモクローンの実用品種としての利用は難しく，ヘテロクロー ン作出のためのクローンの系統維持に活用されるべきものかもしれない。
一方，ヘテロクローンの座体形成率，解
f
ヒ率，正雪解化率，生残率および成長はノーマノレとiまぽ同等の値であった。このような結果は，とラメ 45，48)においても報告されているa ヘテロクロー ン集団はヘテロ接合性を保ちながら遺伝的には均一であるので，表現型分散の減少や発育安定性 の向上が期待されている45，4附
m
凶n凶it旬oti詑cc‑G2N雑親魚の
9
卵F
附カか瓦ら作出されたものであり， さらに 1@Jの韻育試験を行っただけである。クローンの成長は系統間で異なることが知られており 45，ぺ山本紛はクローンの作出における mitotic‑G2N親魚選抜の重要性を指捕している。従って，クローンを養殖用品種として実用化す るためには，より多くのmitotic‑G2N系統を作出して多くのクローン系統を確立し，それらのパ フォーマンスを評価する必要があるc 山本州事)が述べているように，震長形質が国定された異な る系統のホモクローン同士の交配により養殖用品種として最適なヘテロク Eーン集団が生産され るであろう。
mitotic‑G2Nから長質の配偶子を得ることは，クローン作出において不可欠である。ホモ接合 型のmitotIc‑G2Nコイの生殖腺発達において顕著な近交弱勢効果がみられているへまた，ニジ マスでは初めて産卵が行われる 2歳魚の段階で，産卵可能な錐の害
i
合が対照、の二倍体よりも mitotic‑G2Nにおいて低いことが報告されている訟。本研究では， 13患のmitotic‑G2N中1尾 からしか受精可能な卵が得られず，その他の個体からは精子や未成熟卵が得られた。また，精液は mitotic‑G2N 2尾 か ら 採 取 で き た が 尾 か ら の 精 子 は 受 精 能 力 が な か っ た 。 こ れ ら の こ と は マ ダイにおいても mitotIc‑G2Nの生殖腺の発達あるいは成熟に近交弱勢効果が現れていることを示 唆する口この点については，今後より多くのmitotic‑G2N群の個体を対象に生殖線発達，成熟，
性比などを調査し検討する必要があると考えられるc
II・3.DNAフィンガープリント法によるクローン性の証明朗
mitotic‑G2Nを親魚としてクローンを作出した場合には，次の2つの理由からクローン性を確 認する必要がある。まず mitotic‑G2Nの卵から第二極体放出阻止型雌性発生により作出したホ モクローンの場合には卵の付活化に用いた精子からのDNA断片の混入の可能性がある。次に，
mitotic‑G2Nが第一卵割の祖止には十分でない処理によって作出された場合には，ごく少数のヘ テロ接合型をもって自然発生した二倍体が混入し生き残る可能性がある30.49，89)。この自然発生二
一一205‑
信体は第一減数分裂あるいは第二減数分裂が何らかの理由で、行われなかったことにより生じ5
ヘ
m e i o t i c ‑ G 2 N
と同様に一部ヘテロ接合型を保持しているのでクローン作出のための親魚とはなら ない。以上のような理由から，クローンを作出した場合にはそのクローン性を確認する必要があ る。本研究では，I I
・2
で作出した魚のクローン性をマルチローカスDNA
フィンガープリント 法体鉛により確認した。11・3・1.材料および方法 (1)供試魚
供試魚としては，
I I
・2
で作出したホモクローン，ヘテロクローンおよびノーマルを各3 0
尾， 並びにクローン作出に用いたm i t o t i c ‑ G 2 N
雄親魚を用いた。(2)ゲノムDNAの抽出
各供試魚の脊椎下部尾大静脈より，ヘパリン処理を施した注射器で全車約 1mlを採血し，血 球を
3%NE
4mlで洗浄した後3000rpm
で2 0
分間遠心分離し，血球約400μI
を集めた。血球を 棒でかき混ぜながらTNE1
仇nlに懸濁し，10% SDS
2mlお よ び1 0mg /
ml Pro t e i n a s e K 120μI
を入れた遠沈管に加え，
58t
で3 0
分間インキュベートした後フェノーノレ処理を2
娩行ったC3000rpm
で3 0
分需遠心した後上澄みを回収し，‑70
oC 100%
エタノーノレを2
倍量注ぎ入れ70t
で1 5
分間静置して析出したDNA
をガラス棒で巻き取った。その後70%
冷エタノールで2
度 十 分 に 洗 浄 し ， 十 分 に 乾 燥 さ せ て か ら 5mlのT E ‑ B u f f e r
に 溶 解 し た 。 さ ら に 10mg/mlのRNase
を1/1000容加え3 7
0C
で1
時間インキュベートした後フェノール処理を3 0
分間行い，水 着を取り出してエタノール精製し，T E ‑ B u f f e r 3
ml，
こ溶解したcDNA
の定量および純度検定は，DNA
溶液を蒸留水で2 0
倍に希釈し，260nm
と280nm
の吸 光 度 ( 以 下OD
と略記〉を測定して行った。DNA5 0 μ
g/mlにおいてOD
却が1
となるのでOD260
よりDNA
の量を計算した。また，純度検定のためにO D 2 ω
IOD閣を求め， 1.7
以上のも ののみを用いた。(3)制譲酵素処理および電気泳動
ゲノム
DNA10μg
に 制 限 酵 素 Hinf1 1 0 0 U
(10 μ
l)および添付のB u f f e r10μI
を加え滅菌 水 で100μl
とし，3 7
0C
で2 4
時間インキュベートした。処理液に対しP C I
を等量加え撹祥後，1 2 0 0 0 r p m
で7
分間遠心し，水層を新しいマイクロチューブに移して再度同様の処理を行った。次いで、その上澄みに対し
3M
酢酸ナトリウム10μI
と100%
冷エタノーノレ250μf
を加え，氷中で1 0
分開放置後，4
'Cで2 0
分間1 2 0 0 0rpm
で遠心し，核酸をベレット化した。上澄みを取り除い た後 lmlの70%
冷エタノールで洗浄し，τn‑Bu
首位10μl
に溶解したものを試料としたelXTAE
に1 . 2
%の濃度でアガロースを溶解した27X15Xlcm
のゲ、ノレを作製し， ウェノレに試料10μI
と6X
ローディングBu
鈴r2μl
を混合したもの，およびマーカーとしてλDNA/ H i n d i l l d i
・g e s t
をそれぞれ注入し，1 XTAE
中，1 . 5 V / cm
で約7 0
時間電気泳動を行った。(4)サザンブ毘ツティング
泳動終のゲ、/レをバットに入れ，加水分解液
( 0 . 2 5 MHC
I)で、ゲソレ中の色素の色が変化してから10分間処理して DNAを小断片化した。ゲノレを蒸留水で、洗浄した後，変性器液 (O.5M NaOH， 1.5M NaCI)で30分間中和・変性して DNAを一本鎖化した。次に，大きめのトレイに Alkali Transfer Buffer (O.4M NaOH) を 満 た し 晩 サ ザ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 い メ ン プ ラ ン
(Amersh翻社製， Hy'るond ™ -N+) に DNA 断片を転写し， 2xSSCで1分間洗浄した後800
C
で2 時間国定した。( 5 )
ハイブリダイゼーションおよび剖A
フィンガープリント像の検出プロープにはCellmark社 の Non‑Isotopic Chemi1uminescent Enhanced (NICE TM) Probes Multi‑ locus DNA probes (33.15 and 33.6) kitを使用し，ハイブヲダイゼーションおよびDNAフィン ガープリント像の検出操作はそのマニュアルに従った。
(6)凶Aフィンガープリントの評僑
得られたDNAフィンガープリント像から遺伝的相同性を調べるために，集団内の語体罰およ び集団関でのバンドの共有度， band sharing indices (BSI)を算出したo 2個 体 (AB)関のBSI は， 2NAB / (NA + NB)で表され， NAおよびNBは個体AおよびBの全バンド数，NABは再個体の 共有するバンド数である。その値は共有ノミンドが存在しない場合には0となり，全てのバンドが 一致した場合，すなわちクローン個体関では 1となる。解析は4.4‑23.1孟bpの範囲内で認識可 能なすべてのバンドを対象として行い，異同度の判定には両端のDNAマーカー (λDNA/Hind III digest)のバンドを基準とした。
II・3・2.結果
ノーマノレ，へテヨクローン，ホモクローンおよびクローンの作出に用いたmitotic‑G2N雄親魚 の33.6プローブを用いた場合のDNAフィンガープリント像の一例をFig.II・8に，そのDNAフィ ンガープヲント橡のBSIによる評彊を TableII・12にそれぞれ示した。ノーマノレで、は調体罰のバ ンドパターンに変異がみられたが，ヘテロクローンおよびホモクローン内ではそれぞれ僧体関の バンドパターンに変異はみられず全ての個体のバンドパターンが同一で、あった。また，ホモクロー ンおよびクローン作出に用いたmitotic‑G2N雄親魚のパターンは全く同じであり，さらにホモク ローンにみられたすべてのバンドはヘテロクローンにおいても確認できた。 33.6プローブを用い た場合の4.4"'‑'23.1kbpの範囲内における各集団の識別可能なバンド数，および同系統内における BSIは，それぞれノーマル16"'‑'10および0.69::tO.06，ヘテロクローン24およびl.0，ホモクロー ン18および1.0となり，再クローン関，ヘテロクローンとノーマノレ罰およびホモクローンとノー マノレ間のBSIはそれぞれ0.88，0.51 :t0.09および0.52土0.08となった。
Table 11‑13には33.15プロープを用いた場合のDNAフィンガープリント像のBSIによる評値 を示した。 4.4'"'‑'23.1kbpの範囲内における各集団の識別可能なバンド数および同集団内における BSIは，それぞれノーマノレ， 31 ""'‑'22および0.69土0.10;ヘテロクローン， 34および1.0;ホモク ローン， 28および1.0となり，両クローン開，ヘテロクローンとノーマルとの開およびホモクロー ンとノーマルとの間のBSIはそれぞれ0.90，0.55 ::tO.l0および0.54::t0.11となったc
一一207‑