第 4 章 AGP の循環系に及ぼす生理作用
第２節 赤血球変形能及び膜安定性に対する影響
２-１ 赤血球のマイクロチャンネル通過に対する AGP の影響
Fig. 18 には 50％に調製した健常人の赤血球 100µL が幅 5µm の毛細血管モデルであ るマイクロチャンネルを通過するために要する時間を示し，Fig. 19 には通過後の赤血 球の溶血の度合いを示した．ヒト AGP は健常人の血中濃度である 23µM，炎症時の血 中濃度である 45µMにおいて，赤血球のマイクロチャンネル通過時間を有意に短縮した．
さらに，ヒトアシアロ AGP，イヌ及びウシ AGP も，ヒト AGP と同様な短縮効果を示 した．他の血漿蛋白質である HSA，γ-グロブリンも AGP より若干弱いけれどもマイ クロチャンネル通過を有意に促進した．しかしながら，シアル酸は赤血球通過にまった く影響を与えなかった．一方，マイクロチャンネル通過後の溶血に対して，ヒト，イヌ，
ウシ AGP，ヒトアシアロ AGP，HSA には同様な有意な抑制効果が認められたが，シア ル酸には認められなかった．これらのことから，AGP の糖鎖末端に存在するシアル酸 は，赤血球変形能に対して影響を及ぼさないことが示唆された．
Fig. 18 Effects of AGPs on the time required for 100 µL erythrocytes to pass through microchannels
A, without serum protein (control); B, 11 µM human AGP; C, 23 µM human AGP; D, 45 µM human AGP; E, 45 µM human asialo-AGP; F, 900 µM sialic acid; G, 45 µM dog AGP; H, 45 µM bovine AGP; I, 45 µM HSA; J, 45 µM γ-globulin. The data are average values of 3 - 4 experiments (±S. D.). * P < 0.05,
**P < 0.01 as compared with control (A).
C D E F G H
A B
Passage time of 100µL of erythrocytes through microchannels (sec / 100 µL)
I J
** **
0 10 20 30 40 50 60
** ** **
* *
Hemolysis (% of control)
D E F G H I
120 100 80 60 40 20 0
*
Fig. 19 Effects of AGPs on the hemolysis of erythrocytes during passage through microchannels
A, D, E, F, G, H and I are the same as shown in Fig. 18.
The data are average values of 3 - 4 experiments (±S. D.).
* P < 0.001 as compared with control (A).
* *
* *
A
２-２ 赤血球浸透圧脆弱性試験に対する AGP の影響
赤血球を低張の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH 7.4）に浮遊させると，赤血 球内は外部より高張であるので，水分は血球内に入り込み，結果として膨張し球状とな り，遂には膜が破れて溶血に至る．この原理を利用して赤血球膜の安定性を評価した86）． 50％に調製した赤血球は約 150mOsm 以下で有意な溶血が認められたが，今回は 74mOsm のときの溶血に対する AGP の影響を Table 8 に示した．ヒト，イヌ，ウシ AGP，ヒトアシアロ AGP，HSA は 74mOsm で溶血を抑制した．この場合，45µM の 各種蛋白質による浸透圧の変化は認められなかった．また，シアル酸は赤血球の溶血を まったく抑制しなかった．このことから，AGP には赤血球膜安定化作用があるが，こ の作用にシアル酸はまったく関係ないことが示唆された．
Table 8 Effects of AGPs on hemolysis at 74 mOsm
The data are average values of 3 - 4 experiments (± S. D.).
* P < 0.01 as compared with control.
45 µM human AGP
45 µM bovine AGP 45 µM dog AGP 900 µM sialic acid
45 µM human asialo-AGP
45 µM HSA
23 µM human AGP
Hemolysis (% of control) 84.4 ± 1.7 * 82.6 ± 2.9 * 82.3 ± 3.1 * 104.5 ± 4.3
84.0 ± 1.5 * 82.6 ± 2.5 * 82.8 ± 3.3 * without serum protein (control) 100.0
２-３ H2O2による赤血球酸化に対する AGP の影響
急性炎症時には，腫瘍壊死因子などのサイトカインによりもたらされる活性酸素など によって赤血球膜障害が起こり，異型化した赤血球がマクロファージによる貪食を受け たり，脾臓のフィルターにより変形能の低下した赤血球が検出され除去されたりする40）． また，第 3 章で，好中球の活性酸素種生成によるルミノール化学発光を AGP が抑制し，
AGP には抗酸化活性があることを示した．そこで実際に，AGP が活性酸素種添加によ る赤血球膜障害を抑制するかどうか検討した．25mM の H2O2を 50％に調製した赤血 球に添加すると，1 時間で膜障害による溶血が確認され，3 時間後まで増大した．Fig.
20 に H2O2添加 3 時間後の AGP による抑制効果を示す．ヒト，イヌ，ウシ AGP，ヒ トアシアロ AGPは有意に溶血を抑制し，HSAも AGP より弱いながら有意に抑制した．
次にジヒドロローダミン 123（DRD）がローダミン 123（RD）に酸化されると蛍光を
発する特徴を利用し87），25mM の H2O2による酸化を AGP が抑制するかどうか検討し た（Table 9）．ヒト AGP，ヒトアシアロ AGP は有意に抗酸化活性を示し，HSA も AGPほどではないが有意に抗酸化活性を示した．また，Fig. 20 及び Table 9において，
シアル酸はまったく酸化に影響を及ぼさないことが示された．これらのことから，AGP は膜表面を覆って，活性酸素種から赤血球を保護しているか，もしくは H2O2と結合し て抗酸化活性を発揮しているのかもしれない．
Fig. 20 Effects of AGPs on hemolysis of erythrocytes induced by H2O2 A, D, E, F, G, H and I are the same as shown in Fig. 18.
The data are average values of 3 - 4 experiments (±S. D.).
* P < 0.01, ** P < 0.001 as compared with control (A).
120 100 80 60 40 20 0
Hemolysis (% of control)
** ** **
D E F G H I
**
A
*
The data are average values of three experiments (± S. D.).
* P < 0.01, ** P < 0.001 as compared with control.
Table 9 Quenching of H2O2 oxidation of DRD by human AGP and HSA
Quenching (%)
45µM human AGP 96.6 ± 4.2 **
45µM HSA 70.2 ± 11.7 *
900 µM sialic acid 0.5 ± 5.3
45µM humn asialo-AGP 92.7 ± 3.8 **
0.0 without serum protein (control)
以前，AGP が赤血球膜表面に結合していることが報告されている44）．すなわち，
AGP は赤血球膜表面に結合することによって，毛細血管を通過するときは潤滑油の役 目をし，さらに膜を安定化させ，AGP 自ら酸化されることで外敵から赤血球を守って いる可能性が示唆された．また，これらの作用に対してシアル酸の影響はなく，糖鎖の ない HSA が AGP よりは弱いものの赤血球保護作用が認められたことから，AGP のペ プチド部分がこのような作用を示している可能性が推察される．