実験の部
溶解後温時ろ過し(Ａ液)、また、ＣｕS０４．５Ｈ208.659を蒸留水50ｍlに加温溶解し (Ｂ液)、Ａ液とＢ液をフラスコ中で冷却混和し、蒸留水で全量を500ｍlとした。
また、アルブミン標準液は牛血清アルブミン500ｍｇを蒸留水に溶解し、全量を100ｍｌ とした。
４ ） 糖 測 定 試 液
オ ル ト ア ミ ノ ビ フ ェ ニ ル ・ ホ ウ 酸 溶 液 は オ ル ト ア ミ ノ ビ フ ェ ニ ル ５ ９ を 氷 酢 酸 約 100ｍlに溶解後、飽和ホウ酸溶液20ｍlを加え、更に氷酢酸を加えて全量を250ｍlとした。
グルコース標準液は無水グルコース100ｍｇを蒸留水に溶解し、全量を100ｍlとした。
５）アミノ酸測定試液
0.5Ｍリン酸緩衝液は、Na2HP04.12Ｈ２０８９．５９を蒸留水500ｍlに溶解したＡ液と NaH2PO4・２Ｈ２０７．８９を蒸留水100ｍlに溶解したＢ液を混和して、ｐＨ7.4に調整した。
グリシン標準液(0.25“ｍCl/ｍｌ)は、グリシン187.7ｍｇを蒸留水100ｍlに溶解し、更 に蒸留水で１００倍希釈して調製した。
６）パラアミノ馬尿酸取り込み実験溶液
０．３ＭＮａＣｌ0.87ｍ１ ０．３ＭＫＣｌ0.36ｍ１ ０．０２ＭＣａＣｌ20.1ｍ１
０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.4)0.2ｍ1
0.001Ｍパラアミノ馬尿酸ナトリウム０．２，１
以上の溶液を混和し、蒸留水を加えてmediumの全量を2.7ｍlとした。
１５％トリクロル酢酸（TCA）溶液は、トリクロル酢酸159を蒸留水lOOmlに溶解した。
７）ホモジナイズ用緩衝液（0.05MTris-HCl,ｐＨ7.4,0.25Ｍショ糖含有）
Trishydroxymethylaminomethane3､039とショ糖42.799を蒸留水に溶解し、ＨＣｌ でｐＨ7.4に調整後、全量を500ｍlとした。
８）ケル漉過用緩衝液（0.03MTris-HCl,ｐＨ８．０，０.lMNaCl含有）
′mshydroxymethylaminomethane3､639とＮａCl5.849を蒸留水に溶解し、ＨClで ｐＨ8.0に調整後、全量をlOOOmlとした。
９）ホモジナイズ用緩衝液（0.1MTris-HCl,ｐＨ7.4,0.25Ｍショ糖含有）
Trishydroxymethylaminomethane6､069を蒸留水に溶解し、ＨClでｐＨ7.4に調整
後全量を500ｍlとし、この一部にショ糖42.799を溶解し、緩衝液で全量を100ｍlとし
－５９－
た。
１０）Ｃｄ－ＭＴ投与液
Ｃｄ－ＭＴは、Suzuki65)、Cherianら66)の方法に従って調製した。体重200～2309のラッ
トに、CdCl2（３ｍｇＣｄ/kg/ｍｌ）を毎日１回、計10回皮下投与した。１０回目の投与の
翌 日 ラ ッ ト を 断 頭 に よ り 殺 し 、 十 分 に 潟 血 し た 後 肝 臓 を 摘 出 し 、 ４ 倍 容 の 0 . 1 M Tris-HCl緩衝液(ｐＨ7.4,0.25Ｍショ糖含有)を加えてホモジナイズした。ホモジネート
は105,000×９，４℃で70分間遠心分離し、上清を70℃、５分間加熱処理して10,000×
gで10分間再度遠心分離した。この上清を、Tris-HCl緩衝液(0.03MTris-HCl，ｐＨ 8.0,0.1ＭＮａCl含有)で平衡化したSephadexG-75カラム(3.6×60ｃｍ)にかけ、
Tris-HC畷衝液を用いて流速30ｍl/hで溶出し、１０ｍlずつ分取した。各フラクションは
280nｍの吸光度とＣｄ濃度を測定した。そして、Ｃｄ－ＭＴのフラクションを合わせ、２ 日間低温室（３－５℃)で透析後、凍結乾燥した。これを用時蒸留水に溶解し、Ｃｄ－ＭＴ 溶液(200“ｇＣｄ/kg/0.5ｍl)を調製した。なお、このＣｄ－ＭＴのＣｄとＺｎの濃度比
(Cd/Zn)は、２９：１であった。
３．CdCl2投与実験
ラットにCdCl2溶液(1.5ｍｇＣｄ/kg/0.5ｍl)を26日間連日背部に皮下投与した後２群 に分け、１群(Ａ)にはＢＧＤ溶液(400“ｍCl/kg/0.5ｍl),他の群(Ｂ)には生理食塩水
0.5ｍlを26日間２日に１回腹腔内投与した。対照群として、生理食塩水を同一期間投与 した後２群に分け、同様にＢＧD(Ｃ)と生理食塩水(Ｄ)の投与を行った。なお、動物実験 の期間中は次の測定を行った。
ｌ）尿検査(蛋白質量，糖量，アミノ酸量及びAST活性)－４日に１回 ２）尿量及び尿中Ｃｄ量－４日に１回
３）腎皮質へのパラアミノ馬尿酸の取り込み－８日に１回 ４ ） 腎 組 織 標 本 の 観 察 一 実 験 終 了 時
５ ） 血 中 A S T 活 性 － ８ 日 に １ 回
６）組織中のＣｄ濃度一Ｃｄ投与終了時及び実験終了時 ７）肝臓、腎臓及び脳の必須金属濃度一実験終了時 ８ ） 体 重 の 変 化 － ２ 日 に １ 回
－６０－
４．Ｃｄ－ＭＴ投与実験
動物実験は、次の５群(１群４匹)に分けて行った。
（Ａ）生理食塩水投与群
（Ｂ）Ｃｄ－ＭＴ単独投与群
（Ｃ）Ｃｄ－ＭＴ＋ＢＧＤ(６時間後)投与群
（Ｄ）Cd-MT＋ＢＧＤ(12時間後)投与群
（Ｅ）Ｃｄ－ＭＴ＋ＢＧＤ(24時間後)投与群
なお、（Ｂ)～(Ｅ)群はＣｄ－ＭＴ(200〃ｇＣｄ/kg/0.5ｍl)を腹腔内に１回投与し、更に (Ｃ)～(Ｅ)群はBGＤ(40伽、Cl/kg/0.5ｍl)の腹腔内投与を各時間に開始し、その後３回、
合計４回BGDを投与した。
各群の投与スケジュールを示す。
( A ) S a I i n e ( C o n t r o l
）
▽ ▽ ▽ ▽
Ｄａｙ (B)Cd-MT＋saIine
▽ ▽ ▽ ▽
▲ １ ３ ５ ７ ９ １ １
Ｄａｙ (C)Cd-MT＋ＢＧＤ(6h）
６ｈ
↓ ↓ ↓ ↓
▲ １ ３ ５ ７ ９ １ １
Ｄａｙ
Ｕ
Ｕ
U
，
(D)Cd-MT＋ＢＧＤ(12h）
１２ｈ
↓↓↓↓
▲ １ ３ ５ ７ ９ １ １
Ｄａｙ (E)Cd-MT＋ＢＧＤ(24h）
２４ｈ
↓↓↓↓
▲ １ ３ ５ ７ ９ １ １
Ｄａｙ
▽；SaIine▲；Ｃｄ－ＭＴ
↓；ＢＧＤ
Ｕ ； S a c r i f i c e d
投 与 実 験 ス ケ ジ ュ ー ル
動物実験では、次の検査及び測定を行った。
１）尿検査（２日に１回）
２）腎組織の病理学的変化(実験終了時）
３）体重に対する腎重量の比率(実験終了時）
－６１－
Ｕ
Ｕ
ｊｊｊ４５６
５．尿中蛋白質量,糖量,アミノ酸量及びＡＳＴ活性の測定
尿を４日に１回採取(18時間）して、尿検査(蛋白質量,糖量,アミノ酸量及びＡＳＴ活 性)を行った。
１）蛋白質量の測定
Piscatorらの方法96)に従って測定した。尿１ｍlを同量の土屋試液と混合し、１５分後 2500rpmで15分間遠心分離して上清を除き、沈殿を95％エタノールで２回洗浄して
３％ＮａＯＨ溶液４ｍlに溶解する。１５分後、ベネジクト試液0.2ｍlを加えて混合し、
545nｍで吸光度を測定した。別に、アルブミン標準液を用いて検量線を作成した。
２）糖量の測定
測定は柴田らの方法97)に従って測定した。尿30皿をオルトアミノビフェニル．ホウ酸 溶液３ｍlに加え、沸騰水浴中で15分間加熱し、その後冷水中で５分間冷却して635nｍ で吸光度を測定した。別に、100ｍｇ/dlのグルコース標準液を用いて検量線を作成した。
３）アミノ酸の測定
測定は山本らの方法98》に従って行った。蒸留水でlOO倍に希釈した尿２ｍlに0.5Ｍリ
ン酸緩衝液(ｐＨ7.4）２ｍlと0.4％２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム 0.5ｍlを加え、よく混合して暗所に２時間放置した。その後、ｌ０ＮＨＣｌＯ､2ｍlを添加し 420nｍで吸光度を測定した。別に、グリシン標準液を用いて検量線を作成した．なお、アミノ酸量はグリシンのモル数で表示した。
４）ASrr活性の測定
測定は和光純社製ＡＳｒｒ測定用キットＳＴＡごTestWako(Reitman-Frankel法)を用い
て行った。基質溶液（２ｍＭａ－ケトグルタル酸,200ｍＭＬ－アスパラギン酸)0.5ｍlを 37℃で２～３分間加温し、それに尿を0.1ｍl加えて37℃で１時間反応させた。その後、
発色試液（１，Ｍ２，４－ジニトロフエニルヒドラジン)0.5ｍlを加えて室温に20分間放置 し、用時調製した0.4ＮＮａＯＨ溶液５ｍlを加えてよく混和し、505nｍで吸光度を測定し
た。別に、２，Ｍピルビン酸リチウム標準液を用いて検量線を作成した。なお、酵素単 位は国際単位(ＩＵ)で表示した。
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血中のＡＳＴ活性（Ｃｄ－ＭＴ投与後２日）
肝臓、腎臓中のＣｄ濃度(実験終了時）
体重増加（２日に１回）
６ ． 尿 量 及 び 尿 中 カ ド ミ ウ ム 量 の 測 定
尿を４日に１回採取(18時間）して尿量を測定すると共に、尿中のCd量を原子吸光フ レーム分光光度計で測定した。
７ ． 腎 皮 質 ス ラ イ ス へ の パ ラ ア ミ ノ 馬 尿 酸 取 り 込 み の 測 定 ｌ）実験操作
Crossらの方法99)に準じて行った。ラットを最初の投与から８日毎に断頭により殺し、
直ちに開腹して左右の腎臓を摘出し、氷冷した生理食塩水に浸した。この腎臓の皮質を 厚さ0.5～1.0ｍｍにスライスして、約140ｍｇ(４切片)をmedium5ml(パラアミノ馬尿
酸含有)を入れたフラスコに浸した。これを酸素(ＣＯ２５％含有)で飽和し、３７℃で60分 間インキュベーション（100cycles/ｍin)を行った。その後スライスは重量を量り、１５
％TCA1.8ｍlに蒸留水8.06ｍlを加えた溶液に入れてホモジナイズした。このホモジネー トは、2,000×ｇで10分間遠心分離した後、上清をろ過して漁液５ｍlを定量に用いた。
Mediumはろ過後２ｍlに蒸留水6.2ｍlと15％ＴＣＡ6.2ｍlを加え、スライスと同様にホ モジナイズした。これを遠心分離後ろ過してる液５ｍlを定量に用いた。
２）パラアミノ馬尿酸の定量
パラアミノ馬尿酸は、Brattonらの方法'00)に準じて定量した。上記の方法で得られた 浦液５ｍlにそれぞれ0.1QoNaN○20.5ｍlを加えて撹枠し、３分後に0.5％スルファミン酸
アンモニウム0.5ｍlを加え同様に撹枠した。２分後、0.1％Ｎ一（１－ナフチル)エチレ ンジアミンニ塩酸塩0.5ｍlを加えてよく撹枠し、545nｍで吸光度を測定した。なお、パ ラアミノ馬尿酸の腎皮質スライスへの取り込みは、本物質のmedium中のモル濃度(Ｍ）
に対する腎皮質スライス中のモル濃度(Ｓ)の比Ｓ／Ｍで表した。
８．腎組織標本の作成
ラットを断頭して殺し直ちに開腹した後、左右の腎臓を摘出して生理食塩水に浸し、
5～１０ｍｍにスライスした。これを10％ホルマリン水溶液に浸し一昼夜放置した。次に 半日ほど水洗した後、７０～100％まで濃度を変えたエタノールに浸し、シェーカーで振 とうして十分に脱水した。次にベンゼンで脱アルコールを行い、パラフィンで包埋した 後ミクトロームで薄切し、ヘマトキリシン、エオシンで染色した。
－６３－
９．血中酵素（ＡＳＴ）活性の測定
Ｃｄによる肝障害とそれに対するＢＧＤの効果を調べるために、予め血液凝固抑制の目 的でヘパリンを入れた注射筒を用いて、投与実験期間中８日に１回ラットの心臓から採 血し、尿中酵素と同様に血頻中のＡＳＴ活性を測定した。
１０．組織中のＣｄ濃度の測定
各組織(肝臓,腎臓,騨臓,牌臓,心臓,肺,塞丸及び脳)を硝酸一過塩素酸法で灰化し、
原子吸光分光光度計でＣｄ濃度を測定した。
１１．Ｃｄの細胞内分布
腎組織におけるＣｄの細胞内分布は、Cherianらの方法'０１)に従って測定した。投与実
験終了後ラットを断頭により殺し、直ちに開腹して摘出した腎臓を氷冷した生理食塩水 で洗浄し、そのｌｇを３倍量の0.05MTris-HCl緩衝液(ｐＨ7.4,0.25Ｍショ糖含有)で
ホモジナイズした。このホモジネートを遠心分離し、核(2,700×g)，ミトコンドリア
（7,500×g），リソソーム(12,600×gｳ，ミクロソーム(105,000×g)，細胞質画分に 分け、各画分中へのＣｄの分布を調べた。
１２．腎細胞質におけるＣｄの存在形
腎臓の細胞質画分１ｍlをSephadexG-75カラム(1.5×46ｃｍ)に添加し、室温で、
0.03MTris-HCl緩衝液(ｐＨ8.0,0.1ＭＮａCl含有)を用い、６ｍl/hの流速で溶出した。
溶出液は２ｍlずつ分取し、Ｃｄ濃度と280nｍの吸光度を測定した。Ｃｄが結合した成分 の分子量を調べるため、別に分子量既知の蛋白質であるチトクロームＣ（12,500),キモ
トリプシン(25,000),オバルプミン(45,000)を同一カラムに添加してゲルろ過を行い、
検量線を作成した。
１３．生体内必須金属の定量
実験終了後にラットを殺して摘出した肝臓,腎臓,脳を硝酸一過塩素酸法により灰化し、
Zn,Ｆｅ,Ｃｕ及びＭｎ濃度を測定した。これらの金属の測定は、水溶液の状態で原子吸 光光度法を用いて測定した。ただし、腎臓と脳のＭｎは、DDTC-MIBK法で摘出した後 測定した。
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